Name: Ex Vivo intestinale Sacs per valutare mucosa Permeabilità in modelli di malattia gastrointestinale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 4 s
Description: Impara a valutare la permeabilità mucosale usando sacchi intestinali ex vivo in modelli di malattia gastrointestinale. Questo metodo permette di studiare l'integrità della barriera epiteliale in specifiche aree del tratto intestinale.

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Questo lavoro è stato finanziato dal National Health and Medical Research Project Grant APP1021582 e da una sovvenzione dell'Hunter Medical Research Institute sponsorizzata da Sparke Helmore/NBN Triathlon e dall'Estate del compianto Leslie Kenneth McFarlane.

Tutti i lavori degli animali in questo protocollo viene eseguita con la stretta aderenza alle Università di Newcastle comitato etico degli animali procedure approvate. 1. Preparazione degli strumenti, Cultura Media e Piatti <ol><li> Pre-caldo media 199 (TC199) o Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) supporti a 37 ° C. Pre-ossigenare il supporto facendo gorgogliare con il 95% O 2/5% di CO 2. Verificare che il mezzo ha un pH finale di 7,3. </li><li> Preparare sutura tagliando due sezioni 5 cm per ogni uscita. Loop i punti di sutura in un nodo non chiusa. </li></ol> 2. dissezione e preparazione del tratto gastrointestinale <ol><li> Ritirare solido cibo 12 ore prima di eutanasia. Se lo si desidera, inserire gli animali sugli integratori gel nutrienti durante questo periodo. </li><li> Euthanize topi per overdose pentobarbitone sodio ([200 mg / Kg], iniezione intraperitoneale) seguita da dislocazione cervicale in conformità con l&#39;etica proto istituzionaleCols e spruzzare il 70% di etanolo sul addome e torace. </li><li> Usando una forbice, fare una incisione orizzontale nel mezzo dell&#39;addome ed esporre il peritoneo. </li><li> Procedere per separare e rimuovere il tratto gastrointestinale tagliando il piccolo intestino superiore dallo stomaco al sfintere piloro e taglio crasso al margine anale. Utilizzare una pinza per rimuovere delicatamente il mesentere. Posizionare il tratto intestinale in pre-riscaldato, medio ossigenato. </li><li> Identificare la sezione dell&#39;intestino da valutare per permeabilità (Figura 1) e tagliare questa sezione libera dal resto del tratto intestinale. <ol><li> Al fine di mantenere la coerenza tra animali, misurare le sezioni di duodeno e nel digiuno rispetto allo stomaco, e misurare le sezioni di colon e dell&#39;ileo rispetto al cieco. </li><li> Quando si seleziona segmenti di tessuto, notare la presenza di tessuti linfoidi mucosa-associati, come le placche di Peyer. Questi possono essere identificati come piccolo cenno del capoORME sul lato sierose del lume. </li><li> Usando una siringa da 1 ml, lavare delicatamente il contenuto luminale del segmento intestinale in una capsula di Petri con PBS preriscaldato (37 ° C). Questi contenuti fecali possono essere scartati o conservati a -80 ° C per le analisi future, se lo desideri. </li></ol></li></ol> 3. Preparazione intestinale Sacs <ol><li> Preparare una siringa da 1 ml con un volume di 300 microlitri del composto di prova o molecola. Per l&#39;integrità della mucosa, un 1 mg / ml soluzione di FITC-destrano M.Wt. 4.400 possono essere utilizzati. Le sonde che vanno da 4,400-70,000 Da dimensioni possono essere utilizzati per una maggiore sensibilità. Trovare e montare un piccolo catetere vascolare animali sulla siringa. </li><li> Misura 5 cm dall&#39;apertura del segmento intestinale e legare il segmento completamente chiuse con una sutura-loop a questo punto. Posizionare delicatamente una sutura-loop pre-legata intorno all&#39;apertura dell&#39;intestino e inserire il catetere smussata. Tirare il cappio chiuso in modo da assicurare il segmento intestinalee rilasciare il volume 300 microlitri dalla siringa nell&#39;intestino, assicurando che tutta la soluzione viene iniettata. </li><li> Rimuovere delicatamente il catetere e contemporaneamente tirare il cappio di sutura per fissare la chiusura del sacco intestinale. Tagliare il sacco intestinale sciolto dall&#39;intestino e posto in un tubo da 50 ml riempito con 20 ml di terreno ossigenato, preriscaldata a 37 ° C. </li></ol> 4. la misura della permeabilità <ol><li> Luogo provette coniche contenenti le sacche intestinali in un bagno d&#39;acqua riscaldata impostati su 37 ° C. A 0, 30, 60, 90 e 120 punti min tempo, prelevare un campione di 100 microlitri dalla provetta conica e trasferimento ad una piastra da 96 pozzetti, sostituendo il volume con 100 ml di mezzi freschi in ciascun caso. </li><li> Dopo aver prelevato il campione finale, tagliare sacche aperte al punto di sutura e la lunghezza del segmento, esponendo la superficie mucosa. </li><li> Misurare la lunghezza e la larghezza di ogni segmento intestinale. Se Desirosso, scatto congelare i segmenti e conservare a -80 ° C per le proteine ​​o l&#39;analisi biochimica, o, in alternativa, conservare in soluzione di stabilizzazione RNA per saggi molecolari. </li><li> Costruire una curva standard di diluizioni di registro per le molecole FITC-etichettati da 1 a 1 x 10 -6. </li><li> Misure di campioni e standard per FITC su un lettore di piastre a fluorescenza, FITC di eccitazione / emissione: 495 nm / 519 nm. </li></ol> 5. Calcolo di permeabilità apparente per ogni intestinale individuale Sac <ol><li> Convertire unità di tempo di sec. </li><li> Per ogni punto di tempo, calcolare la concentrazione cumulativa, Q Q t = (C t * V r) + (Q t somma * V s), dove: Q t = concentrazione cumulativa al tempo t C t = concentrazione al tempo t V r = Volume sul lato ricevente Q t somma = Somma di tutte le precedenti Q t V s =volume campionato </li><li> Trama Q in funzione del tempo (T) e calcolare la pendenza: AQ / DT </li><li> Calcolare la permeabilità apparente (P app) P app = (AQ / T) / (A * Co), dove: A = area di tessuto C 0 = concentrazione iniziale </li></ol>

<ol><li>Goggins, B. J., Chaney, C., Radford-Smith, G. L., Horvat, J. C., Keely, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+and+Integrin-Mediated+Epithelial+Restitution+during+Mucosal+Inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Hypoxia and Integrin-Mediated Epithelial Restitution during Mucosal Inflammation.</a> Frontiers in immunology. 4, 272(2013).</li>
<li>Otte, J. M., Kiehne, K., Herzig, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+peptides+in+innate+immunity+of+the+human+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial peptides in innate immunity of the human intestine.</a> Journal of gastroenterology. 38, 717-726 (2003).</li>
<li>Robinson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+protection+by+hypoxia-inducible+factor+prolyl+hydroxylase+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Mucosal protection by hypoxia-inducible factor prolyl hydroxylase inhibition.</a> Gastroenterology. 134, 145-155 (2008).</li>
<li>Feighery, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+intestinal+permeability+in+rats+subjected+to+traumatic+frontal+lobe+percussion+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+trauma%22%5BJournal%5D)">Increased intestinal permeability in rats subjected to traumatic frontal lobe percussion brain injury.</a> The Journal of trauma. 64, 131-137 (2008).</li>
<li>Keely, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloride-led+disruption+of+the+intestinal+mucous+layer+impedes+Salmonella+invasion%3A+evidence+for+an+%27enteric+tear%27+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+physiology+and+biochemistry+%3A+international+journal+of+experimental+cellular+physiology%2C+biochemistry%2C+and+pharmacology%22%5BJournal%5D)">Chloride-led disruption of the intestinal mucous layer impedes Salmonella invasion: evidence for an 'enteric tear' mechanism.</a> Cellular physiology and biochemistry : international journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology. 28, 743-752 (2011).</li>
<li>Keely, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+epithelial+innate+immunity+to+systemic+protection+afforded+by+prolyl+hydroxylase+inhibition+in+murine+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+immunology%22%5BJournal%5D)">Contribution of epithelial innate immunity to systemic protection afforded by prolyl hydroxylase inhibition in murine colitis.</a> Mucosal immunology. 7, 114-123 (2014).</li>
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<li>Barthe, L., Woodley, J. F., Kenworthy, S., Houin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+everted+gut+sac+as+a+simple+and+accurate+technique+to+measure+paracellular+transport+across+the+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+drug+metabolism+and+pharmacokinetics%22%5BJournal%5D)">An improved everted gut sac as a simple and accurate technique to measure paracellular transport across the small intestine.</a> European journal of drug metabolism and pharmacokinetics. 23, 313-323 (1998).</li>
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<li>Keely, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-inducible+factor-dependent+regulation+of+platelet-activating+factor+receptor+as+a+route+for+gram-positive+bacterial+translocation+across+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-inducible factor-dependent regulation of platelet-activating factor receptor as a route for gram-positive bacterial translocation across epithelia.</a> Mol Biol Cell. 21, 538-546 (2010).</li>
<li>Brayden, D. J., Bzik, V. A., Lewis, A. L., Illum, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CriticalSorb+promotes+permeation+of+flux+markers+across+isolated+rat+intestinal+mucosae+and+Caco-2+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+research%22%5BJournal%5D)">CriticalSorb promotes permeation of flux markers across isolated rat intestinal mucosae and Caco-2 monolayers.</a> Pharmaceutical research. 29, 2543-2554 (2012).</li>
<li>Hubbard, D., Ghandehari, H., Brayden, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transepithelial+transport+of+PAMAM+dendrimers+across+isolated+rat+jejunal+mucosae+in+ussing+chambers%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Transepithelial transport of PAMAM dendrimers across isolated rat jejunal mucosae in ussing chambers.</a> Biomacromolecules. 15, 2889-2895 (2014).</li>
<li>Keely, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+ex+vivo+intestinal+tissue+models+to+measure+mucoadhesion+of+poly+%28methacrylate%29+and+N-trimethylated+chitosan+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+research%22%5BJournal%5D)">In vitro and ex vivo intestinal tissue models to measure mucoadhesion of poly (methacrylate) and N-trimethylated chitosan polymers.</a> Pharmaceutical research. 22, 38-49 (2005).</li>
<li>Maher, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+intestinal+absorption+enhancement+and+local+mucosal+toxicity+of+two+promoters.+I.+Studies+in+isolated+rat+and+human+colonic+mucosae%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+pharmaceutical+sciences+%3A+official+journal+of+the+European+Federation+for+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Evaluation of intestinal absorption enhancement and local mucosal toxicity of two promoters. I. Studies in isolated rat and human colonic mucosae.</a> European journal of pharmaceutical sciences : official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 38, 291-300 (2009).</li>
<li>Balda, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+dissociation+of+paracellular+permeability+and+transepithelial+electrical+resistance+and+disruption+of+the+apical-basolateral+intramembrane+diffusion+barrier+by+expression+of+a+mutant+tight+junction+membrane+protein%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Functional dissociation of paracellular permeability and transepithelial electrical resistance and disruption of the apical-basolateral intramembrane diffusion barrier by expression of a mutant tight junction membrane protein.</a> The Journal of cell biology. 134, 1031-1049 (1996).</li>
<li>Behrens, I., Stenberg, P., Artursson, P., Kissel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+of+lipophilic+drug+molecules+in+a+new+mucus-secreting+cell+culture+model+based+on+HT29-MTX+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+research%22%5BJournal%5D)">Transport of lipophilic drug molecules in a new mucus-secreting cell culture model based on HT29-MTX cells.</a> Pharmaceutical research. 18, 1138-1145 (2001).</li>
<li>Stefka, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commensal+bacteria+protect+against+food+allergen+sensitization%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Commensal bacteria protect against food allergen sensitization.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 13145-13150 (2014).</li>
<li>Keely, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+fluid+transport+regulates+bacterial-epithelial+interactions+and+significantly+shifts+the+murine+colonic+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+microbes%22%5BJournal%5D)">Activated fluid transport regulates bacterial-epithelial interactions and significantly shifts the murine colonic microbiome.</a> Gut microbes. 3, 250-260 (2012).</li>
<li>Barrett, K. E., Keely, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloride+secretion+by+the+intestinal+epithelium%3A+molecular+basis+and+regulatory+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+physiology%22%5BJournal%5D)">Chloride secretion by the intestinal epithelium: molecular basis and regulatory aspects.</a> Annual review of physiology. 62, 535-572 (2000).</li>
<li>Soni, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat%2C+ovine+and+bovine+Peyer%27s+patches+mounted+in+horizontal+diffusion+chambers+display+sampling+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+controlled+release+%3A+official+journal+of+the+Controlled+Release+Society%22%5BJournal%5D)">Rat, ovine and bovine Peyer's patches mounted in horizontal diffusion chambers display sampling function.</a> Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 115, 68-77 (2006).</li>
<li>Justino, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+role+of+Lactobacillus+acidophilus+on+inflammation+and+gastric+dysmotility+in+intestinal+mucositis+induced+by+5-fluorouracil+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+chemotherapy+and+pharmacology%22%5BJournal%5D)">Regulatory role of Lactobacillus acidophilus on inflammation and gastric dysmotility in intestinal mucositis induced by 5-fluorouracil in mice.</a> Cancer chemotherapy and pharmacology. , (2015).</li>
<li>Tran, C. D., Sundar, S., Howarth, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+zinc+supplementation+and+methotrexate-induced+small+intestinal+mucositis+in+metallothionein-knockout+and+wild-type+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+biology+%26+therapy%22%5BJournal%5D)">Dietary zinc supplementation and methotrexate-induced small intestinal mucositis in metallothionein-knockout and wild-type mice.</a> Cancer biology & therapy. 8, 1662-1667 (2009).</li>
<li>Musch, M. W., Wang, Y., Claud, E. C., Chang, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lubiprostone+decreases+mouse+colonic+inner+mucus+layer+thickness+and+alters+intestinal+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Digestive+diseases+and+sciences%22%5BJournal%5D)">Lubiprostone decreases mouse colonic inner mucus layer thickness and alters intestinal microbiota.</a> Digestive diseases and sciences. 58, 668-677 (2013).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Qui, abbiamo descritto l&#39;isolamento e la preparazione di sacche intestinali per valutare la funzione barriera della mucosa ex vivo. preparazioni sac intestinali sono principalmente utilizzati nella ricerca farmaceutica, esaminando l&#39;assorbimento di farmaci candidati attraverso l&#39;intestino. Tuttavia, questo test è ugualmente adatta per lo studio della malattia intestinale. La permeabilità intestinale può variare notevolmente da regione a regione e la valutazione specifica del sito di permeabilità per...

La barriera epiteliale intestinale del tratto gastrointestinale è una superficie mucosa stimato a 400 m 2 nel umano adulto. Di conseguenza, si è costantemente esposto a sfidare da microbi, farmaci ingeriti, nutrienti e tossine batteriche. L&#39;host non solo deve distinguere tra batteri commensali tollerabili e potenziali patogeni, ma deve impedire queste specie e loro molecole secrete di attraversare la barriera epiteliale, mentre allo stesso tempo permette l&#39;assorbimento dei nutrienti. Pertanto, il ruolo dell&#39;epitelio intestinale è di agire come barriera selettiva al contenuto luminale 1. Questo risultato è ottenuto, in parte, dal sistema di difesa epiteliale innato alla mucosa, che agisce attraverso un sistema biologico reattivo costituito da costitutive e inducibili meccanismi 2. La perdita della funzione barriera epiteliale è una patologia che è caratteristica di un certo numero di malattie gastrointestinali. In vivoesame della funzione di barriera epiteliale può essere valutata attraverso sonda gastrica di una molecola tracciante e la successiva analisi del siero 3. Tuttavia, questa tecnica non offre alcuna indicazione sul sito di disfunzione barriera. In vitro e ex vivo valutazione della resistenza transepiteliale utilizzando sistemi Transwell 3 e ussing rispettivamente camere di 4,5, sono comunemente impiegati come indicatori surrogati di funzione di barriera epiteliale, ma manca la contribuendo malattia fisiologia dei modelli animali 6. In questo protocollo si descrive un modello di preparazione del tessuto ex vivo che permette una valutazione diretta e localizzata dell&#39;integrità intestinale e che può essere utilizzato per valutare la funzione barriera della mucosa a diversi livelli. È importante sottolineare che questa tecnica può essere applicata a modelli animali di malattia, o può essere farmacologicamente manipolato per permettere a fondo interrogatori di disfunzione barriera mucosa.

<table><tbody><tr><td>Dekantel&nbsp; Sutura in seta non assorbibile</td><td>Braintree Scientific</td><td>SUT-S 116</td><td></td></tr><tr><td>Media 199 (TC199)&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11043-023</td><td>Nessun rosso fenolo in quanto interferisce con la fluorescenza</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>21063-045</td><td>Nessun rosso fenolo in quanto interferisce con la fluorescenza</td></tr><tr><td>N-acetilcisteina</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>Utilizzare a 10 mM in terreni</td></tr><tr><td>Catetere vascolare per piccoli animali: Physiocath</td><td>Data Sciences International</td><td>277-1-002</td><td></td></tr><tr><td>FITC-Destrano 4.400 MW</td><td>Sigma Aldrich</td><td>FD-4</td><td></td></tr><tr><td>FITC-Destrano 20.000 MW</td><td>Sigma Aldrich</td><td>FD-20</td><td></td></tr><tr><td>FITC-Destrano 70.000 MW</td><td>Sigma Aldrich</td><td>FD-70</td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo intestinale sacs per valutare mucosa permeabilità in modelli di malattia gastrointestinale

Ex Vivo Intestinal Sacs to Assess Mucosal Permeability in Models of Gastrointestinal Disease

La barriera epiteliale è la prima difesa innata del tratto gastrointestinale e regola selettivamente trasporto dal lume ai compartimenti sottostanti, limitare il trasporto di molecole più piccole attraverso l&#39;epitelio e quasi completamente vieta epiteliale trasporto macromolecolare. Questa selettività è determinata dallo strato di gel mucoso, che limita il trasporto di molecole lipofile ed entrambi i recettori apicali e stretti complessi proteici giunzionali dell&#39;epitelio. Modelli in vitro su colture di cellule dell&#39;epitelio sono convenienti, ma come un modello, non hanno la complessità delle interazioni tra microbiota, muco-gel, epitelio e il sistema immunitario. D&#39;altra parte, la valutazione in vivo dell&#39;assorbimento intestinale o permeabilità può essere eseguita, ma questi test misurare il grado di assorbimento gastrointestinale, senza alcuna indicazione di specificità del sito. Ex vivo saggi permeabilità utilizzando &quot;sacche intestinali&quot;; sono un metodo rapido e sensibile per misurare sia l&#39;integrità intestinale globale o il trasporto comparativa di una molecola specifica, con l&#39;ulteriore vantaggio di specificità del sito intestinale. Qui si descrive la preparazione di sacche intestinali per gli studi di permeabilità e il calcolo della permeabilità apparente (P app) di una molecola attraverso la barriera intestinale. Questa tecnica può essere utilizzata come un metodo di valutazione assorbimento del farmaco, o per esaminare disfunzione barriera epiteliale regionale in modelli animali di malattia gastrointestinale.

Questo protocollo può essere utilizzato per esaminare i cambiamenti regionali in funzione di barriera intestinale in modelli animali di malattie gastrointestinali. Misurando il flusso di una sonda paracellular sulla superficie mucosa in diverse aree del tratto gastrointestinale 7, l&#39;integrità delle giunzioni strette epiteliali può essere valutata. Inoltre, variando la natura della sonda paracellular per dimensione (Figura 2) o idrofobicità (Figura ...

Questo protocollo descrive l'uso di preparati di tessuto intestinale asportati o "sacche intestinali" come modello ex vivo della funzione della barriera intestinale. Questo modello può essere utilizzato per valutare l'integrità sia della barriera epiteliale che dello strato di gel mucoso in specifici siti intestinali in modelli animali di malattia digestiva.

Ex Vivo intestinale Sacs per valutare mucosa Permeabilità in modelli di malattia gastrointestinale

The epithelial barrier is the first innate defense of the gastrointestinal tract and selectively regulates transport from the lumen to the underlying ...

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare l'integrità intestinale localizzata in modelli animali di malattie gastrointestinali. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali sulle malattie gastrointestinali, ad esempio se l'integrità della mucosa è compromessa o se vi è un aumento dell'assorbimento di una molecola specifica o di batteri durante la malattia. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente di valutare aree specifiche del tratto gastrointestinale. Per preparare il tratto gastrointestinale, iniziare spruzzando l'addome e il torace del topo con etanolo al 70 percento ed utilizzare le forbici per effettuare un'incisione orizzontale al centro dell'addome, esponendo così il peritoneo. Successivamente, recidere l'intestino tenue superiore dallo stomaco allo sfintere pilorico e il colon al margine anale. Quindi, utilizzare pinzette per rimuovere delicatamente il mesentere e posizionare il tratto intestinale in un mezzo preriscaldato e ossigenato. Identificare l'area da valutare per quanto riguarda la permeabilità, misurando le sezioni del duodeno e del digiuno rispetto allo stomaco e le sezioni del colon e dell'ileo rispetto al cieco, al fine di mantenere la coerenza tra gli animali sperimentali. Notare la presenza di tessuti linfoidi associati alla mucosa, come le placche di Peyer, riconoscibili come piccoli noduli sul lato sieroso della parete luminale. Quindi, tagliare la sezione selezionata e utilizzare una siringa da 1 ml per lavare delicatamente il contenuto luminale del segmento in una piastra di Petri contenente 37

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Piccole tecniche di imaging consentono di animali esami diagnostici seriali e interventi terapeutici in vivo. Recentemente, l'ambito di applicazione è notevolmente ampliato e comprende attualmente la valutazione dello sviluppo del tumore del colon, la guarigione delle ferite e il monitoraggio di infiammazione. Questo protocollo illustra le diverse potenziali applicazioni di endoscopia murino.

Murino Endoscopia per In Vivo Guarigione Imaging Multimodale di Cancerogenesi e valutazione della ferita intestinale e infiammazione

Gli attuali trattamenti di malattie infiammatorie croniche intestinali (IBD) hanno lo scopo di alleviare i sintomi della malattia, ma possono causare gravi effetti collaterali. Così, strategie alternative sono allo studio in modelli animali colite. Qui, viene spiegato come gli effetti benefici della dieta completa sui segni clinici IBD sono analizzati in un tale modello di colite.

Analizzando Effetti benefici dei supplementi nutrizionali sulle funzioni intestinali epiteliali barriera durante Experimental Colitis

Qui sono disponibili due metodi per determinare la funzione di barriera intestinale. Un contatore epiteliale (volt/ohm) è utilizzato per la misurazione della resistenza elettrica transepiteliale del epithelia coltivate direttamente in pozzi di coltura del tessuto. Nei topi, il metodo di alimentazione mediante sonda gastrica FITC-Destrano è utilizzato per determinare la permeabilità intestinale in vivo.

In Vitro e In Vivo approcci per determinare la permeabilità intestinale delle cellule epiteliali

Qui descriviamo una tecnica per quantificare l'integrità della barriera di piccoli organoidi intestinali. Il fatto che il metodo si basi su organoidi viventi consente l'indagine sequenziale di diverse sostanze o combinazioni di integrità della barriera in modo risolto nel tempo.

Indagare la rottura della barriera intestinale negli organiidi viventi

Sfruttando la microscopia intravitale, il metodo qui presentato consente la visualizzazione in tempo reale dello spargimento di cellule epiteliali intestinali negli animali viventi. Pertanto, la mucosa intestinale macchiata localmente (acriflavina e rodiamminaB-dextran) dei topi anestetizzati viene imageizzata fino alla risoluzione a singola cellula utilizzando la microscopia confocale.

Un approccio intravitale basato sulla microscopia per valutare la permeabilità intestinale e le prestazioni di spargimento di cellule epiteliali

La funzione di barriera epiteliale intestinale disregolata e le risposte immunitarie sono segni distintivi della malattia infiammatoria intestinale che rimangono scarsamente studiate a causa della mancanza di modelli fisiologici. Qui descriviamo un modello di loop intestinale del topo che impiega un segmento intestinale ben vascolarizzato ed esteriore per studiare la permeabilità della mucosa e il reclutamento di leucociti in vivo.

Valutazione funzionale della permeabilità intestinale e della migrazione transepiteliale neutrofila nei topi utilizzando un modello standardizzato di loop intestinale

Il presente protocollo delinea un metodo che utilizza il giallo lucifero in un modello enteroide apical-out per determinare la permeabilità intestinale. Questo metodo può essere utilizzato per determinare la permeabilità paracellulare negli enteroidi che modellano le malattie infiammatorie intestinali come l'enterocolite necrotizzante.

Determinazione della permeabilità intestinale utilizzando Lucifer Yellow in un modello enteroide apical-out

Qui descriviamo la costruzione di un sistema modello di linea cellulare intestinale tridimensionale (3D) di base e un protocollo di inclusione della paraffina per la valutazione microscopica ottica di equivalenti intestinali fissi. La colorazione di proteine selezionate consente l'analisi di più parametri visivi da un singolo esperimento per un potenziale utilizzo in studi preclinici di screening farmacologico.

Sistema modello intestinale tridimensionale (3D) di base con una componente immunitaria

Questo articolo descrive: (1) somministrazione orale tramite gavage di molecole di prova ai topi neonatali già a partire dal DOL 6; e (2) valutazione ex vivo della funzione della barriera epiteliale del colon nelle biopsie dai cuccioli DOL 10 allo svezzamento (DOL 20) valutando la permeabilità paracellulare e transcellulare con camere di Ussing.

Gavage orale nei cuccioli neonatali di topo e valutazione funzionale dell'integrità della barriera intestinale utilizzando camere di uso

Un<em&gt; In vivo</em&gt; Test per la verifica della nave Permeabilità Sangue

Impara a valutare la permeabilità mucosale usando sacchi intestinali ex vivo in modelli di malattia gastrointestinale. Questo metodo permette di studiare l'integrità della barriera epiteliale in specifiche aree del tratto intestinale.

Ex Vivo intestinale Sacs per valutare mucosa Permeabilità in modelli di malattia gastrointestinale

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