Generazione di aggregati di cellule staminali embrionali di topo che Mostra rottura di simmetria, Polarizzazione e Emergent Comportamento Collettivo
24 novembre 2015
Abbiamo sviluppato un protocollo per generare aggregati di cellule staminali embrionali di topo che mostrano auto-organizzazione, rottura di simmetria e allungamento paralleli allo sviluppo assiale. Questa tecnica consente lo studio dei processi di sviluppo assiale e la generazione di tipi cellulari altrimenti difficili da eseguire in coltura monostrato.
L'obiettivo generale di questo protocollo è produrre aggregati uniformi di cellule staminali embrionali di topo che subiscono auto-organizzazione ed allungamento assiale in coltura in sospensione. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia dello sviluppo, come il ruolo delle interazioni tra tessuti nella specificazione degli assi e nell'auto-organizzazione in processi come la gastrulazione. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente di studiare gli eventi dello sviluppo da una nuova prospettiva de-costruttiva al di fuori dell'embrione, prima dell'aggregazione.
Mantenere le cellule embrionali di topo o M MECs nel mezzo ES.Lift su fiaschi da coltura tissutale da 25 centimetri quadrati rivestiti con gelatina per la generazione di aggregati. Partire dal fiasco di coltura tissutale contenente cellule con una confluenza del 40-60%, aspirare il mezzo e risciacquare il fiasco due volte. Con PBS, aggiungere un millilitro di tripsina EDTA allo 0,25% e incubare a 37 gradi Celsius per circa cinque minuti per staccare le cellule dal fiasco.
Successivamente, aggiungere cinque millilitri di mezzo Es.Lift alla sospensione cellulare staccata e mescolare accuratamente. Trasferire le cellule in una provetta da centrifuga da 50 millilitri e prelevare un'aliquote di un millilitro per contare le cellule. Aggiungere cinque volte 10 alla quarta cellule a cinque millilitri di PBS caldo e centrifugare le cellule a 170 × g per cinque minuti.
Aspirare la soluzione senza disturbare il pellet. Quindi aggiungere delicatamente cinque millilitri di PBS e ripetere la centrifugazione. Aspirare il volume massimo possibile senza disturbare il pellet cellulare.
Per evitare il trascinamento di PBS, risospendere il pellet cellulare in un millilitro di mezzo N2B27 caldo, mescolando accuratamente con una pipetta P1000 per ottenere una sospensione cellulare omogenea.
Quindi diluirlo con ulteriori quattro millilitri di mezzo N2B27. Trasferire la sospensione cellulare in un serbatoio sterile utilizzando una pipetta multicanale. Mescolare accuratamente le cellule e trasferire 40 microlitri della sospensione cellulare dal serbatoio in ciascun pozzetto di una piastra ubo non trattata per coltura cellulare.
Piastra a 96 pozzetti. Viene utilizzata specificamente una piastra non adatta alla coltura di tessuti per minimizzare l'adesione delle cellule alla piastra. Incubare la piastra in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica per 48 ore, al fine di consentire l'aggregazione cellulare dopo 48 ore.
Rimuovere la piastra dall'incubatore ed esaminare le cellule al microscopio invertito confermando la presenza di aggregati. Aggiungere un volume di soluzione stock di CHI 9 9 0 2 1 a 10 millimolare al N due B 27 tiepido per ottenere una concentrazione finale di tre micromolare. Questo è un mezzo secondario per la stimolazione cellulare.
Utilizzando una pipetta multicanale, distribuire 150 microlitri di mezzo secondario in ogni pozzetto. Con forza sufficiente da staccare eventuali aggregati aderenti. Rimettere la piastra nell'incubatore per colture cellulari per 24 ore dopo l'incubazione.
Rimuovere con attenzione il mezzo senza aspirare l'aggregato cellulare. Aggiungere 150 microlitri di N due B 27 fresco in ogni pozzetto con forza sufficiente a staccare eventuali aggregati aderenti. Ripetere questa operazione ogni 24 ore per un'incubazione totale di circa cinque giorni.
Per preparare gli aggregati per la fissazione, aspirare delicatamente prima la soluzione di incubazione da ogni pozzetto mantenendo la pipetta a un angolo di 30 gradi. Per evitare di aspirare l'aggregato cellulare, aggiungere 150 microlitri di PBS a ciascun pozzetto. Attendere alcuni minuti affinché l'aggregato si depositi sul fondo, quindi aspirare il PBS.
Ripetere questa operazione di lavaggio altre due volte utilizzando forbici sterili. Tagliare la punta di una pipetta P 1000 a circa tre millimetri sopra l'estremità di erogazione. Utilizzando questa punta, aspirare e rilasciare un piccolo volume di liquido in una pozzetta.
Agitare l'aggregato e staccarlo dal fondo della pozzetta. Quindi aspirare l'aggregato nella punta e trasferirlo in una dissetta di vetro per la dissezione di Drosophila. Utilizzando lo stesso procedimento, raccogliere tutti gli aggregati che saranno sottoposti a identiche procedure di immunomarcatura in un'unica dissetta.
Posizionare la camera di dissezione sotto il microscopio e ruotarla delicatamente per spostare gli aggregati verso il centro. Quindi aspirare con attenzione il PPS dal bordo della camera, avendo cura di non rimuovere alcun aggregato.
Per fissare gli aggregati, aggiungere un millilitro di soluzione di formaldeide al 4% appena preparata e incubare le piastre in uno shaker orbitale per due ore a quattro gradi Celsius. Impostare una velocità bassa. Aspirare con attenzione la soluzione di formaldeide per evitare di aspirare gli aggregati, quindi aggiungere un millilitro di PBS al pozzetto.
Riportare la piastra nello shaker orbitale per 10 minuti. Rimuovere il PBS dal pozzetto e ripetere questo passaggio di lavaggio altre due volte. Successivamente, aggiungere un millilitro di soluzione P-B-S-F-T e posizionare la piastra sullo shaker orbitale per 10 minuti.
Aspirare la soluzione e ripetere il lavaggio altre due volte. Aggiungere un millilitro di P-B-S-F-T per pozzetto per bloccare gli aggregati da immunoreattività non specifica. Posizionare la piastra sullo shaker orbitale a bassa velocità per un'ora a quattro gradi Celsius.
Dopo l'incubazione, aspirare con attenzione la soluzione di blocco dalle pozzette e aggiungere 500 microlitri dell'anticorpo primario diluito in P-B-S-F-T. Sigillare la piastra con parafilm per prevenire l'evaporazione e incubare tutta la notte a quattro gradi Celsius su un agitatore orbitale a bassa velocità. Successivamente, sostituire la soluzione di anticorpo primario con P-B-S-F-T pre-raffreddato.
Lavare gli aggregati posizionando la piastra sullo shaker orbitale. Impostare una velocità bassa a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Ripetere il lavaggio un'altra volta.
Eseguire altri due cicli di lavaggio con P-B-S-F-T a quattro gradi Celsius a bassa velocità su agitatore orbitale. Come indicato nel protocollo testuale, rimuovere la soluzione di lavaggio e incubare con 500 microlitri di anticorpo secondario diluito in P-B-S-F-T. Aggiungere un microgrammo per millilitro di herst al fine di visualizzare i nuclei, quindi incubare tutta la notte a quattro gradi Celsius su rotore girevole, protetto dalla luce.
Eseguire un ulteriore ciclo di lavaggio con PBS FT a quattro gradi Celsius, protetto dalla luce in una scatola avvolta nella pellicola di alluminio. Eseguire lavaggi aggiuntivi con PBS contenente 0,2% di FBS e 0,2% di Triton X-100 o tampone PBT a temperatura ambiente. Dopo aver aspirato con attenzione la soluzione, incubare gli aggregati con un millilitro di glicerolo in rapporto uno a uno con PBT per 30 minuti al buio a temperatura ambiente.
Quindi incubarli con un millilitro di soluzione di glicerolo-PBT in rapporto da sette a tre per 30 minuti. Per preparare i campioni all'analisi con microscopio confocale, aspirare la soluzione di glicerolo-PBT e sostituirla con un millilitro di mezzo di montaggio. Quindi montare gli aggregati in gocce da 17 microlitri su un vetrino.
Utilizzando la punta di una pipetta, preparare un distanziatore piegando su se stessa una striscia di nastro adesivo doppio faccia quattro volte. Posizionare quindi un distanziatore su ciascun lato degli aggregati sul vetrino, capovolgere il coprioggetto, farlo scivolare sui distanziatori e successivamente acquisire le immagini degli aggregati mediante microscopia confocale. 48 ore dopo la semina, si formano aggregati di circa 150 micrometri di diametro che mostrano contorni regolari.
D'altra parte, una scarsa qualità del mezzo, un numero non ottimale di cellule seminate o un'adesione cellulare inadeguata potrebbero portare al mancato corretto aggregamento. 120 ore di trattamento continuativo con CHI 9 9 0 2 1, un inibitore della glicogeno sintasi chinasi tre, provocano un allungamento dell'aggregato sferico. Inoltre, dopo il trattamento si osserva una localizzazione distinta delle cellule positive per SOX GFP a un'estremità dell'aggregato; diversi trattamenti determinano diversi cambiamenti morfologici nella forma di un singolo aggregato e nel marcatore fluorescente.
La localizzazione all'interno dell'aggregato può essere monitorata nel tempo. Una volta acquisita padronanza della tecnica, il ricercatore sarà in grado di generare aggregati in circa 45 minuti, se eseguita correttamente. Una volta formati gli aggregati, altri metodi come la Q-R-T-P-C-R possono essere eseguiti al posto della colorazione immunoistochimica per analizzare i cambiamenti nell'espressione genica all'interno degli aggregati.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come formare aggregati da MEC, applicare stimoli specifici e preparare gli aggregati per l'analisi mediante immunomarcatura e microscopia confocale.
Panoramica
Questo protocollo descrive la generazione di aggregati da cellule staminali embrionali di topo, consentendo lo studio dell'auto-organizzazione e dell'allungamento assiale. Il metodo fornisce informazioni sulla biologia dello sviluppo facilitando l'esame delle interazioni tra tessuti e della specificazione dei tipi cellulari.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia dello sviluppo
- Ricerca sulle cellule staminali
- Ingegneria tissutale
Sfondo
- Le cellule staminali embrionali di topo possono auto-organizzarsi ed allungarsi in coltura in sospensione.
- Questa tecnica consente lo studio di processi complessi di sviluppo.
- Gli aggregati offrono una nuova prospettiva sullo sviluppo embrionale.
- Comprendere le interazioni tra i tessuti è fondamentale per la biologia dello sviluppo.
Scopo dello studio
- Produrre aggregati uniformi di cellule staminali embrionali murine.
- Studiare i processi di sviluppo assiale.
- Esplorare la generazione di tipi cellulari difficilmente ottenibili in colture a monolayer.
Metodi Utilizzati
- Coltivare cellule staminali embrionali di topo in mezzo ES.Lift.
- Utilizzare tripsina-EDTA per il distacco cellulare e l'aggregazione.
- Incubare gli aggregati in una piastra non trattata per coltura su tessuto.
- Eseguire l'immunomarcatura su aggregati fissati per l'analisi.
Risultati principali
- Formazione con successo di aggregati che mostrano auto-organizzazione.
- Osservazione dell'allungamento assiale negli aggregati.
- Conferma della presenza di aggregati mediante microscopia.
- Tecniche di immunomarcatura efficaci applicate agli aggregati.
Conclusioni
- Il protocollo consente lo studio della biologia dello sviluppo in un ambiente controllato.
- Gli aggregati rappresentano un modello prezioso per comprendere lo sviluppo embrionale.
- Questo metodo può portare a progressi nella ricerca sulle cellule staminali e nell'ingegneria tissutale.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo protocollo consente la formazione riproducibile di aggregati di cellule staminali embrionali murine che mostrano rottura della simmetria, polarizzazione e comportamento collettivo emergente in vitro. Fornisce un sistema controllato per lo studio dell'auto-organizzazione e dell'allungamento assiale, offrendo un valore predittivo per i processi di sviluppo precoce e una riduzione meccanicistica dei rischi nei sistemi modello basati su cellule staminali. L'approccio supporta la validazione degli obiettivi e lo screening fenotipico generando strutture rilevanti per le malattie che riproducono eventi simili alla gastrulazione senza segnali esterni di asimmetria.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche relative allo sviluppo assiale e alla specificazione dei foglietti germinativi attraverso la rottura della simmetria e l'espressione polarizzata dei geni, entrambe osservabili.
- Valore operativo: Supporta la validazione funzionale delle target generando aggregati capaci di rispondere a segnali sperimentali come l'attivazione della via Wnt/β-Catenina e l'inibizione della via BMP.
- Valore predittivo: Facilita il perfezionamento dei modelli preclinici producendo strutture che mostrano movimenti simili alla gastrulazione e marcatori dei foglietti germinativi, aumentando la fiducia nella modulazione delle vie dello sviluppo.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Fornisce un'analisi quantitativa attraverso modifiche misurabili nella morfologia, nell'espressione genica e nella lunghezza degli aggregati, consentendo l'analisi dose-risposta dei segnali di sviluppo.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione e riproducibilità del saggio mediante la formazione uniforme di aggregati in piastre a 96 pozzetti con fondo rotondo, in condizioni definite di coltura in sospensione.
- Scalabilità: Permette il riutilizzo della piattaforma e la predisposizione per schermate, consentendo l'aggregazione di piccoli numeri di mESC in un formato ad alta densità e bassa adesività, adatto alla manipolazione automatizzata dei liquidi.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Offre un sistema rilevante per lo studio di eventi precoci dello sviluppo, come l'organizzazione assiale e la specificazione del destino cellulare, collegando risultati ottenuti in vitro con l'embriogenesi in vivo.
- De-risking meccanicistico: Riduce l'ambiguità nei processi decisionali cellulari monitorando nel tempo il distacco di cellule positive per SOX-GFP localizzate e l'allungamento assiale, sostenendo decisioni di avanzamento con rischio calibrato.
- Allineamento dei biomarcatori: Permette l'analisi immunocitochimica di marcatori specifici all'interno di aggregati fissati, facilitando la scoperta di biomarcatori traslazionali per applicazioni in tossicità dello sviluppo o medicina rigenerativa.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dalla coltura iniziale di cellule staminali fino all'analisi fenotipica, sostenendo la verifica di ipotesi in biologia dello sviluppo e consentendo applicazioni successive nell'identificazione di composti promettenti e nella validazione preclinica.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi consentendo ai ricercatori di applicare stimoli e osservare l'auto-organizzazione, la rottura della simmetria e l'allungamento assiale in un sistema di sospensione controllato.
- Screening: Offre prontezza del saggio e output quantitativi mediante microscopia fluorescente a intervalli di tempo ripetuti o in un singolo punto temporale, permettendo il confronto di cambiamenti morfologici e molecolari indotti dal segnale.
- Analisi: Fornisce parametri misurabili, tra cui la lunghezza degli aggregati, i modelli di espressione genica e gli eventi di distacco cellulare, che aiutano i gruppi di lavoro a confrontare condizioni e valutare la traiettoria dello sviluppo.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica generando strutture che esprimono marcatori dei foglietti germinativi e morfologie organizzate rilevanti per l'embriogenesi precoce.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una capacità riutilizzabile per generare aggregati polarizzati in diverse condizioni sperimentali, riducendo la variabilità e supportando studi longitudinali sulla differenziazione delle cellule staminali.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella modellizzazione dei processi di sviluppo precoce catturando il comportamento collettivo emergente e la polarizzazione senza asimmetria esogena.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione e riproducibilità attraverso protocolli definiti di aggregazione in piastre non aderenti con fondo a U e flussi di lavoro standardizzati per stimolazione e fissazione.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione nei percorsi di differenziazione delle cellule staminali fornendo letture precoci della specificazione del destino assiale e riducendo la dipendenza dai limiti delle colture aderenti.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione ponderata rispetto al rischio delle strategie di differenziazione identificando condizioni che producono in modo affidabile aggregati allungati e organizzati con espressione dei marcatori spazialmente limitata.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella coltura di cellule staminali, nella tecnica asettica e nella microscopia a fluorescenza per la corretta generazione e analisi degli aggregati.
- Presuppone l'accesso a piastre a 96 pozzetti con fondo rotondo non trattate per la coltura dei tessuti, agitatori orbitali e sistemi di imaging confocale per ottenere risultati ottimali.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro riguardo alla densità di semina cellulare, alla qualità del mezzo e ai tempi di incubazione, per evitare il fallimento dell'aggregazione dovuto a una piastratura non ottimale o all'adesione indesiderata.
- Richiede considerazioni adattative qualora il protocollo venga esteso ad altri sistemi modello, poiché il comportamento degli aggregati può variare in base alle proprietà di pluripotenza e adesione specifiche della specie.
- Comprende limitazioni pratiche, come la sensibilità alla qualità del mezzo e al numero di cellule, che devono essere controllate per garantire una formazione uniforme degli aggregati e una polarizzazione riproducibile.
