Silenziamento genico con Morpholinos

Le tecniche di silenziamento genico sono comunemente utilizzate nel campo della biologia dello sviluppo. Gli approcci di knockdown basati su morfolino consentono abitualmente ai ricercatori di identificare e caratterizzare i geni coinvolti in importanti processi cellulari. I morfolini antisenso sono ora molto popolari in molti sistemi modello, tra cui topi, pulcini e pesci zebra, grazie alla loro elevata efficacia, alta specificità e basso costo.

Questo video fornirà una panoramica dei meccanismi del morfolino e delle strategie di microiniezione, dei controlli sperimentali chiave e di come i morfoli vengono utilizzati oggi nei laboratori per studiare lo sviluppo dei vertebrati.

I morfolinos sono stati inizialmente sviluppati come un modo per inibire la traduzione dei trascritti di RNA nelle cellule e negli organismi viventi. Generalmente, i morfolinos sono molecole sintetiche costituite da 25 oligonucleotidi collegati da una spina dorsale caricata in modo neutro.

Ma anche se i morfolinos possono assomigliare molto al DNA, contengono anelli di morfolina al posto dei gruppi di zucchero trovati nella spina dorsale dello zucchero fosfato. Questa semplice conversione aumenta la stabilità del morfolino nelle cellule e riduce i loro costi di produzione.

All'interno delle cellule, i morfolinos sono mirati all'RNA di interesse mediante accoppiamento di basi complementari. La posizione sull'RNA in cui il morfolino si ibrida determina il suo specifico meccanismo d'azione.

I morfolini che bloccano le giunzioni si legano a giunzioni specifiche e inibiscono la corretta elaborazione del trascritto, mentre i morfolini che bloccano la traduzione si legano all'interno della regione 5' non tradotta del gene vicino al sito di inizio della traduzione e impediscono l'assemblaggio dei ribosomi. Entrambi i tipi di morfolini riducono l'espressione di proteine bersaglio funzionali.

Quando si pianifica un esperimento utilizzando i morfolinos, ci sono alcune considerazioni importanti da tenere a mente. Morpholinos può essere utilizzato in diversi sistemi modello, quindi è importante selezionare un modello in grado di affrontare la questione biologica a portata di mano.

I morfolinos sono sintetizzati commercialmente e l'assistenza professionale alla progettazione è disponibile gratuitamente per i ricercatori, ma poiché sono specifici della sequenza, le informazioni genetiche per tutti gli specifici bersagli del morfolino dovrebbero essere repesse prima della progettazione.

Nel sistema modello del pesce zebra, ci sono spesso due copie di singoli geni trovati in altri vertebrati, a causa di un evento di duplicazione dell'intero genoma che si è verificato in un antenato evolutivo del pesce zebra. Pertanto, l'abbattimento di entrambi i geni del pesce zebra può essere necessario per modellare con successo le carenze proteiche nello sviluppo umano.

Progettare buoni controlli sperimentali è importante quanto progettare i morfolini mirati. Ogni dato morfolino può legarsi a sequenze specifiche su geni diversi. Si consiglia di utilizzare morfolini indipendenti e non sovrapposti complementari allo stesso gene, al fine di garantire che un cambiamento fenotipico osservato sia dovuto all'abbattimento del gene di interesse.

Ora che abbiamo affrontato il design sperimentale del morfolino, diamo un'occhiata a come i morfolinos vengono introdotti nel pesce zebra.

Qui, descriveremo la microiniezione di morfolino nel pesce zebra. Per ulteriori approfondimenti e istruzioni sui dettagli della microiniezione, fare riferimento al video di JoVE Science Education intitolato "Zebrafish Microinjection Techniques".

I morfolinos vengono tipicamente iniettati in embrioni di zebrafish tra lo stadio a una e quattro cellule, nel tuorlo o nel citoplasma cellulare. Le connessioni citoplasmatiche tra cellule embrionali consentono una rapida diffusione e la consegna onnipresente di morfolinos solubili in acqua in tutto l'organismo. I morfolinos sono stabili nelle cellule, poiché l'embrione di zebrafish viene allevato a 28,5 ° C.

Le concentrazioni e i volumi ottimali di iniezione devono essere testati empiricamente per ciascun morfolino. Tipicamente, la dose più bassa alla quale esiste un fenotipo affidabile definito in almeno il 50-75% degli embrioni iniettati viene utilizzata al fine di evitare la letalità embrionale o effetti indesiderati fuori bersaglio.

La maggior parte dei fenotipi di pesce zebra morfolino sono identificati nei primi tre giorni dopo la fecondazione e il silenziamento genico è generalmente efficace fino al quinto giorno. Nel caso dei morfolini che bloccano la giunzione, la RT-PCR può essere utilizzata per identificare quantità relative di trascrizioni native e alterate. Per i morfolinos che bloccano la traduzione, i livelli di knockdown genico possono essere valutati da Western blot.

Il rapido sviluppo esterno e la trasparenza degli embrioni di zebrafish consentono una facile osservazione di molti processi biologici precoci. I fenotipi di morfolino possono essere comunemente valutati analizzando la morfologia utilizzando la microscopia a campo luminoso o a fluorescenza, nonché valutando il comportamento.

Dopo che il fenotipo del morfolino è stato definito, il salvataggio dell'RNA può essere eseguito per dimostrare la specificità del bersaglio. Dopo l'abbattimento del morfolino dell'mRNA endogeno, viene iniettato mRNA sintetico, che codifica per la stessa proteina, ma non contiene la sequenza bersaglio del morfolino. Se questo RNA iniettato è in grado di ripristinare il fenotipo wild-type dell'organismo, allora possiamo concludere che il fenotipo del morfolino osservato è specificamente dovuto al gene bersaglio che viene abbattuto.

Ora che hai un'idea di cosa sono i morfolinos e di come possono essere eseguiti esperimenti di morfolino controllati, diamo un'occhiata a come i morfoli vengono applicati nei laboratori biologici oggi.

In biologia cellulare, i morfolinos sono usati per comprendere i primi processi di sviluppo. Il flusso di fluido generato dalle ciglia nella vescicola di Kupffer è un esempio, che controlla il pattern sinistra-destra nel pesce zebra. Il flusso del fluido scorre in senso antiorario negli embrioni iniettati per controllo, mentre il silenziamento di un gene che regola l'organizzazione delle cellule ciliate interrompe la velocità e la direzione del fluido.

I morfolinos sono anche molto adatti per modellare in modo rapido e affidabile le malattie genetiche umane. I fenotipi di perdita di funzione possono essere facilmente riprodotti manipolando l'espressione proteica, come si vede in un modello di zebrafish di displasia umana che mostra cisti renali, edema pericardico e una coda arricciata. Inoltre, le mutazioni patogenetiche possono essere rapidamente analizzate in vivo utilizzando mRNA wild-type o mutante per salvare i fenotipi della malattia morfolinica.

Poiché i morfolinos possono essere introdotti nelle cellule viventi in modi diversi, sono molto apprezzati nello studio della rigenerazione e dello sviluppo degli organi. La microiniezione seguita dalla stimolazione elettrica dei morfolinos in tessuti specifici ha permesso ai ricercatori di studiare la crescita delle pinne e la formazione della retina nel pesce zebra adulto.

Hai appena visto l'introduzione di JoVE al silenziamento genico con i morfolini. In questo video, abbiamo discusso la struttura e il meccanismo dei morfolini, le applicazioni comuni per l'uso e i modi importanti per valutare l'efficacia e gli effetti del silenziamento genico mirato. Poiché sono facili da progettare, altamente specifici ed economici, i morfolini rimarranno un attore significativo nel campo della genetica inversa, aiutando ad analizzare funzionalmente i geni coinvolti nella malattia e nello sviluppo. Grazie per l'attenzione!