Una rapida e quantitativa metodo fluorimetrico per lo screening di stupefacenti piccole molecole di proteine ​​Targeting

L'obiettivo generale di questo nuovo metodo di screening farmacologico basato su misurazioni fluorimetriche è determinare l'affinità di legame di piccole molecole farmacologiche verso una proteina bersaglio, formando nanoaggregati fluorescenti d'oro all'interno di un modello proteico caricato con il farmaco. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della scoperta di farmaci mirati alle proteine, ad esempio in che modo la forza di legame delle molecole farmacologiche possa influenzare la stabilità delle proteine, prevenendone lo svolgimento e portando così alla formazione di nanoaggregati d'oro fluorescenti con intensità diverse. Il principale vantaggio di questa tecnica è la possibilità di trasformare una proteina bersaglio in un biosensore fluorescente, consentendo uno screening rapido di farmaci a bassa massa molecolare senza la necessità di strumentazioni sofisticate o di laboriosi passaggi di marcatura.

La combinazione delle mie conoscenze e della scoperta della coautrice, secondo cui la proteina li caricata ha un effetto stabilizzante distinto sui nanoparticelle plasmoniche, ha ispirato l'idea per questo metodo. Iniziare questa procedura preparando i reagenti chimici per lo screening farmacologico come descritto nel protocollo testuale per preparare i nanoaggregati d'oro templati con albumina sierica umana o HSA, posizionando due vial di vetro, ciascuno contenente un’asta magnetica microscopica, su due agitatori magnetici separati e controllabili termicamente.

Impostare la temperatura di un agitatore magnetico a 60 gradi Celsius. Successivamente, aggiungere a ciascun vial 200 microlitri di soluzione di albumina sierica umana, 200 microlitri di acqua ultrapura e 200 microlitri di soluzione di cloruro d'oro sotto costante agitazione per consentire l'incapsulamento degli ioni d'oro all'interno del templato proteico; due minuti dopo, aggiungere 20 microlitri di soluzione di idrossido di sodio a ciascun vial al fine di attivare la capacità riducente dell'albumina sierica umana nella formazione di nanoaggregati d'oro. Iniziare a registrare il tempo di reazione a zero minuti ogni 20 minuti.

Prelevare 50 microlitri di ogni campione e trasferirli in una piastra nera da 384 pozzetti. Misurare lo spettro di emissione con un lettore di micropiastre. Arrestare l'agitatore magnetico dopo 100 minuti.

Raffreddare le provette di vetro sotto acqua corrente in un lavandino. Registrare gli spettri di emissione fotoluminescente in ogni momento per ogni campione al fine di acquisire la cinetica di formazione dei nanoaggregati d'oro in diverse condizioni di temperatura. Per preparare i nanoaggregati d'oro templati con albumina sierica bovina o BSA, posizionare una provetta di vetro contenente un agitatore magnetico microscopico sulla piastra di un agitatore magnetico.

Lasciare la temperatura a temperatura ambiente. Mescolare 200 microlitri di soluzione di BSA, 200 microlitri di urea e 200 microlitri di soluzione di cloruro d'oro nel vial di vetro sotto agitazione costante. Due minuti dopo, aggiungere 20 microlitri di soluzione di idrossido di sodio.

Per attivare la capacità riducente della BSA a formare nanoaggregati d'oro e iniziare a registrare il tempo di reazione come zero minuti. Misurare lo spettro di emissione fotoemissiva della miscela di reazione ogni ora. Posizionare cinque vial di vetro, ciascuno contenente un agitatore magnetico e pre-etichettati con un farmaco o HSA pura, su un agitatore magnetico multipunto con controllo della temperatura.

Aggiungere 200 microlitri di HSA in ogni provetta. Successivamente, aggiungere un microlitro di ciascuna soluzione di farmaco precedentemente preparata nelle quattro provette corrispondenti. Inoltre, aggiungere un microlitro di DMSO al controllo presente sullo stirr.

Impostare la velocità di rotazione a 360 giri al minuto e incubare per un'ora per consentire il legame del farmaco all'HSA; un'ora dopo, aggiungere a ciascun vial 200 microlitri di acqua milli Q e 200 microlitri di soluzione di cloruro d'oro sotto agitazione costante. Impostare la temperatura a 60 gradi Celsius sotto agitazione costante per 10 minuti. Dopo 10 minuti, aggiungere a ciascun vial 20 microlitri di idrossido di sodio 1,5 molare e iniziare a registrare il tempo di reazione a zero minuti.

Le soluzioni di reazione congiunte per la misurazione devono seguire la stessa sequenza di aggiunta dei farmaci e devono essere eseguite il più rapidamente possibile per minimizzare l'effetto del ritardo temporale. Aspirare rapidamente 50 microlitri di soluzione da ogni provetta. Trasferirli in una piastra nera da 384 pozzetti e misurare lo spettro di emissione. Registrare gli spettri di emissione di ogni campione ogni 10 minuti, raccogliendo almeno quattro spettri in quattro momenti diversi.

Ripetere questi passaggi più volte per ottenere risultati con una tendenza coerente. Riportare in un grafico gli spettri di emissione fotoindotta risolti nel tempo per ogni campione. Identificare l'intensità massima di tutti i campioni e riportarla in funzione del tempo per confrontare la cinetica di formazione degli aggregati nanostrutturali d'oro in diversi modelli proteici caricati con farmaco, al fine di misurare la costante di legame tra ciascun farmaco e l'HSA.

Sostituire le soluzioni del farmaco con soluzioni di ibuprofene a quattro concentrazioni diverse. Dieci minuti dopo, raffreddare le provette di vetro sotto acqua corrente nel lavandino. Prelevare 50 microlitri delle soluzioni sopra indicate da ciascuna provetta e trasferirli in una piastra nera da 384 pozzetti, quindi misurare lo spettro di emissione.

Ripetere questi passaggi altre due volte per ottenere altre due serie di risultati a diverse concentrazioni del farmaco prima di arrestare l'agitatore magnetico. Successivamente, tracciare gli spettri di emissione fotoluminescente e analizzare i risultati grezzi ottenuti in ciascun singolo lotto. Riportare gli spettri di emissione fotoluminescente di ogni campione su software come Origin Pro e determinare l'intensità del picco.

Calcolare e tracciare l'intensità di fluorescenza relativa in funzione della concentrazione del farmaco. Quindi calcolare la costante di legame adattando i dati a un modello di legame a singolo sito. Utilizzare l'equazione di Mics cementin per eseguire questa operazione in software come Origin Pro.

Selezionare dal menu l'analisi di adattamento della curva non lineare, quindi scegliere la funzione hail dalla categoria sigmoidale di crescita nella pagina di selezione delle funzioni nelle impostazioni. Fare clic su adatta per visualizzare. I risultati dell'adattamento mostrati qui sono risultati rappresentativi degli spettri di emissione fotoelettronica risolti nel tempo di nanoaggregati di oro prodotti in diverse condizioni di denaturazione proteica.

Si può osservare che i nanoaggregati d'oro si formano più rapidamente a temperature più elevate. Le condizioni denaturanti con urea possono inoltre facilitare la sintesi diretta di nanoaggregati d'oro utilizzando la proteina BSA come stampo. Vengono mostrati qui i risultati tipici di un rapido screening fluorimetrico di farmaci basato sull'intensità di fluorescenza dei nanoaggregati d'oro, utilizzando HSA caricata con farmaco come stampo.

Più alta è l'intensità fluorescente, più debole è l'affinità di legame di una molecola farmacologica all'HSA. Questi spettri mostrano l'effetto della concentrazione del farmaco sull'entità di formazione di nanoaggregati fluorescenti d'oro all'interno dell'HSA caricata con ibuprofene. Più alta è la concentrazione del farmaco, più basso è il segnale fluorescente dei nanoaggregati d'oro risultanti; qui viene mostrato un risultato rappresentativo della determinazione della costante di legame proteina-farmaco.

Viene calcolato adattando l'intensità di fluorescenza relativa dei nanoaggregati d'oro sintetizzati nel modello di HSA pre-caricato con il farmaco ibuprofene a diverse concentrazioni, utilizzando l'equazione MICUs cementin. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 30 minuti per lo screening multiplo di farmaci in parallelo, se eseguita correttamente. Dopo aver visto questo video, ora dovreste avere una buona comprensione di come sintetizzare nanoaggregati d'oro nel proteina caricata con farmaco e di come determinare l'affinità di legame dei farmaci a una proteina bersaglio, rilevabile tramite il segnale fluorescente emesso dai nanoaggregati d'oro risultanti.