Name: Una rapida e quantitativa metodo fluorimetrico per lo screening di stupefacenti piccole molecole di proteine Targeting (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Scopri un metodo fluorimetrico rapido per lo screening di farmaci che utilizza nanocluster d'oro fluorescenti sintetizzati in situ all'interno di template proteici caricati con farmaci.

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Y.N.T. ringrazia l'Agenzia per la Scienza, la Tecnologia e la Ricerca (A*STAR) di Singapore per il sostegno finanziario nell'ambito della sovvenzione JCO CDA 13302FG063.

Attenzione: consultare le schede di sicurezza (SDS) di tutte le sostanze chimiche coinvolte prima dell&#39;uso. L&#39;esperimento screening di stupefacenti prevede la sintesi e la manipolazione dei nanomateriali, che possono avere rischi aggiuntivi rispetto alla loro controparte massa. Si prega di verificare le misure di controllo necessarie per essere praticato tutto l&#39;esperimento, compreso l&#39;uso di controlli tecnici (cappa) e dispositivi di protezione individuale (DPI, ad esempio, i pantaloni di lunghezza di sicurezza, scarpe chiuse, guanti resistenti ai prodotti chimici, e occhiali di protezione). 1. Preparazione dei reagenti chimici per lo screening Drug <ol><li> Precursori per la sintesi Au NC <ol><li> Disciogliere 30 mg di soluzione di oro (III) cloruro (99,99% base oligometalli, 30 wt.% In HCl diluito) in 6,9 ml di acqua ultrapura per preparare 15 mM di oro (III) di cloruro. Attenzione: soluzione di cloruro d&#39;oro è corrosivo e irritante. Indossare corretto DPI per evitare il contatto diretto con gli occhi e la pelle. </li><li> Dissolve 74 mg di HSA o BSA in 1 ml di acqua ultrapura per preparare 74 mg / ml di proteine ​​soluzione madre. </li></ol></li><li> Soluzioni di droga <ol><li> Sciogliere la quantità desiderata di farmaco, per esempio, 1,9 mg per (a) ibuprofene, 2.8 mg di (b) warfarin, 2,3 mg di (c) fenitoina, e 1,5 mg per (d) sulfanilamide in 20 ml di DMSO per preparare 450 mM di soluzioni droga azionari. Nota: DMSO viene selezionato come solvente perché questi farmaci sono idrofobi e hanno scarsa solubilità in acqua. </li></ol></li><li> Altri reagenti <ol><li> Sciogliere 600 mg di pellet NaOH in 10 ml di acqua ultrapura per preparare 1,5 M di NaOH. Sciogliere 2.4 g di urea in 2 ml di acqua ultrapura per preparare 20 M di soluzione di urea. </li></ol></li></ol> 2. Sintesi di proteine ​​Templated Au NC <ol><li> HSA-su modelli Au NC (HSA-Au NC) <ol><li> Inserire due fiale di vetro, ognuno contenente un micro ancoretta magnetica in esso, su due separata della temperatura controllabile ancoretta magneticaRERS. </li><li> Impostare la temperatura di un agitatore magnetico a 60 ° C, ed etichetta la fiala di vetro su di essa come &quot;60 ° C&quot;; mentre l&#39;altro agitatore magnetico viene mantenuta a temperatura ambiente (RT) in cui il flacone di vetro su di esso è etichettato come &quot;RT&quot;. </li><li> Aggiungere 200 ml di soluzione di HSA, 200 ml di acqua ultrapura, e 200 ml di soluzione di oro (III) cloruro di ciascuna fiala sotto agitazione costante (impostata come 360 ​​rpm se non diversamente specificato) per consentire l&#39;incapsulamento di ioni Au all&#39;interno del modello della proteina. </li><li> 2 minuti più tardi, aggiungere 20 ml di soluzione di NaOH ad ogni flacone in modo da attivare la capacità di ridurre HSA nel formare Au NC e iniziare a registrare il tempo di reazione come 0 min. </li><li> Ogni 20 minuti, 50 ml di disegnare soluzioni da ciascuno del campione ad una piastra nera 384 pozzetti e misurare lo spettro di emissione con un lettore di micropiastre. La configurazione tipica di scansione: λ = 370 nm ex, λ em = 410-850 nm. </li><li> Arrestare il agitatore magnetico dopo 100 min. </li><li> Raffreddare i flaconi di vetro sotto l&#39;acqua corrente in un lavandino. Attenzione: le fiale di vetro sono caldi. Indossare guanti resistenti al calore per evitare di bruciare. </li><li> Tracciare gli spettri di fotoemissione a tutto il tempo per ciascun campione di acquisire la cinetica di formazione di Au NC a diverse condizioni di temperatura. </li></ol></li><li> BSA-su modelli Au NC (BSA-Au NC) <ol><li> Inserire una fiala di vetro contenente un micro ancoretta magnetica sulla sommità di un agitatore magnetico. Lasciare la temperatura come temperatura ambiente. </li><li> Miscelare 200 ml di soluzione di BSA, 200 ml di urea, e 200 ml di soluzione di oro (III) cloruro nel flaconcino di vetro sotto costante agitazione. </li><li> 2 minuti più tardi, aggiungere 20 ml di soluzione di NaOH per attivare la capacità riducente di BSA per formare Au NC e iniziare a registrare il tempo di reazione come 0 min. Misurare lo spettro di fotoemissione della miscela di reazione oraria. Nota: Lo spettro di fotoemissione di BSA-Au NC è misuratameno frequentemente perché il tasso di formazione BSA-Au NC è più lenta di quella di HSA-Au alla stessa temperatura a causa della minore efficacia di urea a svolgersi proteina. </li><li> Fermare l&#39;agitatore magnetico dopo 7 ore. Tracciare gli spettri di fotoemissione a tutti il ​​tempo di vedere la cinetica di formazione dei Au NC da urea denaturazione. </li></ol></li></ol> Screening 3. Piccolo Drug molecolare <ol><li> Schermata relativa affinità di legame di diversi farmaci piccola molecolari per HSA <ol><li> Posizionare cinque fiale di vetro, ciascuna contenente una ancoretta magnetica in esso, in cima ad una temperatura controllabile multipunto agitatore magnetico. Etichettare queste fiale come a, b, c, d, rispettivamente, per ciascun farmaco, vale a dire l&#39;ibuprofene, il warfarin, fenitoina, e sulfanilamide. Etichettare quello con HSA puro come controllo. </li><li> Aggiungere 200 ml di HSA ad ogni flacone. Aggiungere 1 ml di soluzione medicinale ai quattro fiale corrispondenti. Aggiungere 1 ml di DMSO al controllo. Accendere l&#39;agitatore e impostare la velocità di centrifuga a 360rpm e incubare per 1 ora per consentire il legame di HSA droga per completare. </li><li> 1 ora dopo, aggiungere 200 ml di acqua Milli-Q e 200 ml di soluzione di oro (III) cloruro di ciascuna fiala sotto costante agitazione. Impostare la temperatura a 60 ° C sotto costante agitazione per 10 min. Aggiungere 20 ml di NaOH 1,5 M a ciascuna fiala e iniziare a registrare il tempo di reazione come 0 min. </li><li> Disegnare rapidamente 50 ml di soluzione da ogni flaconcino a un piatto nero 384 pozzetti e misurare lo spettro di emissione (risultati etichettati come 0 min). Registra gli spettri di emissione di ciascun campione ogni 10 min. Raccogliere almeno quattro spettri a quattro tempi diversi, cioè 0, 10, 20 e 30 min. </li><li> Ripetere i punti 3.1.1 - 3.1.4 più volte per ottenere risultati con un trend costante. Arrestare il agitatore magnetico. </li><li> Tracciare la fotoemissione spettri risolta in tempo per ogni campione (a - d, e controllo). Identificare l&#39;intensità massima di tutti i campioni e complotto contro il tempo per confrontare la cinetica di formazione dei Au NC a dimodelli di proteina-droga caricata fferent. </li></ol></li><li> Misurare la costante di legame di un farmaco specifico per HSA <ol><li> Ripetere i punti 3.1.1 - 3.1.4. Sostituire la soluzione farmaco con soluzioni ibuprofene a quattro diverse concentrazioni (tra cui un campione di controllo utilizzando HSA solo senza droga carico). Etichettare il flacone di vetro secondo la concentrazione di farmaco corrispondentemente. </li><li> 10 minuti più tardi, raffreddare i flaconi di vetro sotto l&#39;acqua corrente in un lavandino. Attenzione: le fiale di vetro sono caldi. Indossare guanti resistenti al calore per evitare di bruciare. </li><li> Disegna 50 ml di soluzioni sopra di ogni fiala per un piatto nero 384 pozzetti e misurare lo spettro di emissione. </li><li> Ripetere i punti 3.2.1 - 3.2.3 altre due volte per ottenere altre due serie di risultati a diverse concentrazioni del farmaco. </li><li> Arrestare il agitatore magnetico. Tracciare gli spettri di fotoemissione e analizzare i risultati. <ol><li> Per i dati grezzi ottenuti in ciascun lotto, tracciare gli spettri di fotoemissione di ciascuncampione in software come software OriginPro e scoprire l&#39;intensità di picco. </li><li> Calcolare e tracciare l&#39;intensità di fluorescenza relativa [(I 0 - I) / I 0] contro la concentrazione del farmaco, dove io e mi riferisco a 0 l&#39;intensità di fluorescenza di ragazza NC formato in-droga caricato HSA e puro HSA, rispettivamente. </li><li> Calcolare la costante di legame inserendo i dati in un unico luogo di modello di legame utilizzando l&#39;equazione di Michaelis-Menten: Y = R max × C / (K D + C), dove R max indica il segnale di risposta massima, C è la concentrazione di ligando e K D è la costante di legame. Eseguire questo software come OriginPro. Selezionare il menu di analisi non lineare Montaggio Adattamento curva, quindi selezionare la funzione Hill Crescita / categoria sigmoidale. Nella Impostazioni: pagina di selezione funzione, fare clic su Adatta a mostrare i risultati a muro. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Flarakos, J., Morand, K. L., Vouros, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+Solution-Based+Medicinal+Library+Screening+against+Human+Serum+Albumin%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">High-Throughput Solution-Based Medicinal Library Screening against Human Serum Albumin.</a> Anal. Chem. 77, 1345-1353 (2005).</li>
<li>Vuignier, K., Veuthey, J. -L., Carrupt, P. -A., Schappler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Analytical+Strategy+to+Measure+Drug%E2%80%93Plasma+Protein+Interactions%3A+From+High-Throughput+to+In-Depth+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov.+Toda%22%5BJournal%5D)">Global Analytical Strategy to Measure Drug–Plasma Protein Interactions: From High-Throughput to In-Depth Analysis.</a> Drug Discov. Toda. 18, 1030-1034 (2013).</li>
<li>Zsila, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subdomain+Ib+Is+The+Third+Major+Drug+Binding+Region+of+Human+Serum+Albumin%3A+Toward+The+Three-Sites+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Subdomain Ib Is The Third Major Drug Binding Region of Human Serum Albumin: Toward The Three-Sites Model.</a> Mol. Pharm. 10, 1668-1682 (2013).</li>
<li>Dalvit, C., Fagerness, P. E., Hadden, D. T. A., Sarver, R. W., Stockman, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorine-NMR+Experiments+for+High-Throughput+Screening%3A+Theoretical+Aspects%2C+Practical+Considerations%2C+and+Range+of+Applicability%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Fluorine-NMR Experiments for High-Throughput Screening: Theoretical Aspects, Practical Considerations, and Range of Applicability.</a> J. Am. Chem. Soc. 125, 7696-7703 (2003).</li>
<li>Ghuman, J., Zunszain, P. A., Petitpas, I., Bhattacharya, A. A., Otagiri, M., Curry, S. Structural Basis of the Drug-binding Specificity of Human Serum. 353, 38-52 (2005).</li>
<li>Mao, H., Hajduk, P. J., Craig, R., Bell, R., Borre, T., Fesik, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+Design+of+Diflunisal+Analogues+with+Reduced+Affinity+for+Human+Serum+Albumin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Rational Design of Diflunisal Analogues with Reduced Affinity for Human Serum Albumin.</a> J. Am. Chem. Soc. 123, 10429-10435 (2001).</li>
<li>Dalvit, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+NMR-Based+Screening+with+Competition+Binding+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">High-Throughput NMR-Based Screening with Competition Binding Experiments.</a> J. Am. Chem. Soc. 124, 7702-7709 (2002).</li>
<li>Krenzel, E. S., Chen, Z., Hamilton, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correspondence+of+Fatty+Acid+and+Drug+Binding+Sites+on+Human+Serum+Albumin%3A+A+Two-Dimensional+Nuclear+Magnetic+Resonance+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistr%22%5BJournal%5D)">Correspondence of Fatty Acid and Drug Binding Sites on Human Serum Albumin: A Two-Dimensional Nuclear Magnetic Resonance Study.</a> Biochemistr. 52, 1559-1567 (2013).</li>
<li>Lee, Y., Zeng, H., Ruedisser, S., Gossert, A. D., Hilty, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+Magnetic+Resonance+of+Hyperpolarized+Fluorine+for+Characterization+of+Protein%E2%80%93Ligand+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Nuclear Magnetic Resonance of Hyperpolarized Fluorine for Characterization of Protein–Ligand Interactions.</a> J. Am. Chem. Soc. 134, 17448-17451 (2012).</li>
<li>Salvi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Boosting+the+Sensitivity+of+Ligand%E2%80%93Protein+Screening+by+NMR+of+Long-Lived+States%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Boosting the Sensitivity of Ligand–Protein Screening by NMR of Long-Lived States.</a> J. Am. Chem. Soc. 134, 11076-11079 (2012).</li>
<li>Zsila, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+Dichroism+Spectroscopic+Detection+of+Ligand+Binding+Induced+Subdomain+IB+Specific+Structural+Adjustment+of+Human+Serum+Albumin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem%22%5BJournal%5D)">Circular Dichroism Spectroscopic Detection of Ligand Binding Induced Subdomain IB Specific Structural Adjustment of Human Serum Albumin.</a> J. Phys. Chem. 117, 10798-10806 (2013).</li>
<li>Navratilova, I., Hopkins, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fragment+Screening+by+Surface+Plasmon+Resonance%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Med.+Chem.+Lett%22%5BJournal%5D)">Fragment Screening by Surface Plasmon Resonance.</a> ACS Med. Chem. Lett. 1, 44-48 (2010).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+Phase+SPR+Biosensor+for+Efficient+Targeted+Drug+Screening+with+High+Sensitivity+and+Stability%5BTitle%5D)+AND+%22Sensor.+Actuat.+B-Che%22%5BJournal%5D)">Investigation of Phase SPR Biosensor for Efficient Targeted Drug Screening with High Sensitivity and Stability.</a> Sensor. Actuat. B-Che. 209, 313-322 (2015).</li>
<li>Lu, Y., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-Nanometre+Sized+Metal+Clusters%3A+From+Synthetic+Challenges+to+The+Unique+Property+Discoveries%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Sub-Nanometre Sized Metal Clusters: From Synthetic Challenges to The Unique Property Discoveries.</a> Chem. Soc. Rev. 41, 3594-3623 (2012).</li>
<li>Yu, Y., Yao, Q., Luo, Z., Yuan, X., Lee, J. Y., Xie, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precursor+Engineering+and+Controlled+Conversion+for+The+Synthesis+of+Monodisperse+Thiolate-Protected+Metal+Nanoclusters%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscal%22%5BJournal%5D)">Precursor Engineering and Controlled Conversion for The Synthesis of Monodisperse Thiolate-Protected Metal Nanoclusters.</a> Nanoscal. 5, 4606-4620 (2013).</li>
<li>Jin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantum+Sized%2C+Thiolate-Protected+Gold+Nanoclusters%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscal%22%5BJournal%5D)">Quantum Sized, Thiolate-Protected Gold Nanoclusters.</a> Nanoscal. 2, 343-362 (2010).</li>
<li>Jiang, D. -e <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Expanding+Universe+of+Thiolated+Gold+Nanoclusters+and+Beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscal%22%5BJournal%5D)">The Expanding Universe of Thiolated Gold Nanoclusters and Beyond.</a> Nanoscal. 5, 7149-7160 (2013).</li>
<li>Aikens, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electronic+Structure+of+Ligand-Passivated+Gold+and+Silver+Nanoclusters%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+Lett%22%5BJournal%5D)">Electronic Structure of Ligand-Passivated Gold and Silver Nanoclusters.</a> J. Phys. Chem. Lett. 2, 99-104 (2010).</li>
<li>Gao, Y., Shao, N., Pei, Y., Chen, Z., Zeng, X. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalytic+Activities+of+Subnanometer+Gold+Clusters+%28Au16%E2%80%93Au18%2C+Au20%2C+and+Au27%E2%80%93Au35%29+for+CO+Oxidation.+ACS%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nan%22%5BJournal%5D)">Catalytic Activities of Subnanometer Gold Clusters (Au16–Au18, Au20, and Au27–Au35) for CO Oxidation. ACS.</a> ACS Nan. 5, 7818-7829 (2011).</li>
<li>Negishi, Y., Nobusada, K., Tsukuda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutathione-Protected+Gold+Clusters+Revisited%3A+Bridging+the+Gap+between+Gold%28I%29%E2%88%92Thiolate+Complexes+and+Thiolate-Protected+Gold+Nanocrystals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Glutathione-Protected Gold Clusters Revisited: Bridging the Gap between Gold(I)−Thiolate Complexes and Thiolate-Protected Gold Nanocrystals.</a> J. Am. Chem. Soc. 127, 5261-5270 (2005).</li>
<li>Zhu, M., Aikens, C. M., Hollander, F. J., Schatz, G. C., Jin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlating+the+Crystal+Structure+of+A+Thiol-Protected+Au25+Cluster+and+Optical+Properties%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Correlating the Crystal Structure of A Thiol-Protected Au25 Cluster and Optical Properties.</a> J. Am. Chem. Soc. 130, 5883-5885 (2008).</li>
<li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+Highly+Luminescent+Au22%28SG%2918+Nanocluster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Identification of a Highly Luminescent Au22(SG)18 Nanocluster.</a> J. Am. Chem. Soc. 136, 1246-1249 (2014).</li>
<li>Jiang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidation+at+the+Core%E2%80%93Ligand+Interface+of+Au+Lipoic+Acid+Nanoclusters+That+Enhances+the+Near-IR+Luminescence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem%22%5BJournal%5D)">Oxidation at the Core–Ligand Interface of Au Lipoic Acid Nanoclusters That Enhances the Near-IR Luminescence.</a> J. Phys. Chem. 118, 20680-20687 (2014).</li>
<li>Zhu, Y., Qian, H., Jin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Atomic-Level+Strategy+for+Unraveling+Gold+Nanocatalysis+from+the+Perspective+of+Aun%28SR%29m+Nanoclusters%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Eur.+J%22%5BJournal%5D)">An Atomic-Level Strategy for Unraveling Gold Nanocatalysis from the Perspective of Aun(SR)m Nanoclusters.</a> Chem. Eur. J. 16, 11455-11462 (2010).</li>
<li>Niesen, B., Rand, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thin+Film+Metal+Nanocluster+Light-Emitting+Devices%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Thin Film Metal Nanocluster Light-Emitting Devices.</a> Adv. Mater. 26, 1446-1449 (2014).</li>
<li>Shang, L., Dong, S. J., Nienhaus, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-Small+Fluorescent+Metal+Nanoclusters%3A+Synthesis+and+Biological+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Toda%22%5BJournal%5D)">Ultra-Small Fluorescent Metal Nanoclusters: Synthesis and Biological Applications.</a> Nano Toda. 6, 401-418 (2011).</li>
<li>Wu, X., He, X., Wang, K., Xie, C., Zhou, B., Qing, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasmall+Near-Infrared+Gold+Nanoclusters+for+Tumor+Fluorescence+Imaging+in+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscal%22%5BJournal%5D)">Ultrasmall Near-Infrared Gold Nanoclusters for Tumor Fluorescence Imaging in Vivo.</a> Nanoscal. 2, 2244-2249 (2010).</li>
<li>Archana, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular-Receptor-Specific%2C+Non-Toxic%2C+Near-Infrared-Emitting+Au+Cluster-Protein+Nanoconjugates+for+Targeted+Cancer+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnolog%22%5BJournal%5D)">Molecular-Receptor-Specific, Non-Toxic, Near-Infrared-Emitting Au Cluster-Protein Nanoconjugates for Targeted Cancer Imaging.</a> Nanotechnolog. 21, 055103(2010).</li>
<li>Yue, Y., Liu, T. Y., Li, H. W., Liu, Z. Y., Wu, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microwave-Assisted+Synthesis+of+BSA-Protected+Small+Gold+Nanoclusters+and+Their+Fluorescence-Enhanced+Sensing+of+Silver%28I%29+Ions%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscal%22%5BJournal%5D)">Microwave-Assisted Synthesis of BSA-Protected Small Gold Nanoclusters and Their Fluorescence-Enhanced Sensing of Silver(I) Ions.</a> Nanoscal. 4, 2251-2254 (2012).</li>
<li>Liu, Y., Ai, K., Cheng, X., Huo, L., Lu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold+Nanocluster+Based+Fluorescent+Sensors+for+Highly+Sensitive+and+Selective+Detection+of+Cyanide+in+Water%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Gold Nanocluster Based Fluorescent Sensors for Highly Sensitive and Selective Detection of Cyanide in Water.</a> 20, 951-1907 (2010).</li>
<li>Liu, J., Yu, M., Zhou, C., Yang, S., Ning, X., Zheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passive+Tumor+Targeting+of+Renal-Clearable+Luminescent+Gold+Nanoparticles%3A+Long+Tumor+Retention+and+Fast+Normal+Tissue+Clearance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Passive Tumor Targeting of Renal-Clearable Luminescent Gold Nanoparticles: Long Tumor Retention and Fast Normal Tissue Clearance.</a> J. Am. Chem. Soc. 135, 4978-4981 (2013).</li>
<li>Negishi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+Loading+of+Small+Aun+Clusters+%28n+%3D+10%E2%80%9339%29+onto+BaLa4Ti4O15+Photocatalysts%3A+Toward+an+Understanding+of+Size+Effect+of+Co-Catalyst+on+Water+Splitting+Photocatalytic+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+C%22%5BJournal%5D)">Controlled Loading of Small Aun Clusters (n = 10–39) onto BaLa4Ti4O15 Photocatalysts: Toward an Understanding of Size Effect of Co-Catalyst on Water Splitting Photocatalytic Activity.</a> J. Phys. Chem. C. , (2015).</li>
<li>Xie, J., Zheng, Y., Ying, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-Directed+Synthesis+of+Highly+Fluorescent+Gold+Nanoclusters%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Protein-Directed Synthesis of Highly Fluorescent Gold Nanoclusters.</a> J. Am. Chem. Soc. 131, 888-889 (2009).</li>
<li>Celej, M. S., Montich, G. G., Fidelio, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Stability+Induced+by+Ligand+Binding+Correlates+with+Changes+in+Protein+Flexibility%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Protein Stability Induced by Ligand Binding Correlates with Changes in Protein Flexibility.</a> Protein Sci. 12, 1496-1506 (2003).</li>
<li>Layton, C. J., Hellinga, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamic+Analysis+of+Ligand-Induced+Changes+in+Protein+Thermal+Unfolding+Applied+to+High-Throughput+Determination+of+Ligand+Affinities+with+Extrinsic+Fluorescent+Dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistr%22%5BJournal%5D)">Thermodynamic Analysis of Ligand-Induced Changes in Protein Thermal Unfolding Applied to High-Throughput Determination of Ligand Affinities with Extrinsic Fluorescent Dyes.</a> Biochemistr. 49, 10831-10841 (2010).</li>
<li>Yu, Y., New, S. Y., Xie, J., Su, X., Tan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-Based+Fluorescent+Metal+Nanoclusters+for+Small+Molecular+Drug+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Protein-Based Fluorescent Metal Nanoclusters for Small Molecular Drug Screening.</a> Chem. Commun. 50, 13805-13808 (2014).</li>
<li>Shortridge, M. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Nuclear+Magnetic+Resonance+Affinity+Screening+Methods+for+Functional+Annotation+of+Proteins+and+Drug+Discover%22">Nuclear Magnetic Resonance Affinity Screening Methods for Functional Annotation of Proteins and Drug Discover</a>. , The University of Nebraska - Lincoln. (2010).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ci sono diversi passaggi critici che devono essere evidenziate in questo metodo. Nel protocollo di screening della affinità di legame relativo dei diversi farmaci molecolari piccoli passi 3.1.2, 3.1.3, 3.1.4 e sono fondamentali per ottenere buoni risultati mostrano tendenza coerente per la forza vincolante relativa. In queste fasi, le azioni di aggiunta di sostanze chimiche e disegno di soluzioni di reazione per la misura dovrebbe essere il più rapidamente possibile per minimizzare l&#39;effetto ritardo e la stessa sequ...

Albumine siero come albumina sierica umana (HSA) e albumina di siero bovino (BSA) sono la proteina più abbondante nel plasma e svolgono un ruolo fondamentale nel mantenimento della pressione osmotica del comparto sangue. Sono inoltre riconosciuti come proteine ​​di trasporto per le piccole molecole di bassa solubilità in acqua, come gli steroidi, acidi grassi, ormoni tiroidei, e una vasta gamma di farmaci. L&#39;associazione di proprietà (ad esempio, siti di legame, affinità o la forza vincolante) di queste molecole di siero albumine costituisce un tema importante nella farmacocinetica. 1-4 diversi metodi analitici sono stati sviluppati per studiare le proprietà di legame dei farmaci diversi per siero albumine, come ad esempio cristallografia a raggi X, risonanza magnetica nucleare 5,6 (NMR), 7-11 e risonanza plasmonica superficiale (SPR), 12,13 etc. Tuttavia, questi metodi sono vincolate mediante un processo di analisi noioso e che richiede tempo (ad esempio, la crescita del monocristallo per X-ray Crystallostudio grafico), requisito di attrezzature specializzate e costose (SPR), o che necessitano di marcatura isotopica costosi (NMR) per la rilevazione. E &#39;quindi altamente auspicabile sviluppare modalità alternative per lo screening piccolo farmaco molecolare in un modo veloce, straight-forward, ed economicamente efficiente. Nanocluster oro (Au NC) sono un tipo speciale di nanomateriali, che contengono diverse decine di atomi di metallo con dimensioni inferiori a 2 nm. 14-17 hanno attirato ampi interessi di ricerca a causa della loro struttura elettronica discreta e dimensione-dipendente, 18, 19 e molecolare come assorbimenti ed emissioni. 20-23 Tali proprietà materiali unici, in particolare una forte fluorescenza, hanno trovato diverse applicazioni come il rilevamento e l&#39;imaging in sistemi biologici. 24-32 Ultrasmall fluorescente Au NC può essere sintetizzato utilizzando proteine ​​funzionali, quali albumine siero, come modello. 33 In una tipica sintesi delle proteine-su modelli di<html> Au NC, una certa quantità di sali Au vengono prima incapsulati all&#39;interno della proteina e successivamente ridotta di proteina stessa. La capacità riducente della proteina è attribuita a costituente residui amminoacidici funzionali (ad esempio, tirosina) che possono essere attivati ​​aumentando il pH della soluzione ad alcalino. Dispiegarsi della struttura delle proteine ​​è considerato come un passo fondamentale per la formazione di Au NC. Questo perché in una proteina unfolded, più gruppi funzionali riducenti possono essere esposti ai sali Au incapsulati. Protein dispiegarsi può essere ottenuto mediante trattamento termico o esposizione ad agenti denaturanti. Introduzione di piccoli farmaci molecolari può anche interessare il processo di svolgimento, cioè modificando la temperatura di denaturazione punto medio e l&#39;entalpia di svolgimento. 34,35 L&#39;effetto di tutti questi fattori, a sua volta può essere riflessa dalla cinetica di formazione dei fluorescenti Au NC e si manifesta in l&#39;intensità di fluorescenza di risultanti Au NC. 36 e_content &quot;&gt; Questo video illustra il metodo di selezione della droga sintetizzando Au NC in proteine ​​albumina droga caricata ad una temperatura superiore (60 ° C) o in presenza di agenti denaturanti (ad esempio, urea). L&#39;intensità di fluorescenza della risultante Au CN è la lettura del segnale. Innanzitutto, Au NC sono sintetizzati nei modelli HSA e BSA trattati a 60 ° C o in presenza di urea per mostrare come proteina dispiegarsi (indotta mediante trattamento termico o denaturanti) influenza la cinetica di formazione di Au NC. In secondo luogo, Au NC sono sintetizzati nei modelli di proteine ​​precaricato con diversi farmaci, e l&#39;effetto della droga carico sui intensità di fluorescenza relativi dei risultante Au NC è studiato, che forniscono la misura della forza vincolante relativa. Infine, il protocollo di screening Au NC-farmaco viene modificato per misurazione quantitativa di farmaco-proteina legante costante (K D) variando il contenuto di farmaco precaricato nella proteina di una concentrazione fissa.

<table><tbody><tr><td>Soluzione di cloruro d'oro (III), 30%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>484385</td><td>Corrosivo, irritante</td></tr><tr><td>Albumina sierica umana, 96%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A1887</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina, 96%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Ibuprofene, 98%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>I4883</td><td></td></tr><tr><td>warfarin, 98%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2250</td><td></td></tr><tr><td>fenitoina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1139</td><td></td></tr><tr><td>sulfanilamide, 99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9251</td><td></td></tr><tr><td>dimetil solfossido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>urea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5128</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>221465</tr><tr><td>Agitatore magnetico</td><td>IKA</td><td>RT5</td><td></td></tr><tr><td>Lettore di micropiastre</td><td>Tecan</td><td>Infinite M200</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 384 pozzetti</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetta a spostamento d'aria da 5 ml</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.000 &#956; l. pipetta a spostamento d'aria</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 &#956; l pipetta a spostamento d'aria</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5.000 &#956; l Punte</td><td></td><td></td><td></td>Eppendorf</tr><tr><td>1.000 &#956; l Punte</td><td></td><td></td><td></td>Eppendorf</tr><tr><td>100 &#956; l. Puntali</td><td></td><td></td><td></td>Eppendorf</tr> Micro <tr><td>provetta da 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiala in vetro da 20 ml con tappo</td><td></td><td></td><td></td>a vite</tr><tr><td>Fiala in vetro da 4 ml con tappo</td><td></td><td></td><td></td> a vite</tr></tbody></table>

una rapida e quantitativa metodo fluorimetrico per lo screening di stupefacenti piccole molecole di proteine ​​targeting

A Rapid and Quantitative Fluorimetric Method for Protein-Targeting Small Molecule Drug Screening

Si dimostra un nuovo metodo di screening di farmaci per determinare l&#39;affinità di legame di piccole molecole farmaceutiche per una proteina bersaglio formando nanocluster fluorescenti oro (Au NC) all&#39;interno della proteina-droga caricata, sulla base del segnale di fluorescenza emessa dal differenziale Au NC. Proteine ​​albumina come l&#39;albumina sierica umana (HSA) e albumina sierica bovina (BSA) sono selezionati come le proteine ​​modello. Quattro piccole farmaci molecolari (ad esempio, l&#39;ibuprofene, il warfarin, fenitoina, e sulfanilamide) di diverse affinità di legame alle proteine ​​albumina sono testati. Si è constatato che il tasso di formazione di fluorescenti Au CN all&#39;interno farmaco caricata albumina in condizioni denaturanti (cioè, 60 ° C o in presenza di urea) è più lenta di quella formata nella proteina intatta (senza farmaci). Inoltre, l&#39;intensità fluorescente del CN ​​come formata è risultato essere inversamente correlato alle affinità di legame di questi farmaci alle proteine ​​albumina. In particolare,maggiore è l&#39;affinità di legame farmaco-proteina, più lenta è la velocità di formazione Au NC, e quindi una minore intensità di fluorescenza della risultante Au NC viene osservata. L&#39;intensità di fluorescenza della risultante Au NC fornisce quindi una misura semplice della forza di legame relativa di diversi farmaci testati. Questo metodo è anche estensibile per misurare la costante legame specifico farmaco-proteina (K D) semplicemente variando il contenuto droga precaricato nella proteina ad una concentrazione proteica fissa. I risultati misurati corrispondono bene con i valori ottenuti con altri metodi di prestigio ma più complicati.

Protein dispiegarsi un importante metodo per la formazione di proteina-templated Au NC perché gruppi funzionali più reattivi (per esempio, residui di tirosina di una proteina) possono essere esposti per ridurre gli ioni Au incapsulati e accelerare il tasso di formazione di Au NC così. Agenti di riscaldamento e di denaturazione esterno sono due mezzi comuni per promuovere il processo di svolgimento delle proteine. La Figura 1 mostra l&#39;effetto di riscaldamento e l&#39;aggiunta di agenti di de...

Viene presentato un protocollo per lo screening di piccoli farmaci molecolari basato sulla sintesi in situ di nanocluster d'oro fluorescenti ultrapiccoli (Au NCs) utilizzando proteine caricate con farmaci come modello. Questo metodo è semplice per determinare l'affinità di legame dei farmaci a una proteina bersaglio mediante un segnale fluorescente visibile emesso dalle NC Au modellate con proteina.

Una rapida e quantitativa metodo fluorimetrico per lo screening di stupefacenti piccole molecole di proteine ​​Targeting

We demonstrate a new drug screening method for determining the binding affinity of small drug molecules to a target protein by forming fluorescent gold ...

L'obiettivo generale di questo nuovo metodo di screening farmacologico basato su misurazioni fluorimetriche è determinare l'affinità di legame di piccole molecole farmacologiche verso una proteina bersaglio, formando nanoaggregati fluorescenti d'oro all'interno di un modello proteico caricato con il farmaco. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della scoperta di farmaci mirati alle proteine, ad esempio in che modo la forza di legame delle molecole farmacologiche possa influenzare la stabilità delle proteine, prevenendone lo svolgimento e portando così alla formazione di nanoaggregati d'oro fluorescenti con intensità diverse. Il principale vantaggio di questa tecnica è la possibilità di trasformare una proteina bersaglio in un biosensore fluorescente, consentendo uno screening rapido di farmaci a bassa massa molecolare senza la necessità di strumentazioni sofisticate o di laboriosi passaggi di marcatura.La combinazione delle mie conoscenze e della scoperta della coautrice, secondo cui la proteina li caricata ha un effetto stabilizzante distinto sui nanoparticelle plasmoniche, ha ispirato l'idea per questo metodo. Iniziare questa procedura preparando i reagenti chimici per lo screening farmacologico come descritto nel protocollo testuale per preparare i nanoaggregati d'oro templati con albumina sierica umana o HSA, posizionando due vial di vetro, ciascuno contenente un’asta magnetica microscopica, su due agitatori magnetici separati e controllabili termicamente.Impostare la temperatura di un agitatore magnetico a 60 gradi Celsius. Successivamente, aggiungere a ciascun vial 200 microlitri di soluzione di albumina sierica umana, 200 microlitri di acqua ultrapura e 200 microlitri di soluzione di cloruro d'oro sotto costante agitazione per consentire l'incapsulamento degli ioni d'oro all'interno del templato proteico; due minuti dopo, aggiungere 20 microlitri di soluzione di idrossido di sodio a ciascun vial al fine di attivare la capacità riducente dell'albumina sierica umana nella formazione di nanoaggregati d'oro. Iniziare a registrare il tempo di reazione a zero minuti ogni 20 minuti.Prelevare 50 microlitri di ogni campione e trasferirli in una piastra nera da 384 pozzetti. Misurare lo spettro di emissione con un lettore di micropiastre. Arrestare l'agitatore magnetico dopo 100 minuti.Raffreddare le provette di vetro sotto acqua corrente in un lavandino. Registrare gli spettri di emissione fotoluminescente in ogni momento per ogni campione al fine di acquisire la cinetica di formazione dei nanoaggregati d'oro in diverse condizioni di temperatura. Per preparare i nanoaggregati d'oro templati con albumina sierica bovina o BSA, posizionare una provetta di vetro contenente un agitatore magnetico microscopico sulla piastra di un agitatore magnetico.Lasciare la temperatura a temperatura ambiente. Mescolare 200 microlitri di soluzione di BSA, 200 microlitri di urea e 200 microlitri di soluzione di cloruro d'oro nel vial di vetro sotto agitazione costante. Due minuti dopo, aggiungere 20 microlitri di soluzione di idrossido di sodio.Per attivare la capacità riducente della BSA a formare nanoaggregati d'oro e iniziare a registrare il tempo di reazione come zero minuti. Misurare lo spettro di emissione fotoemissiva della miscela di reazione ogni ora. Posizionare cinque vial di vetro, ciascuno contenente un agitatore magnetico e pre-etichettati con un farmaco o HSA pura, su un agitatore magnetico multipunto con controllo della temperatura.Aggiungere 200 microlitri di HSA in ogni provetta. Successivamente, aggiungere un microlitro di ciascuna soluzione di farmaco precedentemente preparata nelle quattro provette corrispondenti. Inoltre, aggiungere un microlitro di DMSO al controllo presente sullo stirr.Impostare la velocità di rotazione a 360 giri al minuto e incubare per un'ora per consentire il legame del farmaco all'HSA; un'ora dopo, aggiungere a ciascun vial 200 microlitri di acqua milli Q e 200 microlitri di soluzione di cloruro d'oro sotto agitazione costante. Impostare la temperatura a 60 gradi Celsius sotto agitazione costante per 10 minuti. Dopo 10 minuti, aggiungere a ciascun vial 20 microlitri di idrossido di sodio 1,5 molare e iniziare a registrare il tempo di reazione a zero minuti.Le soluzioni di reazione congiunte per la misurazione devono seguire la stessa sequenza di aggiunta dei farmaci e devono essere eseguite il più rapidamente possibile per minimizzare l'effetto del ritardo temporale. Aspirare rapidamente 50 microlitri di soluzione da ogni provetta. Trasferirli in una piastra nera da 384 pozzetti e misurare lo spettro di emissione. Registrare gli spettri di emissione di ogni campione ogni 10 minuti, raccogliendo almeno quattro spettri in quattro momenti diversi.Ripetere questi passaggi più volte per ottenere risultati con una tendenza coerente. Riportare in un grafico gli spettri di emissione fotoindotta risolti nel tempo per ogni campione. Identificare l'intensità massima di tutti i campioni e riportarla in funzione del tempo per confrontare la cinetica di formazione degli aggregati nanostrutturali d'oro in diversi modelli proteici caricati con farmaco, al fine di misurare la costante di legame tra ciascun farmaco e l'HSA.Sostituire le soluzioni del farmaco con soluzioni di ibuprofene a quattro concentrazioni diverse. Dieci minuti dopo, raffreddare le provette di vetro sotto acqua corrente nel lavandino. Prelevare 50 microlitri delle soluzioni sopra indicate da ciascuna provetta e trasferirli in una piastra nera da 384 pozzetti, quindi misurare lo spettro di emissione.Ripetere questi passaggi altre due volte per ottenere altre due serie di risultati a diverse concentrazioni del farmaco prima di arrestare l'agitatore magnetico. Successivamente, tracciare gli spettri di emissione fotoluminescente e analizzare i risultati grezzi ottenuti in ciascun singolo lotto. Riportare gli spettri di emissione fotoluminescente di ogni campione su software come Origin Pro e determinare l'intensità del picco.Calcolare e tracciare l'intensità di fluorescenza relativa in funzione della concentrazione del farmaco. Quindi calcolare la costante di legame adattando i dati a un modello di legame a singolo sito. Utilizzare l'equazione di Mics cementin per eseguire questa operazione in software come Origin Pro.Selezionare dal menu l'analisi di adattamento della curva non lineare, quindi scegliere la funzione hail dalla categoria sigmoidale di crescita nella pagina di selezione delle funzioni nelle impostazioni. Fare clic su adatta per visualizzare. I risultati dell'adattamento mostrati qui sono risultati rappresentativi degli spettri di emissione fotoelettronica risolti nel tempo di nanoaggregati di oro prodotti in diverse condizioni di denaturazione proteica.Si può osservare che i nanoaggregati d'oro si formano più rapidamente a temperature più elevate. Le condizioni denaturanti con urea possono inoltre facilitare la sintesi diretta di nanoaggregati d'oro utilizzando la proteina BSA come stampo. Vengono mostrati qui i risultati tipici di un rapido screening fluorimetrico di farmaci basato sull'intensità di fluorescenza dei nanoaggregati d'oro, utilizzando HSA caricata con farmaco come stampo.Più alta è l'intensità fluorescente, più debole è l'affinità di legame di una molecola farmacologica all'HSA. Questi spettri mostrano l'effetto della concentrazione del farmaco sull'entità di formazione di nanoaggregati fluorescenti d'oro all'interno dell'HSA caricata con ibuprofene. Più alta è la concentrazione del farmaco, più basso è il segnale fluorescente dei nanoaggregati d'oro risultanti; qui viene mostrato un risultato rappresentativo della determinazione della costante di legame proteina-farmaco.Viene calcolato adattando l'intensità di fluorescenza relativa dei nanoaggregati d'oro sintetizzati nel modello di HSA pre-caricato con il farmaco ibuprofene a diverse concentrazioni, utilizzando l'equazione MICUs cementin. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 30 minuti per lo screening multiplo di farmaci in parallelo, se eseguita correttamente. Dopo aver visto questo video, ora dovreste avere una buona comprensione di come sintetizzare nanoaggregati d'oro nel proteina caricata con farmaco e di come determinare l'affinità di legame dei farmaci a una proteina bersaglio, rilevabile tramite il segnale fluorescente emesso dai nanoaggregati d'oro risultanti.

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In questo video, descriviamo la tecnica dell'anisotropia a fluorescenza per studiare le interazioni tra la proteina della sindrome di Shwachman-diamond (SBDS) marcata con fluorofori e la 1 GTPasi simile al fattore di allungamento (EFL1). All'incubazione di proteine SBDS con concentrazioni gradualmente crescenti di EFL1, si osserva un costante aumento dell'anisotropia, indicando una riuscita interazione tra le due proteine.

Rilevamento basato sull'anisotropia della fluorescenza delle interazioni proteina-proteina

Thermophoresis microscala (MST) può essere ampiamente usato per la determinazione di affinità di legame senza purificazione della proteina bersaglio da lisati cellulari. Il protocollo prevede sovraespressione della proteina GFP-fusa, lisi cellulare in condizioni non denaturanti, e la rilevazione di segnale MST in presenza di concentrazioni variabili di ligando.

Protein Purification-libera Metodo di Binding Affinity Determinazione Thermophoresis microscala

La fluorimetria differenziale a scansione è un metodo ampiamente utilizzato per lo screening di librerie di piccole molecole per interazioni con le proteine. Qui, presentiamo un metodo semplice per estendere queste analisi per fornire una stima della costante di dissociazione tra una piccola molecola e il suo partner proteico.

Determinazione delle interazioni proteina-ligando Utilizzo scansione differenziale Fluorimetria

Presentiamo in questo studio un test basato sulla fluorescenza romanzo utilizzando linfociti derivati ​​da un topo transgenico. Questo test è adatto per high-throughput screening (HTS) di piccole molecole dotate di capacità di una inibizione o la promozione di attivazione dei linfociti.

Una fluorescenza a base di linfociti Assay Adatto per high-throughput screening di piccole molecole

In questo studio, abbiamo migliorato le capacità di analisi dei dati dell'esperimento DARTS monitorando i cambiamenti nella stabilità delle proteine e stimando l'affinità delle interazioni proteina-ligando. Le interazioni possono essere tracciate in due curve: una curva proteolitica e una curva di dipendenza da dose. Abbiamo usato l'interazione mTOR-rapamycin come caso esemplare.

Un saggio di assenza di stasse reattiva (DARTS) di affinità dei farmaci semi-quantitativa per studiare l'interazione tra Rapamicina e mTOR

Questo studio mirava a presentare una strategia per identificare le interazioni farmaco-peptidico. La strategia prevede la biopanning di peptidi corti che riconoscono farmaci basati su un biosensore QCM (Quartz-Crystal Microbalance), seguito da un'analisi bioinformatica per valutare quantitativamente le informazioni ottenute per il riconoscimento del farmaco e l'annotazione dei siti di legame farmacologico sulle proteine.

Strategia di biopanning e analisi bioinformatica ad alta produttività basata su biosensore per la convalida globale delle interazioni farmaco-proteina

Il monitoraggio delle variazioni della temperatura di fusione di una proteinabersaglio (ad es.saggio di spostamento termico, TSA) è un metodo efficiente per lo screening di librerie di frammenti di poche centinaia di composti. Presentiamo un protocollo TSA che implementa la fluorimetria a scansione nano-differenziale assistita da robotica (nano-DSF) per il monitoraggio della fluorescenza intrinseca del triptofano e la retrodepersione della luce per lo screening dei frammenti.

Fluorimetria a scansione nano-differenziale per lo screening nella scoperta di piombo basata su frammenti

Il presente protocollo descrive una procedura per eseguire la cromatografia fluorescente ad esclusione dimensionale (FSEC) su proteine di membrana per valutarne la qualità per l'analisi funzionale e strutturale a valle. Vengono presentati i risultati rappresentativi FSEC raccolti per diversi recettori accoppiati a proteine G (GPCR) in condizioni solubilizzate con detergente e senza detergenti.

Valutazione rapida della qualità delle proteine di membrana mediante cromatografia fluorescente di esclusione dimensionale

L'esperimento qui utilizzato mostra un metodo di docking molecolare combinato con il saggio di spostamento termico cellulare per prevedere e convalidare l'interazione tra piccole molecole e bersagli proteici.

Previsione e validazione del bersaglio proteico di un composto a piccola molecola

Il saggio di tethering irreversibile quantitativo (qIT) è un metodo basato sulla fluorescenza per identificare frammenti covalenti che interagiscono selettivamente con una proteina bersaglio. Qui, viene delineato un protocollo dettagliato per descrivere il test qIT, con risultati di esempio inclusi.

Screening di frammenti covalenti mediante il saggio di tethering quantitativo irreversibile

Questo protocollo introduce una metodologia di screening fluorometrica ottimizzata per identificare inibitori naturali di prodotti e piccole molecole nella sintesi proteica. La sua praticità lo rende adatto sia all'istruzione triennale sulle tecniche di scoperta di farmaci sia all'applicazione in campagne di chimica medicinale.

Un protocollo basato sulla fluorescenza per lo screening preliminare degli inibitori della sintesi proteica da fonti naturali

Scopri un metodo fluorimetrico rapido per lo screening di farmaci che utilizza nanocluster d'oro fluorescenti sintetizzati in situ all'interno di template proteici caricati con farmaci.

Una rapida e quantitativa metodo fluorimetrico per lo screening di stupefacenti piccole molecole di proteine ​​Targeting

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