Una rapida e quantitativa metodo fluorimetrico per lo screening di stupefacenti piccole molecole di proteine ​​Targeting

L'obiettivo generale di questo nuovo metodo di screening farmacologico fluorometrico è determinare l'affinità di legame di piccole molecole di farmaco a una proteina bersaglio formando nano cluster d'oro fluorescenti all'interno del modello proteico caricato con farmaco. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle scoperte farmacologiche mirate alle proteine, come ad esempio il modo in cui la forza di vidding delle molecole di farmaco può influenzare la stabilità delle proteine dal dispiegamento, portando alla formazione di nano cluster d'oro fluorescenti di diverse intensità. Il vantaggio principale di questo tenix è che possiamo trasformare un bersaglio proteico in un biosensore fluorescente per consentire lo screening rapido di piccoli farmaci molecolari senza la necessità di strumenti sofisticati e noiose fasi di etichettatura.

La combinazione delle mie conoscenze e della co-autrice, ha scoperto che la proteina è stata caricata, ha un effetto di stabilizzazione distinto sulla plasmonica. La nanoparticella ha ispirato l'idea di questo metodo. Iniziare questa procedura con la preparazione dei reagenti chimici per lo screening dei farmaci come dettagliato nel protocollo di testo per preparare l'albumina sierica umana o i nano cluster d'oro con modello HSA, posizionare due fiale di vetro contenenti ciascuna una barra di agitazione micromagnetica su due agitatori magnetici separati a temperatura controllabile.

Imposta la temperatura di un'agitazione magnetica a 60 gradi Celsius. Successivamente, aggiungere 200 microlitri di soluzione di albumina sierica umana, 200 microlitri di acqua ultrapura e 200 microlitri di soluzione di cloruro d'oro a ciascuna fiala sotto costante agitazione per consentire l'incapsulamento degli ioni d'oro all'interno del modello proteico, due minuti dopo, aggiungere 20 microlitri di soluzione di idrossido di sodio a ciascuna fiala in modo da attivare la capacità riducente dell'albumina sierica umana che informa i nano cluster d'oro. Inizia a registrare il tempo di reazione a zero minuti ogni 20 minuti.

Prelevare 50 microlitri di ciascun campione e trasferirli su una piastra nera a 384 pozzetti. Misurare lo spettro di emissione con un lettore di micropiastre. Interrompere l'agitazione magnetica dopo 100 minuti.

Raffreddare le fiale di vetro sotto l'acqua corrente in un lavandino. Traccia gli spettri di emissione fotografica in ogni momento per ogni campione per acquisire la cinetica di formazione dei nano cluster d'oro a diverse condizioni di temperatura. Per preparare l'albumina di siero bovino o i nano cluster d'oro con modello BSA, posizionare una fiala di vetro contenente una barra di agitazione micromagnetica sulla parte superiore di un'agitazione magnetica.

Lasciare la temperatura come temperatura ambiente. Mescolare 200 microlitri di soluzione di BSA, 200 microlitri di urea e 200 microlitri di soluzione di cloruro d'oro nella fiala di vetro agitando costantemente. Due minuti dopo a 20 microlitri di soluzione di idrossido di sodio.

Attivare la capacità di riduzione di BSA di formare nano cluster d'oro e iniziare a registrare il tempo di reazione come zero minuti. Misurare ogni ora lo spettro di fotoemissione della miscela di reazione. Posizionare cinque fiale di vetro, ciascuna contenente un'ancoretta magnetica e pre-marcate con un farmaco o HSA puro, sopra un'agitazione magnetica multipunto a temperatura controllabile.

Aggiungere 200 microlitri di HSA in ogni flaconcino. Quindi aggiungere un microlitro di ciascuna soluzione farmacologica precedentemente preparata ai quattro file corrispondenti. Inoltre, aggiungere un microlitro di DMSO all'interruttore di controllo sull'agitatore.

Impostare la velocità di centrifuga a 360 giri/min e incubare per un'ora per consentire al farmaco di legarsi all'HSA un'ora dopo a 200 microlitri di acqua milli Q e 200 microlitri di soluzione di cloruro d'oro in ogni fiala sotto costante agitazione. Impostare la temperatura a 60 gradi Celsius mescolando costantemente per 10 minuti. Dopo 10 minuti a 20 microlitri di idrossido di sodio molare da 1,5 molari su ogni lima e iniziare a registrare il tempo di reazione a zero minuti.

Le soluzioni di reazione congiunta per la misurazione devono seguire la stessa sequenza di aggiunta di farmaci e devono essere praticate il più rapidamente possibile per ridurre al minimo l'effetto del ritardo Preleva rapidamente 50 microlitri di soluzione da ciascuna fiala. Trasferire su una piastra nera a 384 pozzetti e misurare lo spettro di emissione. Registrare gli spettri di emissione di ciascun campione ogni 10 minuti, raccogliendo almeno quattro spettri in quattro momenti diversi.

Ripetere questi passaggi più volte per ottenere risultati con un andamento coerente. Traccia gli spettri di emissione fotografica risolti nel tempo per ciascun campione. Identificare l'intensità di picco di tutti i campioni e tracciare il tempo per confrontare la cinetica di formazione dei nano cluster d'oro in diversi modelli di proteine caricate con farmaci per misurare la costante di legame tra ciascun farmaco e l'HSA.

Sostituire le soluzioni farmacologiche con soluzioni di ibuprofene a quattro diverse concentrazioni. 10 minuti dopo, raffreddare le fiale di vetro sotto l'acqua corrente in un lavandino. Prelevare 50 microlitri delle soluzioni di cui sopra da ciascuna fiala su una piastra nera a 384 pozzetti e misurare lo spettro di emissione.

Ripetere questi passaggi altre due volte per ottenere altre due serie di risultati a diverse concentrazioni di farmaco prima di interrompere l'agitazione magnetica. Quindi traccia gli spettri di emissione fotografica e analizza i risultati per il grezzo ottenuto in ogni singolo lotto. Traccia gli spettri di emissione fotografica di ciascun campione in software come Origin Pro e determina l'intensità di picco.

Calcola e traccia l'intensità relativa della fluorescenza rispetto alla concentrazione del farmaco. Calcolare quindi la costante di associazione adattando i dati a un modello di associazione a sito singolo. Utilizzo dell'equazione della cementina Mics per eseguire questa operazione in software come Origin Pro.

Selezionare il menu analisi fitting non linear curve fit, quindi selezionare la funzione grandine dalla categoria sigmoidale di crescita nella pagina di selezione della funzione delle impostazioni. Fare clic su Adatta per visualizzare. I risultati adattati mostrati qui sono risultati rappresentativi degli spettri di emissione fotografica risolti nel tempo di nano cluster d'oro prodotti in diverse condizioni di denaturazione delle proteine.

Si può osservare che i nanocluster d'oro si formano più velocemente a temperature più elevate. La condizione di denaturazione dell'urea può anche facilitare la sintesi diretta di nano cluster d'oro utilizzando la proteina BSA come modello. Di seguito sono riportati i risultati tipici dello screening rapido dei farmaci fluorometrici basati sull'intensità della fluorescenza dei nanocluster d'oro utilizzando l'HSA caricato con farmaco come modello.

Maggiore è l'intensità della fluorescenza, minore è la forza di legame di una molecola di farmaco all'HSA. Questi spettri mostrano l'effetto della concentrazione del carico di farmaco sul tasso di formazione di nano cluster di oro fluorescente all'interno dell'HSA caricato con ibuprofene. Maggiore è la concentrazione del farmaco, minore è il segnale fluorescente dei nano cluster d'oro risultanti mostrati qui come risultato rappresentativo della determinazione della costante di legame del farmaco proteico.

Viene calcolato adattando l'intensità di fluorescenza relativa dei nano cluster d'oro sintetizzati nel modello HSA precaricato con ibuprofene di varie concentrazioni utilizzando l'equazione della cementina delle MICU Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 30 minuti per lo screening di più farmaci in parallelo se eseguita correttamente. Dopo aver visto questo video, ora dovresti avere una buona comprensione di come sintetizzare rein, andare nano cluster nella proteina caricata con farmaco e determinare l'affinità di legame dei farmaci a una proteina bersaglio come rilevabile dal segnale fluorescente emesso dai nano cluster d'oro risultanti.