Valutazione della proprietà immunomodulanti di cellule staminali mesenchimali umane (MSC)
24 dicembre 2015
Le proprietà immunomodulanti di cellule umane staminali mesenchimali (MSC) appaiono sempre più rilevante per l'applicazione clinica. Utilizzando un sistema di co-coltura di cellule staminali mesenchimali e leucociti del sangue periferico pre-colorati con il colorante fluorescente carbossifluoresceina succinimidil estere (CFSE), si descrive la valutazione in vitro di MSC immunomodulazione sulla proliferazione dei leucociti effettrici e sottopopolazioni specifiche.
L'obiettivo generale di questo esperimento è valutare le proprietà immunomodulatrici delle cellule staminali mesenchimali umane o msc. Questo metodo può contribuire a chiarire i meccanismi coinvolti nell'immunomodulazione mediata dalle cellule staminali mesenchimali umane, un processo che potrebbe avere rilevanza terapeutica. Il vantaggio principale di questa tecnica è che sia l'insorgenza della proliferazione dei leucociti effettrici sia il numero di divisioni cellulari possono essere valutati, dimostrando che la procedura sarà eseguita per scarpa.
Un tecnico del mio laboratorio per isolare i PBMC inizia diluendo 25 millilitri di un campione di sangue intero eparinizzato con 25 millilitri di PBS in un tubo conico da 50 millilitri. Successivamente, aggiungere 15 millilitri di Ficoll-Paque™ in un nuovo tubo da 50 millilitri. Poi, tenendo il tubo inclinato, stratificare lentamente la sospensione cellulare diluita sopra il gradiente di densità.
Ciò garantisce che non avvenga alcun mescolamento tra gli strati. Uno dei passaggi più critici di questo esperimento consiste nel sovrapporre il sangue senza perturbare il gradiente di densità. Questo passaggio è essenziale per garantire un'elevata purezza e una bassa contaminazione da globuli rossi dei pbmc isolati.
Ora, separare le cellule mediante centrifugazione. Dovrebbero essere evidenti tre strati distinti: lo strato plasmatico superiore, lo strato inferiore del gradiente di densità del fial pack e uno strato intermedio sottile di PBMC.
Utilizzando una pipetta PE, rimuovere lo strato superiore avendo cura di non aspirare lo strato di interfase. Successivamente, utilizzare una pipetta da 10 millilitri per trasferire con attenzione i PBMC in un tubo conico da 50 millilitri. Mescolare le cellule con 20 millilitri di PBS e quindi centrifugarle per rimuovere eventuali tracce del gradiente di densità.
Quindi lavare il pellet con altri 20 millilitri di PBS per rimuovere le piastrine. Risospendere il secondo pellet in mezzo completo per leucociti a una concentrazione di uno per 10 alla settima cellule per millilitro. Per preparare una co-coltura di MSC e leucociti, preriscaldare il mezzo completo per MSC a 37 gradi Celsius per non più di 30 minuti.
Quindi seminare cinque volte 10 alla quarta MSC per un millilitro di mezzo completo per MSC per pozzetto in piastre a 24 pozzetti per l'adesione notturna a 37 gradi Celsius, consentendo alle cellule di raggiungere una confluenza dell'80%. La mattina seguente, aspirare il mezzo e aggiungere il numero appropriato di PBMC marcati con CFSE alle MSC in un millilitro di mezzo completo per leucociti. In un rapporto di una MSC ogni 10 PBMC, attivare le cellule con 10 microgrammi di PHA per millilitro di mezzo completo per leucociti.
Quindi, nei giorni tre e cinque della co-coltura, trasferire il numero appropriato di co-coltura in provette con fondo rotondo e valutare la proliferazione dei leucociti marcati con CFSE mediante analisi citofluorimetrica per eseguire un saggio di soppressione degli effettori. Iniziare preparando una co-coltura di M-S-C-P-B-M-C come appena dimostrato, con 2,5 × 10⁶ pBMC co-coltivati con 250.000 MSC. Per garantire un numero sufficiente di pBMC in co-coltura con le MSC per la selezione delle sottopopolazioni.
Dopo 48-72 ore a 37 gradi Celsius, selezionare i leucociti immunomodulatori indotti da MSC di interesse mediante le appropriate microsfere magnetiche. Quindi aggiungere cellule T allogeniche CD4 positive marcate con CFSE in un millilitro di mezzo completo per leucociti per pozzetto, utilizzando diversi rapporti sperimentali. Successivamente, aggiungere microsfere coniugate con anti-CD3/28 in un rapporto di uno a uno (beads:cellula) per stimolare le cellule T CD4 positive.
Nel terzo giorno di coltura condivisa, valutare la proliferazione delle cellule T CD4 positive marcate con CFSE mediante citometria a flusso. Le MSC sono cellule aderenti con morfologia fibroblastica a forma di fuso, mentre i PBMC e i leucociti sono cellule piccole, rotonde e non aderenti, il che permette una chiara distinzione tra queste due popolazioni cellulari. In una coltura condivisa, in assenza di proliferazione, le cellule marcate con CFSE vengono osservate come un singolo picco fortemente positivo e intensamente fluorescente quando le cellule sono state attivate.
La proliferazione si manifesta come multipli picchi più piccoli con una perdita e uno spostamento verso sinistra dell'intensità di fluorescenza quando si è verificata una soppressione della proliferazione. Ad esempio, in una coltura co-coltivata con MSC, il numero di picchi più piccoli diminuisce con un concomitante aumento dell'intensità di fluorescenza, come evidenziato dallo spostamento dei picchi verso destra e dall'aumento della nitidezza del picco più a destra, che rappresenta le cellule non dividenti in un saggio di soppressione effettore. L'effetto soppressivo dei MSC sulla proliferazione delle cellule T CD4 positive può essere ulteriormente valutato in maniera dose-dipendente.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona conoscenza di come valutare l'immunomodulazione delle cellule staminali mesenchimali umane. Non dimenticare che lavorare con cellule umane può essere pericoloso e che si devono sempre adottare precauzioni adeguate.
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Panoramica
Questo studio analizza le proprietà immunomodulatrici delle cellule staminali mesenchimali umane (MSCs) mediante un sistema di co-coltura con leucociti del sangue periferico. La valutazione si concentra sulla proliferazione dei leucociti effettrori e su specifiche sottopopolazioni, evidenziando il potenziale rilevante terapeutico delle MSCs.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Immunologia
- Ricerca sulle cellule staminali
- Proliferazione cellulare
Sfondo
- Le cellule staminali mesenchimali umane (MSC) possiedono proprietà immunomodulatrici.
- Comprendere le interazioni tra MSC e leucociti è fondamentale per le applicazioni terapeutiche.
- La proliferazione dei leucociti effettori è un aspetto chiave della risposta immunitaria.
- I sistemi di co-coltura possono modellare efficacemente queste interazioni in vitro.
Scopo dello studio
- Valutare gli effetti immunomodulatori delle MSC sulla proliferazione dei leucociti.
- Chiarire i meccanismi dell'immunomodulazione mediata dalle MSC.
- Esplorare la rilevanza terapeutica delle MSC nelle applicazioni cliniche.
Metodi Utilizzati
- Sistema di co-coltura di MSC e leucociti del sangue periferico.
- Utilizzo del carbossifluoresceina succinimidil estere (CFSE) per il tracciamento cellulare.
- Valutazione della proliferazione dei leucociti effettrori.
- Analisi di specifiche sottopopolazioni di leucociti.
Risultati principali
- Dimostrata la modulazione indotta dalle MSC sulla proliferazione dei leucociti.
- Identificate specifiche sottopopolazioni influenzate dalle MSC.
- Forniti approfondimenti sui meccanismi di immunomodulazione delle MSC.
- Evidenziato il potenziale terapeutico delle MSC in contesti clinici.
Conclusioni
- I MSC mostrano effetti immunomodulatori significativi sui leucociti.
- I risultati supportano l'uso terapeutico dei MSC in ambito clinico.
- Sono necessarie ulteriori ricerche per comprendere appieno i meccanismi coinvolti.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La valutazione della funzione immunomodulatrice delle MSC mediante saggi di proliferazione dei leucociti basati sul CFSE fornisce un metodo quantitativo e riproducibile per valutare il potenziale terapeutico nelle malattie immuno-mediate. Questo approccio supporta la validazione del bersaglio consentendo una riduzione del rischio meccanicistica dell'immunosoppressione mediata dalle MSC prima di investimenti preclinici. L'adattabilità del saggio a specifiche sottopopolazioni di leucociti aumenta la fiducia predittiva nella selezione dei candidati principali per i percorsi immunomodulatori.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'analisi della soppressione mediata dalle MSC della proliferazione dei leucociti effettrori come lettura funzionale dell'attività immunomodulatrice.
- Valore operativo: Fornisce un metodo standardizzato, basato su marcatura, per quantificare la storia delle divisioni e la cinetica della proliferazione senza ricorrere alla radioattività.
- Valore scientifico: Supporta lo screening fenotipico di donatori di MSC o di strategie di pre-condizionamento mediante la misurazione della soppressione della proliferazione dei leucociti marcati con CFSE.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Consente l'isolamento e il tracciamento di specifici sottoinsiemi di leucociti (ad esempio, cellule T CD4+) mediante selezione con microsferette magnetiche prima della co-coltura, permettendo un profilo di immunomodulazione specifico per sottoinsieme.
- Valore operativo: I profili di diluizione del CFSE ottenuti mediante citometria a flusso forniscono dati quantitativi e multiparametrici sulla soppressione della proliferazione e sulla storia delle divisioni cellulari.
- Valore scientifico: Permette la valutazione della risposta dose-dipendente dell'immunomodulazione mediata dalle MSC in diversi rapporti MSC:leucociti e condizioni di attivazione (ad esempio, stimolazione con PHA).
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Collega la potenza immunomodulatrice in vitro all'efficacia clinica potenziale nelle malattie correlate al sistema immunitario, modellando l'interazione tra MSC e leucociti.
- Valore operativo: Consente campionamenti longitudinali (ad esempio, ai giorni 3 e 5) per valutare la dinamica temporale della soppressione e del recupero.
- Valore scientifico: Favorisce una valutazione allineata ai biomarcatori, correlando la soppressione della proliferazione con l'espressione intracellulare di citochine nei leucociti in co-coltura.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il saggio di proliferazione dei leucociti basato sul CFSE si integra nei flussi di lavoro della fase iniziale di scoperta come strumento funzionale per lo screening immunomodulante, collegando la validazione del bersaglio e la fase di ottimizzazione dei composti promettenti per terapie a base di cellule staminali mesenchimali.
- Biologia della scoperta: Verifica l'ipotesi secondo cui le cellule staminali mesenchimali (MSC) sopprimono la proliferazione dei leucociti, fornendo informazioni meccanicistiche sui percorsi immunosoppressivi.
- Screening: Fornisce letture quantitative e riproducibili della proliferazione, che consentono il confronto tra diversi lotti di MSC, donatori o condizioni di priming.
- Analisi: Genera dati di citometria a flusso in grado di risolvere picchi di proliferazione, tracciare le divisioni cellulari e rilevare risposte specifiche per sottopopolazioni all'interno di popolazioni eterogenee di leucociti.
- Ricerca traslazionale: Modella in vitro le interazioni tra cellule immunitarie umane e MSC, supportando l'estrapolazione a contesti clinici di immunomodulazione.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma modulare e adattabile, applicabile a diversi tipi di cellule immunitarie e a condizioni di stimolazione rilevanti per le malattie.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica fornendo prove dirette e quantificabili della soppressione dei leucociti mediata dalle cellule staminali mesenchimali.
- Valore operativo: Garantisce la standardizzazione del saggio attraverso rapporti definiti tra cellule staminali mesenchimali e leucociti, protocolli di marcatura con CFSE e strategie di gating citofluorimetrico.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione dello sviluppo identificando precocemente cellule staminali mesenchimali con attività immunomodulatrice potente e riproducibile.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione dei candidati cellule staminali mesenchimali in base alla forza funzionale dell'immunomodulazione, piuttosto che esclusivamente ai marcatori fenotipici.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'isolamento di leucociti primari, nell'etichettatura con CFSE e nell'analisi di citometria a flusso multicolore.
- Dipende dall'accesso a citometri a flusso in grado di risolvere i picchi di diluizione del CFSE e a sistemi di separazione con microsferette magnetiche per l'isolamento di sottopopolazioni.
- Necessita della standardizzazione delle condizioni di attivazione dei leucociti (ad esempio, concentrazione di PHA) e dei protocolli di precoltura delle MSC tra diversi laboratori.
- Richiede l'ottimizzazione dei rapporti MSC:leucociti e della durata della cocoltura per evitare artefatti legati a sovraccrescita o deplezione di nutrienti.
- È limitato dalla variabilità tra donatori nella risposta dei leucociti, richiedendo controlli con donatori accorpati o abbinati per ottenere metriche di soppressione riproducibili.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:05
Title
0:44
Peripheral Blood Mononuclear Cell (PBMC) Isolation
2:23
MSC: Leukocyte Co-culture and Leukocyte Activation
3:31
Variation: Effector Suppression Assay
4:38
Results: Representative Suppressive Effects of MSC on Leukocyte Proliferation
5:51
Conclusion
