Rilevazione di intracellulare genica in cellule vive di murini, umana e suina origine utilizzando nanoparticelle di fluorescenza marcata

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di analizzare l'espressione genica intracellulare direttamente nelle cellule viventi attraverso l'applicazione di nanoparticelle fluorescenti specifiche del gene. Ciò si ottiene definendo prima le sequenze bersaglio appropriate nel gene di interesse. Il secondo passo consiste nella produzione di nanoparticelle con filamenti specifici di cattura e reporter.

Successivamente, le nanoparticelle vengono aggiunte direttamente al terreno di coltura della cellula vivente. Il passaggio finale consiste nell'incubare le cellule con le nanoparticelle durante la notte a 37 gradi Celsius e al 5% di CO2 in un'atmosfera umidificata. In definitiva, la microscopia a fluorescenza viene utilizzata per visualizzare la fluorescenza gene specifica nelle cellule bersaglio viventi, mentre l'analisi della citometria a flusso viene utilizzata per quantificare il numero di cellule fluorescenti.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'immunoistochimica, i beacon molecolari o l'analisi PCR, è che l'espressione genica può essere osservata visivamente nelle cellule vive senza alcuna manipolazione della coltura cellulare. A dimostrare la procedura sarà Martina Teresa, biologa e dottoranda del nostro laboratorio, Lynette Henkel, per la citometria a flusso. Dopo aver determinato le sequenze target, ordinare nanoparticelle d'oro liofilizzate da fonti disponibili in commercio.

Queste particelle sono composte da una particella d'oro centrale legata in modo covalente a un filamento di cattura, che è legato a un filamento reporter. Quando l'mRNA bersaglio si lega al filamento di cattura, il filamento reporter e il suo fluoroforo collegato vengono rilasciati nella soluzione, consentendo al Fluor four di emettere fluorescenza. Prima della ricostituzione.

Le nanoparticelle devono essere conservate a quattro gradi Celsius al buio in una scatola di cartone. Per ricostituire le nanoparticelle d'oro aggiungere 20 microlitri di acqua distillata doppia, ottenendo una concentrazione finale di 100 nano molari. Le nanoparticelle ricostituite possono essere conservate a temperatura ambiente al buio per almeno un anno.

Il giorno dell'applicazione, diluire la soluzione madre di nanoparticelle d'oro in una soluzione di lavoro 20 x in PBS, rimuovere una piastra da 24 pozzetti contenente 2 cellule HEK 93 dall'incubatore di coltura cellulare, aspirare il terreno e quindi aggiungere 237,5 microlitri di terreno di coltura fresco, quindi pipettare 12,5 microlitri della soluzione di lavoro di nanoparticelle in ciascun pozzetto preparato e far roteare la piastra per garantire una distribuzione uniforme delle nanoparticelle. Incubare le cellule per una notte a 37 gradi Celsius e 5% di CO2 in un'atmosfera umidificata. Il giorno dopo.

Analizza le colture cellulari per la fluorescenza del sito tre gene specifico utilizzando un microscopio a fluorescenza standard per preparare le cellule per la citometria a flusso. Lavare una volta con PBS le cellule HEK 2, 9, 3 che mostrano fluorescenza indotta sul lato tre e aggiungere un millilitro di tripsina EDTA allo 0,05%, incubare le cellule per tre minuti a 37 gradi Celsius e 5% di CO2. Dopo l'incubazione, aggiungere 0,5 millilitri di terreno CO e pipettare su e giù.

Quindi trasferire le cellule in una provetta da 15 millilitri. Aggiungere tre millilitri di terreno di coltura e centrifugare la provetta per cinque minuti a 300 volte G.Quindi, rimuovere lo stato e sospendere nuovamente le cellule in 200 microlitri di tampone fax ghiacciato. Trasferire le cellule in una provetta da 1,5 millilitri e conservarle in ghiaccio al buio fino all'analisi.

Prima dell'analisi via fax, far passare le cellule attraverso un filtro da 30 micrometri per evitare l'aggregazione cellulare. Quindi aggiungere ioduro di propidio alle cellule a una concentrazione finale di due microgrammi per millilitro per almeno due minuti, portare le cellule al vortice del citometro a flusso e caricare la provetta del campione sul dispositivo. Per rilevare tre cellule SI: positive.

Utilizzare celle di controllo non trattate per impostare i gate gerarchici sulla dispersione diretta o sull'area FSC rispetto alla dispersione laterale o al sottoinsieme dell'area SSC, l'altezza FSC rispetto a FSC con sottoinsieme e l'altezza SSE rispetto a SSE con sottoinsieme per escludere i detriti cellulari e le celle disperse uns. Rimuovere le cellule morte dall'analisi in base alla colorazione con ioduro di propidio visualizzando il canale PE contro il canale PE Texas Red e quindi eseguire il cancello di smistamento finale sul sito tre cellule PE positive. Rilevamento di GA dh.

Un gene housekeeping costitutivamente espresso è stato eseguito in cellule HEK 2 93 per convalidare la fattibilità sperimentale. Le nanoparticelle di controllo negativo strapazzate mostrano poca o nessuna fluorescenza mentre sono permanentemente fluorescenti in assorbimento. I controlli mostrano un segnale forte dopo l'incubazione notturna.

Queste nanoparticelle hanno dimostrato di rilevare in modo specifico i marcatori delle cellule staminali pluripotenti, l'espressione genica nano e GDF tre nel rispecchiare le cellule staminali pluripotenti indotte umane e suine o IPC. È importante sottolineare che questi marcatori sono stati rilevati solo nelle IPC e non nelle cellule di fibroblasti che fungevano da strato di alimentazione durante la coltura cellulare IPS. Sia l'analisi visiva che quantitativa tramite citometria a flusso sono state utilizzate per valutare l'efficienza di marcatura delle nanoparticelle GA DH e l'edizione graduata delle nanoparticelle da zero a 1000.

PICO molare è stato eseguito con cellule HEK 2 93, che hanno dimostrato un chiaro aumento della fluorescenza dipendente dalla concentrazione. L'analisi quantitativa è stata quindi eseguita su cellule staminali embrionali murine, che hanno mostrato circa il 40% di cellule positive CY tre dopo l'edizione di 400 nanoparticelle di GA DH PICOMOLARE. Valori simili sono stati ottenuti per i marcatori di pluripotenza.

Nano e GDF tre una volta padroneggiati. Questa tecnica può essere eseguita entro 16 ore se eseguita correttamente. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare le nanoparticelle specifiche del gene per rilevare l'espressione genica intracellulare direttamente nelle cellule viventi utilizzando la microscopia a fluorescenza.