Ripopolamento cellule epiteliali e preparazione di roditori matrice extracellulare Ponteggi per lo sviluppo del tessuto renale

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di ripopolare gli scaffold della matrice extracellulare del rene di roditore tridimensionale acellulare con cellule epiteliali renali umane. Ciò si ottiene decellularizzando prima un rene di ratto con una serie di soluzioni detergenti perfuse attraverso l'arteria renale per un periodo di 26 ore. Il rene viene quindi sterilizzato e gli scaffold della matrice extracellulare renale acellulare vengono iniettati con 40 milioni di cellule epiteliali tubulari corticali renali umane o RCTE in perfusione arteriosa anterograda continua all'interno di un sistema di reattori Biore progettato su misura.

In definitiva, la capacità delle cellule RCTE di ripopolare l'impalcatura renale può essere valutata mediante test di ER e perfusione e analisi immunoistochimiche. Questa tecnica di coltura cellulare 3D consente agli investigatori di ripopolare la matrice extracellulare dell'intero organo. Le cellule dello scaffold vengono depositate all'interno dello spazio peritubulare all'interno della matrice extracellulare per consentire l'indagine e il legame dei fattori che influenzano la crescita, la differenziazione e la maturazione cellulare.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto a metodi alternativi come la fabbricazione di scaffold polimerici sintetici, è che la matrice extracellulare renale facilita l'adesione, la proliferazione e la maturazione delle cellule perfuse all'interno di un'intricata rete di proteine strutturali naturali, fattori di crescita e altri componenti biologici. Iniziare la procedura di decellularizzazione collegando il catetere dell'arteria renale di ciascun rene scongelato all'estremità del tubo del circuito di perfusione a valle della pompa, assicurandosi che non rimangano intrappolate bolle d'aria nel catetere. Se nel catetere sono presenti bolle d'aria, utilizzare una micropipetta da 200 microlitri per estrarre le bolle e riempire il catetere con il liquido.

Sospendi il rene lungo la parete interna di un becher vuoto da cinque litri in modo che l'arteria renale non si attorcigli o si attorcigli e regolare l'azionamento della pompa a cinque millilitri al minuto. Quindi premere start dopo aver confermato che ogni rene sta perfondendo osservando il gocciolamento di soluzioni dal fondo dell'organo più ogni rene con le soluzioni appropriate come indicato nel diagramma di flusso alla fine della perfusione, conservare i reni decellularizzati in PBS in un tubo conico da 50 millilitri a quattro gradi Celsius o un massimo di due. Dopo aver assemblato il circuito di perfusione, rimuoviamo il tappo a vite rosso sulla testa del bioreattore e pipettiamo 50 millilitri di una soluzione di acido acetico allo 0,1% e etanolo al 4% nel serbatoio del mezzo attraverso l'apertura.

Utilizzando una cartuccia della pompa grande, collegare il segmento del tubo della pompa peristaltica alla testa della pompa. Quindi regolare la portata a cinque millilitri al minuto. Premere start e lasciare che il circuito si adeschi quando il liquido riempie la linea di profusione e raggiunge la porta aperta rimanente del rubinetto di arresto a tre vie.

Utilizzare una spina per esca maschio per collegare la porta. Lasciare che il circuito si adeschi completamente fino a quando non si osserva aria nel tubo del circuito di perfusione o all'interno dell'ingresso. L'accettore espelle le bolle dal circuito di perfusione aumentando temporaneamente la portata della pompa.

Quando il sistema è completamente adescato, arrestare l'azionamento della pompa e sterilizzare una pinza da sei pollici. Per inserire con cura l'estremità dell'esca femminile del catetere dell'arteria renale nell'ingresso maschile, posizionare l'accettore dell'esca sulla superficie interna della testa del bioreattore, assicurandosi che la connessione sia ben stretta e che non rimanga aria nel catetere. Lasciare che il rene penda delicatamente dal catetere dell'arteria renale in modo che l'arteria renale non si attorcigli o si attorcigli.

Quindi serrare il morsetto metallico che tiene insieme la testa e il corpo del bioreattore in modo che il serbatoio del bioreattore sia ben sigillato e chiudere il tappo a vite. Ora sterilizzare i reni con una perfusione a temperatura ambiente della soluzione di etanolo per acido acetico a cinque millilitri al minuto. Dopo un'ora, arrestare la pompa e aprire il tappo a vite rosso.

Utilizzando un parassita sterile, la pipetta aspira con cura tutta la soluzione dal serbatoio del bioreattore. Quindi pipettare 50 millilitri di PBS fresco nel serbatoio del bioreattore. Chiudere il tappo a vite e avviare la pompa per tre perfusioni sequenziali di un'ora a temperatura ambiente a cinque millilitri al minuto.

Dopo l'ultimo risciacquo PBS, aspirare la soluzione salina dal serbatoio e aggiungere 50 millilitri di terreno al serbatoio con un tappo a vite chiuso. Trasferire il bioreattore con il circuito di perfusione collegato in un incubatore di grande capacità a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Quindi collegare il circuito di perfusione del bioreattore alla pompa e perfondere i reni a quattro millilitri al minuto per almeno un'ora prima della semina.

Per cellularizzare, i reni raccolgono un numero sufficiente di fiasche di coltura per la concentrazione di seduta desiderata. Successivamente, dopo aver aspirato il terreno di coltura da ciascun pallone, utilizzare 10 millilitri dell'enzima di dissociazione cellulare appropriato per sollevare le cellule epiteliali tubulari corticali renali dal pallone a 37 gradi Celsius. Dopo 10 minuti, iniziare a controllare le fiasche su un microscopio a contrasto facciale ogni due minuti fino a quando non si osserva il distacco della piega.

Quindi, dopo aver prelevato una piccola aliquota di cellule per il conteggio, diluire la sospensione cellulare associata in un volume uguale di terreno premed e centrifugare le cellule in eccesso. Sospendere il pellet con un volume appropriato di terreno di coltura per ottenere una concentrazione finale di due volte 10 al settimo di cellule per millilitro. Trasferire due millilitri di sospensione in sede, un piatto di coltura da 35 millimetri, quindi aspirare il volume di due millilitri in una siringa sterile da cinque millilitri.

Trasferire il bioreattore di perfusione in una cabina di sicurezza biologica e ruotare la valvola del rubinetto di arresto per chiudere il flusso verso la porta di sede. Rimuovere il fermaglio dell'esca maschile, tappare dal rubinetto di arresto e collegare la siringa. Quindi trasferire rapidamente il circuito di perfusione all'incubatore e utilizzare la cartuccia della pompa grande per fissare il segmento del tubo della pompa peristaltica alla testa della pompa per posizionare le cellule.

Chiudere la porta della valvola del rubinetto di arresto rivolta verso la pompa e iniettare lentamente le cellule nell'impalcatura renale. Quindi ruotare la valvola del rubinetto per chiudere il flusso dalla siringa e avviare la pompa a 25 millilitri al minuto. Dopo 15 minuti, abbassare la portata della pompa a quattro millilitri al minuto, sostituendo il fluido il giorno successivo e successivamente ogni due giorni.

Per valutare la vitalità e la proliferazione delle cellule, scambiare asetticamente il terreno di coltura con 10 millilitri di soluzione di lavoro di zarina per una perfusione di quattro millilitri al minuto degli scaffold renali dopo esattamente un'ora, raccogliere la soluzione di zarina condizionata e parzialmente ridotta ed eseguire un'altra perfusione di quattro millilitri al minuto. Con 100 millilitri di coltura fresca, i reni medi cosparsi in sequenza con acqua e soluzioni detergenti diluite sono diventati progressivamente più trasparenti in un periodo di 26 ore grazie alla perfusione detergente finale, la rete vascolare renale e, in particolare, i vasi interloberi sono esposti in modo prominente nello scaffold decellularizzato. L'intero organo viene ripulito dalle cellule native, lasciando dietro di sé la rete di membrane basali intatta dei glomeruli, dei tubuli e dei dotti collettori e la matrice extracellulare dei vasi sanguigni decellularizzati.

Oltre ai vasi più grandi, anche le membrane basali microvascolari all'interno dei glomeruli mantengono la loro integrità strutturale. Le cellule RCTE seminate nell'impalcatura renale, come appena dimostrato, ospitano principalmente le regioni corticali dell'impalcatura renale, dove ripopolano preferenzialmente i tubuli glomerulari di pereg. Poche cellule si incorporano all'interno dei glomeruli al primo giorno dopo la semina e, al settimo giorno, i glomeruli sono praticamente privi di cellule mentre la maggior parte di queste cellule occupa le regioni corticali della matrice extracellulare renale.

Dopo sette giorni di coltura di perfusione anterograda, molti tubuli della linea RCTE sono presenti nei tubuli midollari e papillari esterni e nelle anatre raccoglitrici dopo il ripopolamento delle cellule RCTE e una settimana di coltura di perfusione. Tuttavia, la trasparenza osservata in seguito alla decellularizzazione viene persa e il rene izzato appare opaco e più vicino al suo stato nativo. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'analisi immunochimica di terreni di coltura condizionati per rispondere a ulteriori domande, come cambiano gli stati metabolici o fenotipici di queste cellule all'interno della matrice extracellulare renale?

La capacità di sviluppare scaffold extracellulari e di aggiungere le vendite dei donatori alla matrice consente ai ricercatori di delineare la crescita e la maturazione in tre dimensioni all'interno di scaffold naturali dell'exo matrice renale. L'obiettivo finale è quello di utilizzare questa tecnologia come strumento per comprendere meglio i meccanismi di riparazione e rigenerazione renale.