JoVE Science Education

Advanced Biology

Developmental Biology

Introduzione alla biologia molecolare dello sviluppo

An Introduction to Molecular Developmental Biology

JoVE Science Education
Developmental Biology

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

JoVE Science Education Developmental Biology

An Introduction to Molecular Developmental Biology

2.3: Genetic Engineering of Model Organisms

2.5: Explant Culture for Developmental Studies

30,464 Views

•

09:27 min

•

April 30, 2023

Overview

I segnali molecolari svolgono un ruolo importante nei complessi processi che si verificano durante lo sviluppo embrionale. Questi segnali regolano attività come la differenziazione e la migrazione cellulare, che contribuiscono alla formazione di specifici tipi e strutture cellulari. L’uso di approcci molecolari consente ai ricercatori di indagare questi meccanismi fisici e chimici in dettaglio.

Questo video esaminerà una breve storia dello studio degli eventi molecolari durante lo sviluppo. Successivamente, le domande chiave poste dai biologi dello sviluppo molecolare oggi saranno esaminate, seguite da una discussione su diversi metodi importanti utilizzati per rispondere a queste domande, come la colorazione, la coltura di espianto e l’imaging di cellule vive. Infine, esamineremo alcune applicazioni attuali di queste tecniche allo studio della biologia dello sviluppo.

Procedure

Gli studi nel campo della biologia molecolare dello sviluppo forniscono informazioni sui cambiamenti che si verificano a livello cellulare durante la differenziazione e lo sviluppo. I ricercatori esaminano i meccanismi fisici e chimici che regolano le funzioni cellulari. Questo aiuta a capire come le cellule danno origine a tessuti specializzati all’interno dell’embrione in maturazione e come i difetti a livello molecolare possono portare a stati patologici.

Questo video presenta una breve storia della biologia dello sviluppo molecolare, introduce le domande chiave poste dagli scienziati in questo campo, descrive alcuni strumenti disponibili per rispondere a tali domande e discute alcune attuali applicazioni di laboratorio.

Iniziamo esaminando alcuni studi di riferimento nella storia della ricerca sulla biologia dello sviluppo molecolare.

Nel 1957, Conrad Waddington pubblicò un libro intitolato “La strategia dei geni” in cui cercò di spiegare come viene deciso il destino cellulare. Sulla base di studi di trapianto di tessuto condotti in precedenza, ha presentato un modello concettuale che descrive che una cellula è come un marmo che rotola giù da una collina e il percorso che impiega per raggiungere il fondo determinerà il suo stato differenziato finale. Questa idea che tipi di cellule distinti derivino da cellule indifferenziate che ricevono segnali diversi durante lo sviluppo divenne nota come il “paesaggio epigenetico”.

Più o meno nello stesso periodo, Rita Levi-Montalcini e Stanley Cohen hanno osservato che il trapianto di tumori in embrioni di pulcino ha portato a una rapida crescita dei neuroni. Hanno ipotizzato che una sostanza secreta dai tumori abbia causato questa crescita e hanno identificato la proteina come fattore di crescita nervoso o NGF. Poco dopo, Cohen scoprì un altro fattore di crescita che fu secreto dalla ghiandola salivare del topo e promosse la crescita delle cellule epiteliali. Ha identificato questa proteina come fattore di crescita epidermico, o EGF.

Più tardi, nel 1969, Lewis Wolpert propose una teoria su come una certa classe di molecole di segnalazione, note come morfogeni, agiscono direttamente sulle cellule per indurre risposte specifiche a concentrazioni variabili. Ha usato i colori della bandiera francese per modellare gli stati delle celle, il rosso serve come stato predefinito quando non è presente alcun segnale. Da lì, basse concentrazioni di morfogeno, mostrate in bianco, potrebbero attivare un gene, mentre alte concentrazioni di morfogeno, mostrate in blu, potrebbero attivare un gene diverso.

Espandendo questo lavoro, nel 1988 Christiane Nusslein-Volhard ha identificato il primo morfogeno conosciuto conducendo screening genetici sulle mosche. Ha usato anticorpi per dimostrare che una proteina, nota come Bicoid, forma un gradiente di concentrazione lungo l’asse anteriore-posteriore dell’embrione in via di sviluppo e controlla l’espressione di geni importanti per l’organizzazione delle regioni della testa e del torace.

Durante i primi anni 1990, Peter Lawrence e Ginés Morata hanno usato il loro lavoro nelle mosche per espandere la teoria dei gradienti morfogeni. Hanno ipotizzato che un insieme di cellule sia responsabile dell’organizzazione di un particolare compartimento dell’organismo. Man mano che lo sviluppo procede, i segnali molecolari istruiscono quelle cellule a dividersi e costruire più compartimenti, continuando fino a quando l’intero organismo non si forma.

Ora che abbiamo esaminato alcuni punti salienti storici, esaminiamo alcune domande fondamentali poste dagli attuali biologi dello sviluppo.

Per iniziare, alcuni ricercatori si concentrano sull’identificazione delle molecole che regolano lo sviluppo. Ad esempio, potrebbero studiare singoli o combinazioni di fattori di crescita che hanno dimostrato di causare una risposta cellulare specifica, come la differenziazione o la migrazione.

Altri biologi dello sviluppo studiano come queste molecole regolano il processo di sviluppo. Potrebbero studiare come la concentrazione di un segnale molecolare può istruire una cellula a differenziarsi o migrare. Chiedono anche come le cellule comunicano con altre cellule vicine e guardano le molecole di segnalazione che si diffondono su una breve distanza e agiscono localmente, note come fattori paracrini.

Infine, alcuni biologi dello sviluppo vogliono capire come le cellule rispondono ai segnali esterni. Possono studiare i cambiamenti all’interno della cellula stessa, come aumenti o diminuzioni nell’espressione di particolari geni, osservando i livelli delle loro proteine codificate. Altri si concentrano su cambiamenti esterni, come alterazioni della forma o delle dimensioni delle cellule.

Ora che hai un’idea delle domande chiave poste dai biologi dello sviluppo molecolare, diamo un’occhiata ad alcune delle tecniche che usano per trovare risposte a queste domande.

La colorazione è uno degli approcci più utilizzati per studiare i modelli di espressione genica e per identificare le molecole che regolano lo sviluppo.

L’immunoistochimica è una tecnica di colorazione che utilizza anticorpi coniugati a reporter chimici o fluorescenti per etichettare le proteine. La visualizzazione delle proteine al microscopio a fluorescenza offre approfondimenti sulla loro localizzazione in sezioni tissutali e anche sui loro potenziali contributi alle strutture cellulari. L’ibridazione in situ a montaggio intero è un metodo di colorazione alternativo, che utilizza oligonucleotidi di DNA o RNA marcati per esaminare i modelli di espressione genica nei tessuti tridimensionali.

La coltura di espianto è un altro approccio comunemente usato in questo campo per studiare i meccanismi con cui agiscono gli stimoli esterni. In questa tecnica, un tessuto viene rimosso dal sito naturale di crescita e cresciuto in coltura. Condizioni di crescita specifiche, come il substrato sulle piastre di coltura o i fattori di crescita aggiunti ai mezzi di coltura, possono quindi essere esaminati per i loro effetti sullo sviluppo di cellule e tessuti.

L’imaging delle cellule vive viene utilizzato per analizzare le risposte cellulari agli stimoli dello sviluppo. Le colture in vitro sono adatte per catturare i movimenti cellulari e i modelli di localizzazione in tempo reale. Le cellule colorate o etichettate fluorescentemente possono anche essere tracciate in vivo utilizzando la microscopia time-lapse.

Spesso, le cellule di un tessuto di interesse vengono trapiantate da un donatore a un organismo ospite e quindi monitorate nel corso dello sviluppo.

Ora che hai familiarità con alcuni metodi di laboratorio generali, diamo un’occhiata ad alcune applicazioni della ricerca sulla biologia dello sviluppo molecolare.

Un approccio per determinare il ruolo che specifici prodotti genici svolgono nello sviluppo è quello di alterare la loro espressione con mezzi esterni. In questo esperimento, oligonucleotidi antisenso chiamati morfolini sono stati iniettati per abbattere due geni zebrafish importanti per il corretto sviluppo dell’orecchio interno. L’immuno colorazione delle proteine strutturali ha mostrato che gli embrioni con ridotta espressione genica mostrano meno neuroni e cellule ciliate all’interno dell’orecchio interno rispetto ai controlli.

Un’altra applicazione della biologia dello sviluppo molecolare è capire quando e dove i geni sono espressi, per capire meglio come possono funzionare le loro proteine codificate. I ricercatori in questo esperimento hanno utilizzato sonde di RNA etichettate fluorescentemente complementari a due trascritti bersaglio al fine di identificare le cellule che trascrivono uno o entrambi i geni di interesse.

Alcuni scienziati usano colture di espianto per analizzare le risposte cellulari in varie condizioni. In questo esperimento, i ricercatori hanno sezionato i neuroni sensoriali dall’orecchio interno degli embrioni di pulcino e li hanno coltivati per diverse ore. Successivamente, le colture sono state passate a mezzi contenenti perli proteiche. Le immagini confocali time-lapse dopo l’incubazione con anticorpi etichettati hanno rivelato che le proteine sulle perle promuovevano la crescita di proiezioni da corpi cellulari neuronali.

Hai appena visto l’introduzione di JoVE alla biologia dello sviluppo molecolare. In questo video, abbiamo esaminato la storia della ricerca sulla biologia dello sviluppo molecolare e introdotto le domande chiave poste dai biologi dello sviluppo. Abbiamo anche esplorato importanti strategie di ricerca e discusso alcune delle loro attuali applicazioni. Come sempre, grazie per aver guardato!

Transcript

Studies in the field of molecular developmental biology provide insight about the changes that occur at the cellular level during differentiation and development. Researchers examine the physical and chemical mechanisms that regulate cell functions. This helps in understanding how cells give rise to specialized tissues within the maturing embryo, and how defects at the molecular level can lead to disease states.

This video presents a brief history of molecular developmental biology, introduces key questions asked by scientists in this field, describes some tools available to answer those questions, and discusses a few current lab applications.

Let’s start by reviewing some landmark studies in the history of molecular developmental biology research.

In 1957, Conrad Waddington published a book entitled “The Strategy of the Genes” in which he tried to explain how cell fate is decided. Based on previously conducted tissue transplantation studies, he presented a conceptual model describing that a cell is like a marble rolling down a hill, and the path it takes to reach the bottom will determine its final differentiated state. This idea that distinct cell types arise from undifferentiated cells receiving different signals during development became known as the “epigenetic landscape.”

Around the same time, Rita Levi-Montalcini and Stanley Cohen observed that transplanting tumors into chick embryos led to rapid neuron growth. They hypothesized that a substance secreted by the tumors caused this growth, and identified the protein as nerve growth factor, or NGF. Soon after that, Cohen discovered another growth factor that was secreted by mouse salivary gland and promoted the growth of epithelial cells. He identified this protein as epidermal growth factor, or EGF.

Later, in 1969, Lewis Wolpert proposed a theory about how a certain class of signaling molecules, known as morphogens, act directly on cells to induce specific responses at varying concentrations. He used colors of the French flag to model cell states, red serving as the default state when no signal is present. From there, low morphogen concentrations, shown in white, might activate one gene, while high morphogen concentrations, shown in blue, might activate a different gene.

Expanding on this work, in 1988 Christiane Nusslein-Volhard identified the first known morphogen by conducting genetic screens on flies. She used antibodies to show that a protein, known as Bicoid, forms a concentration gradient along the anterior-posterior axis of the developing embryo, and controls the expression of genes important for organizing the head and thorax regions.

During the early 1990s, Peter Lawrence and Ginés Morata used their own work in flies to expand the theory of morphogen gradients. They hypothesized that one set of cells is responsible for organizing one particular compartment of the organism. As development proceeds, molecular signals instruct those cells to divide and construct more compartments, continuing until the whole organism is formed.

Now that we have reviewed some historical highlights, let’s examine a few fundamental questions asked by current developmental biologists.

To begin, some researchers focus on identifying the molecules that regulate development. For example, they might study individual, or combinations of, growth factors shown to cause a specific cell response, such as differentiation or migration.

Other developmental biologists investigate how these molecules regulate the developmental process. They might study how the concentration of a molecular signal can instruct a cell to differentiate or migrate. They also ask about how cells communicate with other nearby cells, and look at signaling molecules which diffuse over a short distance and act locally, known as paracrine factors.

Finally, some developmental biologists want to understand about how cells respond to external signals. They may study changes inside the cell itself, such as increases or decreases in the expression of particular genes, by looking at levels of their encoded proteins. Others focus on external changes, such as alterations in cell shape or size.

Now that you have a feel for key questions asked by molecular developmental biologists, let’s look at some of the techniques they use to find answers to these questions.

Staining is one of the most widely used approaches to investigate gene expression patterns, and to identify the molecules that regulate development.

Immunohistochemistry is a staining technique that uses antibodies conjugated to chemical or fluorescent reporters to label proteins. Visualization of proteins by fluorescence microscopy offers insights about their localization in tissue sections, and also their potential contributions to cellular structures. Whole-mount in situ hybridization is an alternative staining method, which uses labeled DNA or RNA oligonucleotides to look at patterns of gene expression in three-dimensional tissues.

Explant culture is another commonly used approach in this field to study the mechanisms by which external stimuli act. In this technique, a tissue is removed from the natural site of growth and grown in culture. Specific growth conditions, such as the substrate on the culture plates or growth factors added to the culture media, can then be examined for their effects on developing cells and tissues.

Live cell imaging is used to analyze cell responses to developmental stimuli. In vitro cultures are well-suited for capturing cell movements and localization patterns in real time. Stained or fluorescently labeled cells can also be tracked in vivo using time-lapse microscopy.

Frequently, cells from a tissue of interest are transplanted from a donor to a host organism, and then monitored over the course of development.

Now that you’re familiar with some general laboratory methods, let’s look at some applications of molecular developmental biology research.

One approach to determining the role specific gene products play in development is to alter their expression by external means. In this experiment, antisense oligonucleotides called morpholinos were injected to knockdown two zebrafish genes important for proper inner ear development. Immunostaining of structural proteins showed that embryos with reduced gene expression exhibit fewer neurons and hair cells within the inner ear compared to the controls.

Another application of molecular developmental biology is to figure out when and where genes are expressed, to better understand how their encoded proteins may function. Researchers in this experiment used fluorescently labeled RNA probes complementary to two target transcripts in order to identify cells transcribing one or both genes of interest.

Some scientists use explant cultures to analyze cell responses under various conditions. In this experiment, investigators dissected sensory neurons from the inner ear of chick embryos and cultured them for several hours. Next, cultures were switched to media containing protein beads. Time-lapse confocal images following incubation with labeled antibodies revealed that proteins on the beads promoted the growth of projections from neuron cell bodies.

You’ve just watched JoVE’s introduction to molecular developmental biology. In this video, we have reviewed the history of molecular developmental biology research, and introduced key questions asked by developmental biologists. We also explored prominent research strategies, and discussed some of their current applications. As always, thanks for watching!

Tags

Valore vuoto Problema