Generazione di culture geneticamente modificate pelle organotipiche Uso devitalizzate derma umano

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di generare colture cutanee organotipiche geneticamente modificate utilizzando derma umano rivitalizzato per determinare l'impatto dell'espressione genica alterata sulla crescita e la differenziazione epidermica. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della dermatologia, come determinare quali geni sono responsabili della crescita epitopica, della differenziazione e della progressione verso la malattia. Il vantaggio principale di questa tecnica è che la pelle umana geneticamente modificata viene generata in pochi giorni, il che consente lo studio di campioni umani potenzialmente clinicamente rilevanti.

La dimostrazione della procedura sarà tintinnante dal mio laboratorio. Se si riceve pelle umana congelata, posizionare il tessuto nella cappa di coltura tissutale per tre-cinque minuti per scongelarlo. Una volta scongelato, trasferire il tessuto in una provetta conica sterile da 50 millilitri o in un flacone da 125 millilitri, a seconda delle dimensioni.

Quindi, aggiungi quattro x penicillina e streptomicina in un XPBS fino a quando il contenitore non è pieno al 75%. Tappare il contenitore e agitare energicamente per cinque minuti. Rimuovere la soluzione antibiotica e ripetere l'operazione.

Passaggio altre tre volte dopo l'ultimo lavaggio, trasferire il fazzoletto in un nuovo contenitore e aggiungere una nuova soluzione antibiotica. Incubare questa miscela in un incubatore di coltura tissutale a 37 gradi Celsius per due settimane per consentire la separazione del derma dall'epidermide. Trascorse due settimane, usa una pinza per staccare l'epidermide dal derma.

Scartare l'epidermide secondo il protocollo dell'istituto per la gestione dei tessuti umani. Porre il derma in un contenitore di soluzione antibiotica e lavare agitando energicamente come prima. Dopo l'ultimo lavaggio, trasferire il derma in un nuovo contenitore di soluzione antibiotica e conservarlo a quattro gradi Celsius fino al momento dell'uso il giorno prima della trasfezione delle cellule di fenice in un terreno completo in una piastra a sei pozzetti a una densità di 800.000 cellule per pozzetto.

Il giorno della trasfezione, mescolare sei microlitri di reagente di trasfezione con 100 microlitri di dmm. Per ogni pozzetto da trasfettare e incubare a temperatura ambiente Per cinque minuti, aggiungere la miscela in una provetta contenente tre microgrammi di vettore retrovirale per ogni pozzetto da trasfettare e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti, aggiungere l'intera miscela goccia a goccia in ciascun pozzetto delle cellule fenice e incubare le cellule durante la notte il giorno dopo la trasfezione. Rimuovere il terreno dalle cellule della fenice e aggiungere due millilitri di terreno completo fresco lo stesso giorno.

Risospendere i cheratinociti umani primari in terreno privo di siero di cheratinociti con antibiotici e seminare in sei piastre a parete a una densità di 75.000 cellule per pozzetto. Il giorno seguente, raccogli il terreno che ora contiene particelle virali dalle cellule di Phoenix trasfettate. Passare il mezzo attraverso un filtro da 0,45 micron utilizzando una siringa per rimuovere eventuali cellule contaminanti.

Aggiungere cinque microgrammi per millilitro di bromuro di esadimetile al terreno filtrato contenente il virus per aiutare a mediare il processo di infezione. Quindi pipettare due millilitri di virus sui cheratinociti placcati il giorno precedente. Quindi, centrifugare le sei piastre a parete in una centrifuga a 200 Gs per un'ora a temperatura ambiente.

Dopo la centrifuga, rimuovere ed eliminare il supporto contenente il virus. Lavare le celle una volta con un XPBS e poi aggiungere K-C-S-F-M fresco il giorno successivo. Infettare lo stesso lotto di cheratinociti con il virus utilizzando la procedura appena mostrata.

Per realizzare cassette organotipiche. Utilizzare un cauterizzatore per rimuovere un quadrato di un centimetro per un centimetro dal centro del coperchio di una piastra di coltura tissutale da 3,5 centimetri. Attacca i pioli quadrati alla parte inferiore della cassetta usando lo smalto trasparente e attendi cinque minuti affinché lo smalto si asciughi.

Infine, capovolgi la cassetta e posizionala in un piatto da sei centimetri con una cassetta appoggiata sui pioli. Recupera il derma da un deposito a quattro gradi Celsius e trasferiscilo in un contenitore di crescita dei cheratinociti. Medio da lavare.

Dopo aver ripetuto il lavaggio, posizionare il derma in KGM fresco e incubare a 37 gradi Celsius per due giorni. Dopo l'incubazione, utilizzare un bisturi per tagliare il derma in pezzi di 1,5 centimetri per 1,5 centimetri. Quindi posizionare sul foro quadrato dell'organotipico è fissato con la parte superiore del derma rivolta verso l'alto.

Usa una pinza per capovolgere l'intera cassetta organotipica contenente il derma. Aggiungere cinque gocce di matrice extracellulare appena assunta sul fondo del derma e agitare leggermente per garantire una distribuzione uniforme sul derma. Dopo aver lasciato solidificare la matrice extracellulare per cinque minuti, usa una pinza per capovolgere la cassetta, quindi aggiungi quattro millilitri di KGM al piatto di sei centimetri.

Successivamente, dopo aver raccolto e contato i cheratinociti geneticamente modificati, Resus sospende da 0,5 a 1 milione di cellule in 90 microlitri di KGM e dispensa le cellule sul derma. Incubare la co-coltura a 37 gradi Celsius. Cambia i media sulle culture a giorni alterni.

La stratificazione completa e la differenziazione dell'epidermide di solito si verificano dopo il quinto giorno. Il tessuto può essere raccolto fino a 14 giorni dopo la piastra. Questa immagine mostra la colorazione dell'ematina e dell'eosina dell'organotipico.

La pelle umana rigenerata contiene sia l'epidermide che il derma. L'epidermide è completamente stratificata e differenziata con quattro strati distinti, tra cui lo strato basale indifferenziato e i tre strati differenziati tra cui lo strato, lo spinoso, il rano e il corno. Queste immagini in immunofluorescenza dimostrano che la sovraespressione di SNA i due, come mostrato a destra, inibisce la differenziazione epidermica rispetto al tessuto di controllo mostrato a sinistra, colorando per la differenziazione.

La proteina cheratina uno o K uno è mostrata in verde e i nuclei sono contrassegnati in blu. L'analisi RTQ PCR R per misurare i livelli di mRNA di SNAI two nel controllo LAC Z e S NNA I two sovraesprimono il tessuto dimostra un'espressione superiore a 50 volte di SNAI two rispetto al controllo. Infine, questa analisi RTQ PCR R dimostra che la sovraespressione di SNA I 2 provoca la perdita di espressione di geni strutturali indotti dalla differenziazione come TGM one e SPRR one A.Seguendo questa procedura.

Altri metodi come la chipsy, l'immunofluorescenza, l'RN, l'ae o il western blotting possono essere eseguiti per determinare i meccanismi di crescita e differenziazione epidurale. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della dermatologia per esplorare come la funzione del gene alterato influisce sull'omeostasi della pelle. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare colture di pelle umana organica geneticamente modificate utilizzando cheratinociti e dev derma umano.