Name: Generazione di culture geneticamente modificate pelle organotipiche Uso devitalizzate derma umano (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Impara a generare culture di pelle organotipica geneticamente modificate utilizzando derma umano devitalizzato e cheratinociti epidermici. Questo metodo permette di studiare l'impatto dell'espressione genica alterata sulla crescita e differenziazione cutanea.

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Questo lavoro è stato supportedby l&#39;American Cancer Society Research Scholars Grant (RSG-12-148-01-DDC) e il Premio Biologia CIRM di base (RB4-05779).

Il protocollo pelle umana è stata effettuata in conformità con le linee guida della University of California, Ricerca Comitato Etico di San Diego. La pelle umana può essere ottenuto da campioni chirurgici scartati o comprato da banche della pelle (pelle banca è elencato nella tabella Materiali / Equipment). La posizione in cui la pelle è realizzata o età del donatore non è critico per l&#39;esperimento finché le proteine ​​membrana basale (collagene / laminina) nel derma non sono degradati. 1. Preparazione di devitalizzate derma umano <ol><li> Alla ricezione di pelle umana, posizionare il tessuto nella cappa coltura tissutale per scongelare (~ 3-5 min). A seconda delle dimensioni della pelle, posizionare il tessuto scongelato in un monouso tubo da 50 ml o 125 ml sterile bottiglia. La dimensione tipica della pelle da parte della banca pelle è di 0,75 mq. </li><li> Riempire il serbatoio pieno al 75% con 4x la penicillina e streptomicina (penna / strep) in PBS 1x. Agitare energicamente per5 min e smaltire il liquido. Ripetere questa operazione altre 3 volte. </li><li> Dopo l&#39;ultimo lavaggio, trasferire il tessuto in una nuova provetta / bottiglia e aggiungere 4x fresco pen / strep / PBS per riempire 75% del contenitore. Incubare questa miscela in un incubatore di coltura tissutale a 37 ° C per 2 settimane per consentire la separazione del derma dell&#39;epidermide. </li><li> In condizioni sterili, utilizzare una pinza a staccarsi l&#39;epidermide dal derma. Il derma è completamente bianco, mentre l&#39;epidermide avranno colorazione a seconda della razza del donatore (Figura 1A). Eliminare l&#39;epidermide secondo il protocollo dell&#39;istituzione per affrontare con i tessuti umani. </li><li> Posizionare il derma in un tubo o bottiglia e lavarlo in 4x penna / strep diluito in PBS 1x con vigorosi tremanti (5 min lavaggi per 4 volte). Dopo l&#39;ultimo lavaggio, trasferire il derma in una nuova provetta / bottiglia in 4x penna / strep diluito in PBS 1x e conservare a 4 ° C fino al momento dell&#39;uso. Derma possono essere conservati a 4 ° C per un massimo di un anno. </li></ol&gt; 2. modificare geneticamente cheratinociti umani primari NOTA: utilizzare le cellule phoenix amphotropic cresciute nei media DMEM completo [DMEM + 10% siero bovino fetale (FBS) + pen / strep] per la produzione di virus per infettare cheratinociti umani primari. Geni imballaggio virali che codificano proteine ​​come gag-pol e busta sono stabilmente integrati nel genoma della cellula Phoenix che consente la produzione di virus quando trasfettate con un vettore retrovirale. Phoenix cellule possono essere transfettate con alta efficienza che consente un&#39;elevata produzione titolo virale. Virus prodotto da questa linea di confezionamento può infettare una grande varietà di cellule di mammiferi compreso umana. <ol><li> 1 ° giorno: Il giorno prima trasfezione, le cellule fenice seme in un 6-pozzetti ad una densità di 800.000 cellule per pozzetto nei media DMEM completo. </li><li> Giorno 2: Il giorno della transfezione, utilizzare 3 mg di vettori retrovirali per pozzetto. Aliquotare 3 mg di vettore retrovirale in una provetta da 1,5 ml. Utilizzare un mix di 100 μ; l DMEM più 6 ml di reagente di trasfezione per ogni 3 mg di vettore. Mescolare 6 ml di reagente di trasfezione con 100 microlitri DMEM in una provetta da 1,5 ml. (I vettori retrovirali che vengono utilizzati sono elencati nella tabella attrezzature / materiali). <ol><li> Incubare per 5 minuti e aggiungere il composto di 106 microlitri nel tubo pre-aliquotati contenente 3 mg di vettore retrovirale. Mescolare e incubare a temperatura ambiente per 30 min. Aggiungere questa intera miscela gocce a ciascun pozzetto di cellule Phoenix. </li></ol></li><li> 3 ° giorno: Il giorno dopo la trasfezione, rimuovere il supporto dalle cellule phoenix e aggiungere 2 ml di fresco supporto completo DMEM. Lo stesso giorno, seminare cheratinociti umani primari in 6 pozzetti ad una densità di 75.000 cellule per pozzetto. Mantenere i cheratinociti in un mezzo di siero cheratinociti gratuito (KCSFM) con antibiotici (penna / strep). NOTA: cheratinociti umani primari sono stati acquistati. Le cellule possono essere acquistati da una varietà di fornitori (elencati nella tabella Materiali / Equipment). </li><li> 4 ° giorno: Harconferire al supporto dalle cellule trasfettate fenice, che ora contiene particelle virali. Far passare il materiale attraverso un filtro da 0,45 micron con una siringa (per rimuovere tutte le cellule fenice contaminanti) e posizionare 2 ml sulle cheratinociti (placcato a 75.000 cellule / pozzetto del giorno precedente: vedere il punto 2.3). Aggiungere hexadimethrine bromuro (5 mg / ml) per i media per aiutare a mediare il processo di infezione. Titoli virali sono ~ 1 x 10 7 TU / ml. <ol><li> Spin piastre da 6 pozzetti in una centrifuga a 200 xg per 1 ora a RT. Dopo lo spin, rimuovere i supporti contenenti virus e lavare le cellule una volta con PBS 1x prima di aggiungere KCSFM. </li></ol></li><li> 5 ° giorno: infettare la stessa partita di cheratinociti di nuovo come al punto 2.4. NOTA: Selezionare i cheratinociti usando un farmaco, se vi è un marcatore sul vettore retrovirale ed espandere per l&#39;uso in analisi a valle o applicazioni come colture organotipiche. </li></ol> 3. Configurazione Culture pelle organotipiche <ol><li> Costruire ilcassetta organotipica da materiali comuni che si trovano in laboratorio o le cassette può essere personalizzato attraverso un negozio di fabbricazione di metallo (Figura 2A - F). Per rendere queste cassette da una piastra di coltura tissutale 3.5 cm, utilizzare un bisturi per rimuovere un 1,0 cm x 1,0 cm quadrato dal centro del coperchio di un piatto 3.5 cm (Figura 2A-B). Fate questo in condizioni di sterilità. <ol><li> Attaccare pioli quadrati sul fondo della cassetta (coperchio di 3.5 cm piatto) utilizzando smalto trasparente (Figura 2C). Lasciare 5 minuti per lo smalto si asciughi e capovolgere la cassetta sopra in modo che poggi sui pioli quadrati (Figura 2D). Posizionare la cassetta in un piatto 6 centimetri. NOTA: Piazza pioli possono essere acquistati da una varietà di arti e botteghe artigiane. </li></ol></li><li> Preparare terreno di crescita dei cheratinociti (KGM) composto da 66% DMEM, il 22% F12 Ham, 100 unità / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina, il 10% FBS, 2,67 mg / ml di adenina, 40 ng / ml idrocortisone, 10 ng tossina colerica ml /, 4,94 mg / ml di insulina, 5 mg / ml transferrina, 1.36 ng / ml triiodo-L-tironina, 10 ng / ml EGF, e 10 ug / ml cloridrato ciprofloxacina. Filtrare il mezzo attraverso un filtro e conservare 0,22 micron a 4 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Prendere il derma dalla 4x pen / strep + soluzione PBS e lavare 2 volte in KGM e incubare in KGM a 37 ° C per due giorni prima dell&#39;uso. </li><li> Tagliare il derma con un bisturi a 1,5 cm x 1,5 cm pezzi di dimensioni e quindi posizionare sul vassoio organotipica. Posizionare il derma con la parte superiore del derma rivolte verso l&#39;alto. La parte superiore del derma sarà il lato che viene a contatto con i cheratinociti (Figura 1B). </li><li> Posizionare il derma pretagliati sul foro quadrato della cassetta organotipiche con il lato superiore del derma rivolti verso l&#39;alto (Figura 3A). </li><li> Capovolgere l&#39;intera cassetta organotipica contenente oltre il derma con pinze (Figura 3B). Scongelare la soluzione matrice extracellulare sul ghiaccio. Usare un ago e la siringa a tirar fuori 100 ml di soluzione di matrice extracellulare per cassetta. Aggiungere 5 gocce al fondo del derma (lato lucido) e agitare leggermente per assicurare una distribuzione derma (Figura 3B). </li><li> Lasciare 5 minuti per la soluzione matrice extracellulare commerciale a solidificare completamente (Figura 3C). Dopo la solidificazione, utilizzare pinze per capovolgere il cassetto sopra. Aggiungere 4 ml di KGM al piatto 6 cm. </li><li> Posizionare 0,5-1 milioni di cheratinociti geneticamente modificati sulle cassette organotipiche contenenti il derma (Figura 3D). <ol><li> Trypsinize cheratinociti mettendo 4 ml di 0,05% tripsina su piastre di 10 cm per 5 minuti e spegnere con 4 ml di mezzi DMEM completo. </li><li> Contare i cheratinociti utilizzando un emocitometro e poi spin down a 200 xg per 5 min. Risospendere 0.5-1 milioni cellule (a seconda del numero di cellule disponibili) in 90 μl di KGM e posizionare tutte le cellule sulle derma. NOTA: È importante posizionare lo stesso numero di celle sul derma nello stesso esperimento per garantire che eventuali differenze rilevate spessore dell&#39;epidermide rigenerata non è dovuta a differenze nel numero iniziale di cellule. Posizionamento di meno di 0,5 milioni di cellule sul derma può portare a poveri stratificazione e la differenziazione. </li></ol></li><li> Modificare i media KGM sulle culture organotipiche ogni altro giorno. Tessuto raccolto 1-14 giorni dopo il posizionamento dei cheratinociti sulle derma. Stratificazione e la differenziazione completa dell&#39;epidermide avviene di solito dopo giorno 5. </li></ol>

<ol><li>Tadeu, A. M., Horsley, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+stem+cells+in+adult+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Current+topics+in+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Epithelial stem cells in adult skin.</a> Current topics in developmental biology. 107, 107-131 (2014).</li>
<li>Sen, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remembering+one%27s+identity%3A+the+epigenetic+basis+of+stem+cell+fate+decisions%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Remembering one's identity: the epigenetic basis of stem cell fate decisions.</a> FASEB J. 25, 2123-2128 (2011).</li>
<li>Segre, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+barrier+formation+and+recovery+in+skin+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Epidermal barrier formation and recovery in skin disorders.</a> J Clin Invest. 116, 1150-1158 (2006).</li>
<li>Eckert, R. L., Sturniolo, M. T., Broome, A. M., Ruse, M., Rorke, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transglutaminase+function+in+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Transglutaminase function in epidermis.</a> J Invest Dermatol. 124, 481-492 (2005).</li>
<li>Lopez-Pajares, V., Yan, K., Zarnegar, B. J., Jameson, K. L., Khavari, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+pathways+in+disorders+of+epidermal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetic pathways in disorders of epidermal differentiation.</a> Trends Genet. 29, 31-40 (2013).</li>
<li>Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+differentiation%3A+the+bare+essentials%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Epidermal differentiation: the bare essentials.</a> J Cell Biol. 111, 2807-2814 (1990).</li>
<li>Green, H., Kehinde, O., Thomas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+cultured+human+epidermal+cells+into+multiple+epithelia+suitable+for+grafting%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Growth of cultured human epidermal cells into multiple epithelia suitable for grafting.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76, 5665-5668 (1979).</li>
<li>Khavari, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+cancer+in+human+skin+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Modelling cancer in human skin tissue.</a> Nat Rev Cancer. 6, 270-280 (2006).</li>
<li>Parenteau, N. L., Bilbo, P., Nolte, C. J., Mason, V. S., Rosenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+organotypic+culture+of+human+skin+keratinocytes+and+fibroblasts+to+achieve+form+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">The organotypic culture of human skin keratinocytes and fibroblasts to achieve form and function.</a> Cytotechnology. 9, 163-171 (1992).</li>
<li>Oh, J. W., Hsi, T. C., Guerrero-Juarez, C. F., Ramos, R., Plikus, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+skin+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Organotypic skin culture.</a> J Invest Dermatol. 133, e14(2013).</li>
<li>Sen, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZNF750+Is+a+p63+Target+Gene+that+Induces+KLF4+to+Drive+Terminal+Epidermal+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">ZNF750 Is a p63 Target Gene that Induces KLF4 to Drive Terminal Epidermal Differentiation.</a> Dev Cell. 22, 669-677 (2012).</li>
<li>Sen, G. L., Webster, D. E., Barragan, D. I., Chang, H. Y., Khavari, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+differentiation+in+a+self-renewing+mammalian+tissue+by+the+histone+demethylase+JMJD3%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Control of differentiation in a self-renewing mammalian tissue by the histone demethylase JMJD3.</a> Genes Dev. 22, 1865-1870 (2008).</li>
<li>Mistry, D. S., Chen, Y., Wang, Y., Zhang, K., Sen, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNAI2+controls+the+undifferentiated+state+of+human+epidermal+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">SNAI2 controls the undifferentiated state of human epidermal progenitor cells.</a> Stem Cells. 32, 3209-3218 (2014).</li>
<li>Truong, A. B., Kretz, M., Ridky, T. W., Kimmel, R., Khavari, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p63+regulates+proliferation+and+differentiation+of+developmentally+mature+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">p63 regulates proliferation and differentiation of developmentally mature keratinocytes.</a> Genes Dev. 20, 3185-3197 (2006).</li>
<li>Kretz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+somatic+tissue+differentiation+by+the+long+non-coding+RNA+TINCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Control of somatic tissue differentiation by the long non-coding RNA TINCR.</a> Nature. 493, 231-235 (2013).</li>
<li>Ridky, T. W., Chow, J. M., Wong, D. J., Khavari, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasive+three-dimensional+organotypic+neoplasia+from+multiple+normal+human+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Invasive three-dimensional organotypic neoplasia from multiple normal human epithelia.</a> Nat Med. 16, 1450-1455 (2010).</li>
<li>Mistry, D. S., Chen, Y., Sen, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progenitor+function+in+self-renewing+human+epidermis+is+maintained+by+the+exosome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Progenitor function in self-renewing human epidermis is maintained by the exosome.</a> Cell Stem Cell. 11, 127-135 (2012).</li>
<li>Kretz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+progenitor+differentiation+requires+the+long+noncoding+RNA+ANCR%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Suppression of progenitor differentiation requires the long noncoding RNA ANCR.</a> Genes Dev. 26, 338-343 (2012).</li>
<li>Mulder, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+epigenetic+strategies+interact+to+control+epidermal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Diverse epigenetic strategies interact to control epidermal differentiation.</a> Nat Cell Biol. 14, 753-763 (2012).</li>
<li>Boxer, L. D., Barajas, B., Tao, S., Zhang, J., Khavari, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZNF750+interacts+with+KLF4+and+RCOR1%2C+KDM1A%2C+and+CTBP1%2F2+chromatin+regulators+to+repress+epidermal+progenitor+genes+and+induce+differentiation+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">ZNF750 interacts with KLF4 and RCOR1, KDM1A, and CTBP1/2 chromatin regulators to repress epidermal progenitor genes and induce differentiation genes.</a> Genes Dev. 28, 2013-2026 (2014).</li>
<li>Jameson, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IQGAP1+scaffold-kinase+interaction+blockade+selectively+targets+RAS-MAP+kinase-driven+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">IQGAP1 scaffold-kinase interaction blockade selectively targets RAS-MAP kinase-driven tumors.</a> Nat Med. 19, 626-630 (2013).</li>
<li>Mistry, D. S., Chen, Y., Wang, Y., Sen, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+profiling+of+SNAI2+regulated+genes+in+primary+human+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics+data%22%5BJournal%5D)">Transcriptional profiling of SNAI2 regulated genes in primary human keratinocytes.</a> Genomics data. 4, 43-46 (2015).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339, 823-826 (2013).</li>
<li>Doebis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+vitro+transduction+of+epithelial+cells+and+keratinocytes+with+improved+adenoviral+gene+transfer+for+the+application+in+skin+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Transpl+immunol%22%5BJournal%5D)">Efficient in vitro transduction of epithelial cells and keratinocytes with improved adenoviral gene transfer for the application in skin tissue engineering.</a> Transpl immunol. 9, 323-329 (2002).</li>
<li>Melo, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+correction+of+junctional+epidermolysis+bullosa+by+a+highly+recombinogenic+AAV+variant%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Somatic correction of junctional epidermolysis bullosa by a highly recombinogenic AAV variant.</a> Mol Ther. 22, 725-733 (2014).</li>
<li>Nanba, D., Matsushita, N., Toki, F., Higashiyama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+expansion+of+human+keratinocyte+stem%2Fprogenitor+cells+carrying+a+transgene+with+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cell+res+ther%22%5BJournal%5D)">Efficient expansion of human keratinocyte stem/progenitor cells carrying a transgene with lentiviral vector.</a> Stem cell res ther. 4, 127(2013).</li>
<li>Sen, G. L., Reuter, J. A., Webster, D. E., Zhu, L., Khavari, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNMT1+maintains+progenitor+function+in+self-renewing+somatic+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">DNMT1 maintains progenitor function in self-renewing somatic tissue.</a> Nature. 463, 563-567 (2010).</li>
<li>Shamir, E. R., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+organotypic+culture%3A+experimental+models+of+mammalian+biology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 647-664 (2014).</li>
<li>Krejci, N. C., Cuono, C. B., Langdon, R. C., McGuire, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+reconstitution+of+skin%3A+fibroblasts+facilitate+keratinocyte+growth+and+differentiation+on+acellular+reticular+dermis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">In vitro reconstitution of skin: fibroblasts facilitate keratinocyte growth and differentiation on acellular reticular dermis.</a> J Invest Dermatol. 97, 843-848 (1991).</li>
<li>Mathes, S. H., Ruffner, H., Graf-Hausner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+skin+models+in+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">The use of skin models in drug development.</a> Adv Drug Deliv Rev. 69-70, 81-102 (2014).</li>
</ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

La manipolazione genetica in pelle umana colture organotipiche offrono molti vantaggi a comunemente studiato 2D cellule in coltura e modelli di mouse. Culture 2D mancano i tre cellula-cellula e cellula-matrice extracellulare interazioni dimensionali si trovano in tessuti e organi intatti. Recenti studi hanno anche trovato enormi differenze tra le colture di cellule tumorali della pelle 2D e 3D con le cellule in coltura 3D che mostra molto di più somiglianze di espressione genica per la pelle umana primaria tumori 1...

L&#39;epidermide umana è un epitelio stratificato che si collega al derma sottostante attraverso una matrice extracellulare noto come l&#39;epidermide zone.The membrana basale non serve solo come una barriera impermeabile per evitare la perdita di umidità, ma anche come una prima linea di difesa per proteggere la corpo dalle sostanze estranee e tossiche 1. Lo strato basale, che è lo strato più profondo dell&#39;epidermide, contiene le cellule staminali epidermiche e progenitrici che danno luogo alla progenie differenziata che formano il resto dell&#39;epidermide 2. Come le cellule progenitrici epidermiche differenziano migrano verso l&#39;alto per formare il primo strato di cellule differenziate note come strato spinoso 3. Nello strato spinoso, cellule attivano l&#39;espressione di cheratine 1 e 10, che quindi fornisce la forza di resistere allo stress fisico per gli strati differenziati dell&#39;epidermide. Come le cellule strato spinoso ulteriormente differenziano, si muovono verso l&#39;alto nell&#39;epidermide a perm strato granulare che è caratterizzata dalla formazione di keratohyalin e lamellari granuli così come proteine ​​strutturali che vengono assemblati sotto la membrana plasmatica. Poiché le cellule procedere nel processo di differenziazione, le proteine ​​sotto la membrana plasmatica sono trasversali collegati tra loro, mentre i granuli vengono estrusi lamellari dalle cellule per formare una barriera lipidica ricco chiamato strato corneo 4. Malattie che coinvolgono alterazioni nella crescita epidermico e impatto differenziazione ~ 20% della popolazione 5. Così, la comprensione dei meccanismi di questo processo è di grande importanza. Dal momento che la manifestazione di molte di queste malattie è subordinato cellula-cellula o cellula-matrice contatto, colture organotipiche dove l&#39;epidermide umana è ricostituito in un ambiente 3D sono stati creati 6-10. Questi metodi tipicamente comportano l&#39;uso di cheratinociti primari o trasformati seminate su matrice extracellulare come devitalizzati umanaderma, Matrigel o collagene. Per comprendere gene meccanismi di regolamentazione che sono importanti nella crescita e differenziazione epidermica, cheratinociti possono essere geneticamente manipolati tramite vettori retrovirali per atterramento o iperespressione di geni nella cultura 2D e poi ricostituito in 3D. Questi metodi sono stati ampiamente utilizzati per caratterizzare i geni coinvolti nella epidermica staminali e cellule progenitrici auto-rinnovamento e la differenziazione, nonché la progressione di neoplasia 11-21. Qui, è previsto un protocollo approfondito su come modificare l&#39;espressione genica in colture organotipiche epidermiche attraverso l&#39;uso di retrovirus.

<table><tbody><tr><td>Pelle umana</td><td>New York Firefighters Skin Bank</td><td><a href="http://www.cornellsurgery.org/pro/services/burn-surgery/skin-bank.html">http://www.cornellsurgery.org/pro/services/burn-surgery/skin-bank.html</a></td><td></td></tr><tr><td>PEN/STREP</td><td>GIBCO</td><td>15140-122</td><td></td></tr> linee <tr><td>cellulari anfotropiche phoenix</td> Trasfezione <td>ATCC</td><td>CRL-3213</td><td></td></tr><tr><td>FUGENE 6 reagente</td><td>Promega</td><td>E2691</td><td></td></tr><tr><td>Cheratinociti Media (KCSFM)</td><td>Life Technologies</td><td>17005042</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>Ham's F12</td><td>Cambrex</td><td>12-615F</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Adenina</td><td>Sigma</td><td>A-9795</td><td></td></tr><tr><td>Tossina colera</td><td>Sigma</td><td>&nbsp; C-8052</td><td></td></tr><tr><td>Idrocortisone</td><td>Calbiochem</td><td>3896</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma</td><td>I-1882</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Invitrogen</td><td>13247-051</td><td></td></tr><tr><td>Transferrina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T-0665</td><td></td></tr><tr><td>Ciprofloxacina cloridrato</td><td>sierologia</td><td>89-001-1</td><td></td></tr><tr><td>cauterio</td><td>Bovie Medical Corporation</td><td>AA01</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>cheratina 1 anticorpo</td><td>Biolegend</td><td>PRB-149P</td><td></td></tr><tr><td>pioli quadrati Arti</td><td>e mestieri negozi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>umani cheratinociti neonatali</td><td>ATCC</td><td>PCS-200-010</td><td></td></tr><tr><td>cheratinociti neonatali umani</td><td>Applicazioni cellulari</td><td>102K-05n</td><td></td></tr><tr><td>MSCV vettore retrovirale</td><td>Clontech</td><td>634401</td><td></td></tr><tr><td>vettore retrovirale LZRS</td><td>Addgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pSuper.Retro.Puro vettore retrovirale</td><td>Oligoengine</td><td>VEC-PRT-0002&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>bromuro di esadimetrina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H9268-5G</td><td></td></tr></tbody></table>

generazione di culture geneticamente modificate pelle organotipiche uso devitalizzate derma umano

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

Colture organotipiche permettono la ricostituzione di un ambiente 3D critico per interazioni di contatto cellula-cellula e cellula-matrice che imita la funzione e la fisiologia dei loro omologhi dei tessuti in vivo. Questo è esemplificato da culture pelle organotipiche che riassume fedelmente la differenziazione epidermica e il programma di stratificazione. Cheratinociti epidermici primari umani sono geneticamente manipolabile attraverso retrovirus in cui i geni possono essere facilmente overexpressed o abbattuti. Questi cheratinociti geneticamente modificati possono poi essere utilizzati per rigenerare epidermide umana in colture organotipiche della pelle che forniscono un modello potente per studiare percorsi genetici di crescita epidermico impattante, la differenziazione e la progressione della malattia. I protocolli qui presentati descrivono metodi per preparare derma umano devitalizzati nonché manipolare geneticamente cheratinociti umani primari per generare culture organotipiche pelle. Pelle umana rigenerata può essere utilizzato in downstrapplicazioni EAM come il profilo di espressione genica, immunostaining, e immunoprecipitazioni cromatina seguiti da sequenziamento ad alta produttività. Così, la generazione di queste culture organotipiche pelle geneticamente modificati consentirà la determinazione di geni cruciali per mantenere l&#39;omeostasi della pelle.

Il primo passo nella generazione di pelle umana organotipica è rimuovere l&#39;epidermide dal derma. I due settimana incubazione della pelle a 37 ° C in 4x pen / strep / PBS dovrebbe consentire la separazione del derma dall&#39;epidermide (Figura 1A). Se la separazione dell&#39;epidermide e del derma è difficile posizionare il tessuto a 37 ° C a 4x penna / strep / PBS per un&#39;altra settimana e poi provare di nuovo peeling con pinze. Una delle chiavi per rigenerare il derm...

L'obiettivo di questo articolo è fornire un protocollo completo e dettagliato su come generare pelle organica umana geneticamente modificata da cheratinociti epidermici e derma umano devitalizzato.

Generazione di culture geneticamente modificate pelle organotipiche Uso devitalizzate derma umano

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

L'obiettivo generale di questa procedura è generare colture cutanee organotipiche geneticamente modificate utilizzando derma umano rivitalizzato, al fine di determinare l'impatto di un'espressione genica alterata sulla crescita e differenziazione epidermica. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della dermatologia, come identificare quali geni sono responsabili della crescita, della differenziazione e della progressione verso malattie. Il principale vantaggio di questa tecnica è che la pelle umana geneticamente modificata viene ottenuta in pochi giorni, consentendo lo studio di campioni umani potenzialmente rilevanti dal punto di vista clinico.La procedura sarà dimostrata da Jingly del mio laboratorio. Se si riceve pelle umana congelata, collocare il tessuto nell'incubatrice per colture cellulari per tre-cinque minuti per scongelarlo. Una volta scongelato, trasferire il tessuto in un tubo conico sterile da 50 millilitri o in un flacone da 125 millilitri, a seconda delle dimensioni.Successivamente, aggiungere quattro volte la penicillina e la streptomicina in un XPBS fino a quando il contenitore non è pieno al 75%. Chiudere il contenitore e agitare vigorosamente per cinque minuti. Rimuovere la soluzione antibiotica e ripetere questa operazione.Ripetere il passaggio altre tre volte dopo l'ultimo lavaggio, trasferire il tessuto in un nuovo contenitore e aggiungere una soluzione antibiotica fresca. Incubare questa miscela in un incubatore per colture cellulari a 37 gradi Celsius per due settimane, consentendo la separazione del derma dall'epidermide. Trascorse due settimane, utilizzare una pinzetta per staccare l'epidermide dal derma.Scartare l'epidermide secondo il protocollo dell'istituto per il trattamento dei tessuti umani. Posizionare il derma in un contenitore con soluzione antibiotica e lavare con agitazione vigorosa come in precedenza. Dopo l'ultimo lavaggio, trasferire il derma in un nuovo contenitore con soluzione antibiotica e conservare a quattro gradi Celsius fino al momento dell'uso, il giorno prima della trasfezione, seminando cellule phoenix in un piatto a sei pozzetti con mezzo completo a una densità di 800.000 cellule per pozzetto.Nel giorno della trasfezione, mescolare sei microlitri di reagente per la trasfezione con 100 microlitri di dmm. Per ogni pozzetto da trasfettare, incubare a temperatura ambiente per cinque minuti, quindi aggiungere la miscela a un tubo contenente tre microgrammi di vettore retrovirale per ogni pozzetto da trasfettare e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Aggiungere quindi l'intera miscela, goccia a goccia, in ciascun pozzetto contenente le cellule phoenix e incubare le cellule tutta la notte. Il giorno successivo alla trasfezione, rimuovere il mezzo dalle cellule phoenix e aggiungere due millilitri di mezzo completo fresco nello stesso giorno.Risospendere i cheratinociti umani primari in un mezzo privo di siero per cheratinociti con antibiotici e seminare in piastre a sei pozzetti a una densità di 75.000 cellule per pozzetto. Il giorno successivo, raccogliere il mezzo che ora contiene particelle virali provenienti dalle cellule Phoenix transfezionate. Filtrare il mezzo attraverso un filtro da 0,45 micron utilizzando una siringa per rimuovere eventuali cellule contaminanti.Aggiungere cinque microgrammi per millilitro di bromuro di esadimetilbenzammonio al mezzo filtrato contenente il virus per favorire il processo di infezione. Successivamente, pipettare due millilitri del virus sui cheratinociti seminati il giorno precedente. Poi, centrifugare le piastre a sei pozzetti a 200 G per un'ora a temperatura ambiente.Dopo la centrifugazione, rimuovere e scartare il mezzo contenente il virus. Lavare le cellule una volta con un XPBS e quindi aggiungere il mezzo K-C-S-F-M fresco il giorno seguente. Infettare lo stesso lotto di cheratinociti con il virus utilizzando la procedura appena illustrata.Per preparare cassette organotipiche. Utilizzare un bisturi elettrico per rimuovere un quadrato di un centimetro per un centimetro dal centro del coperchio di una piastra per colture cellulari da 3,5 centimetri. Fissare dei perni quadrati alla base della cassetta utilizzando smalto trasparente per unghie e lasciare asciugare per cinque minuti.Infine, capovolgere la cassetta e posizionarla in una piastra di sei centimetri con la cassetta appoggiata sui perni. Recuperare il derma dallo stoccaggio a quattro gradi Celsius e trasferirlo in un contenitore con mezzo di crescita per cheratinociti per il lavaggio.Dopo aver ripetuto il lavaggio, posizionare il derma in KGM fresco e incubare a 37 gradi Celsius per due giorni. Al termine dell'incubazione, utilizzare un bisturi per tagliare il derma in pezzi di dimensioni pari a 1,5 centimetri per 1,5 centimetri. Successivamente, posizionarli sul foro quadrato dell'organotipo, con la superficie superiore del derma rivolta verso l'alto.Utilizzare pinzette per capovolgere l'intero cassetto organotipico contenente il derma. Aggiungere cinque gocce di matrice extracellulare appena preparata sulla parte inferiore del derma e agitare leggermente per garantire una distribuzione uniforme sulla superficie del derma. Dopo aver lasciato solidificare la matrice extracellulare per cinque minuti, utilizzare le pinzette per riportare il cassetto nella posizione originale e quindi aggiungere quattro millilitri di KGM alla piastra da sei centimetri.Successivamente, dopo aver raccolto e contato i cheratinociti geneticamente modificati, risospendere da 0,5 a 1 milione di cellule in 90 microlitri di KGM ed aggiungere le cellule sul derma. Incubare la coltura in co-coltura a 37 gradi Celsius. Cambiare il mezzo di coltura ogni due giorni.La stratificazione completa e la differenziazione dell'epidermide si verificano di solito dopo il quinto giorno. Il tessuto può essere raccolto fino a 14 giorni dopo la semina. Questa immagine mostra la colorazione con ematossilina ed eosina di un organotipico.Le colture cutanee rigenerano un tessuto cutaneo umano che contiene sia l'epidermide che il derma. L'epidermide è completamente stratificata e differenziata, con quattro strati distinti, inclusi lo strato basale indifferenziato e i tre strati differenziati: lo strato spinoso, lo strato granuloso e lo strato corneo. Queste immagini di immunofluorescenza dimostrano che la sovraespressione di SNA i due, mostrata a destra, inibisce il differenziamento epidermico rispetto al tessuto di controllo mostrato a sinistra, evidenziato mediante colorazione per il differenziamento.La proteina cheratina uno o K uno è mostrata in verde e i nuclei sono marcati in blu. L'analisi RTQ PCR R per misurare i livelli di mRNA di SNAI due nei controlli LAC Z e nei tessuti con sovraespressione di S NNA I due dimostra una espressione superiore a 50 volte rispetto al controllo. Infine, questa analisi RTQ PCR R dimostra che la sovraespressione di SNA I due provoca la perdita di espressione di geni strutturali indotti dalla differenziazione, come TGM uno e SPRR uno A. Dopo questa procedura.Altri metodi come chipsy, immunofluorescenza, RN, ae o western blotting possono essere eseguiti per determinare i meccanismi della crescita e differenziazione epidurale. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della dermatologia per esplorare come l'alterazione della funzione genica influisca sull'omeostasi cutanea. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come generare colture organiche di pelle umana geneticamente modificate utilizzando cheratinociti e derma umano dev.

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Research

Ricerca

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

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Generazione di ricostruzioni organotipiche della pelle completa: una procedura per stabilire un modello di pelle 3D utilizzando campioni di pelle umana

Questo video descrive un protocollo dettagliato per la produzione di retrovirus ricombinanti di cheratinociti umani primari geneticamente modificati. Questo metodo può essere utilizzato per manipolare l'espressione genica nei cheratinociti.

Modificazione genetica dei cheratinociti umani primari: un metodo per manipolare geneticamente i cheratinociti utilizzando retrovirus ricombinanti

Questo protocollo video descrive una tecnica di coltura in vitro basata su cassetta per generare pelle organotipica umana utilizzando cheratinociti epidermici e derma umano devitalizzato. Imitano la funzione e la fisiologia delle loro controparti tissutali in vivo.

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Impara a generare culture di pelle organotipica geneticamente modificate utilizzando derma umano devitalizzato e cheratinociti epidermici. Questo metodo permette di studiare l'impatto dell'espressione genica alterata sulla crescita e differenziazione cutanea.

Generazione di culture geneticamente modificate pelle organotipiche Uso devitalizzate derma umano

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