Circoscritto capsulare Infarct Modeling usando una tecnica Photothrombotic
2 giugno 2016
Questo manoscritto descrive una tecnica di modellazione di capsulare infarto. Qui abbiamo utilizzato una tecnica photothrombotic modificato con bassa intensità della luce dopo la mappatura di destinazione pre-intervento chirurgico. Utilizzando questa tecnica, abbiamo creato un modello circoscritto infarto capsulare con disabilità motoria persistente.
L'obiettivo generale di questa tecnica è creare un modello di infarto capsulare circoscritto con un deficit motorio persistente, utilizzando la tecnica foto-trombotica. Prima di indurre l'infarto capsulare, è necessario identificare l'area dell'arto anteriore nella capsula interna introducendo un virus adeno-associato che esprime GFP nell'area dell'arto anteriore della corteccia motoria. Iniziare posizionando un ratto anestetizzato all'interno di un apparato stereotassico.
Poi rasare la testa del ratto e sterilizzare il cuoio capelluto utilizzando alcol al 70% e soluzione di povidone-iodio. Iniettare cloridrato di lidocaina al 2% sotto il cuoio capelluto nell'area della futura incisione per ridurre il dolore intraoperatorio. Applicare un unguento oftalmico per prevenire l'essiccamento degli occhi.
E posizionare un telo sterile sull'animale. Dopo aver praticato un'incisione mediana di due centimetri nel cuoio capelluto, posizionare il braccio stereotassico per identificare l'area del cortex motorio corrispondente all'arto anteriore in base alle coordinate stereotassiche. Praticare un foro di ingresso in questa posizione.
Spostare l'ago sul foro praticato e abbassare l'ago di un millimetro attraverso la dura madre fino alla corteccia motoria. Utilizzare una micropompa ad alta precisione per iniettare lentamente un microlitro di virus. Lasciare l'ago in posizione per ulteriori 10 minuti per prevenire il reflusso lungo il tratto dell'ago.
Trascorsi 10 minuti, ritirare lentamente l'ago. Dopo aver pulito la sede operatoria con irrigazione salina, chiudere la ferita con punto di sutura in nylon 3-0. Successivamente, rilasciare il ratto dal telaio stereotassico e trasferirlo in una camera di recupero per il monitoraggio.
Somministrare un analgesico per il controllo del dolore postoperatorio. Dopo due o tre settimane, sacrificare il ratto secondo metodi approvati e sezionare il cervello crioprotetto. Dopo la colorazione per GFP, osservare gli assoni transdotti da AAV-GFP nella capsula interna mediante microscopio a fluorescenza.
Confrontare le posizioni degli assoni trasdotti visibili nell'immagine fluorescente con l'atlante del cervello del ratto per determinare con precisione le coordinate stereotassiche degli assoni trasdotti. Per preparare l'interfaccia neurale ottica, utilizzare innanzitutto un trapano da taglio per recidere circa quattro centimetri di un ago spinale di calibro 27 contenente al suo interno un mandrino. Successivamente, rimuovere la guaina di dieci centimetri di una fibra ottica.
Inserire la sezione senza rivestimento della fibra ottica in un tubo metallico e fissare il tubo attorno alla fibra. Quindi utilizzare una pinza per serrare due volte la metà inferiore del tubo metallico.
Il tubo metallico riempie lo spazio tra la fibra ottica e il mozzo dell'ago spinale. Applicare una resina epossidica indurente al calore sulla fibra ottica. Applicare ulteriore resina epossidica nello spazio vuoto del mozzo.
Inserire la fibra ottica nell'ago spinale. Polimerizzare l'epossidico per 20 minuti a 100 gradi Celsius per garantire una fissazione stabile. Dopo la polimerizzazione, tagliare la fibra ottica che sporge dall'ago spinale e quindi utilizzare fogli diamantati per lucidare la fibra ottica all'estremità dell'ago spinale.
Infine, collegare la parte del connettore FCPC del cavo patch al giunto del sistema laser verde. Quindi utilizzare un misuratore digitale di potenza ed energia ottica per misurare l'intensità della luce proveniente dalla punta della fibra ottica, per garantire un'emissione di luce accurata. Posizionare un cuscinetto riscaldante sotto il corpo dell'animale per mantenere la temperatura corporea a 37,5 gradi Celsius durante l'intervento chirurgico.
Iniziare anestetizzando e preparando il ratto per l'intervento chirurgico come in precedenza. Dopo aver praticato un'incisione mediana di due centimetri, regolare l'altezza del morsetto nasale fino a quando il Bregma e il Lambda sono allineati allo stesso livello. L'allineamento corretto è fondamentale per mirare correttamente alla capsula interna.
Posizionare il braccio stereotassico per individuare il sito della fototrombosi. Successivamente, praticare un foro di due millimetri in questo punto. Poi, lucidare e pulire la punta della fibra ottica dell'ONI, quindi fissarla al telaio stereotassico senza piegarla.
Controllare la punta dell'ONI per assicurarsi che sia pulita e integra. Misurare l'intensità del laser alla punta della fibra ottica prima dell'inserimento dell'interfaccia ottica nel sito bersaglio del cervello del ratto. Regolare l'intensità del laser a 3,5 milliwatt alla punta della fibra ottica.
Ora, abbassare l'ONI nella zona bersaglio della capsula interna utilizzando la coordinata dorsoventrale determinata nella prima sezione del protocollo. Successivamente, iniettare due milligrammi per chilogrammo di Rose Bengal attraverso la vena della coda e quindi avviare un timer di conto alla rovescia impostato su un minuto. Trascorso il minuto, accendere il laser verde di 532 nano-metri per 90 secondi per creare l'infarto.
Dopo l'irradiazione, rimuovere delicatamente l'ONI dal cervello. Dopo aver pulito la sede operatoria, chiudere la ferita con un punto di sutura in nylon 3-0. Successivamente, rimuovere il ratto dal telaio stereotassico e trasferirlo in una camera di recupero.
Questa immagine mostra l'estensione delle lesioni da infarto in relazione a diverse intensità di luce laser, da due milliwatt a cinque milliwatt, due settimane dopo la lesione fotoindotta. Le frecce indicano la lesione da infarto. In questo contesto sperimentale, l'intensità della luce ottica è considerata compresa tra tre milliwatt e quattro milliwatt.
Le prossime due immagini mostrano l'aspetto microscopico dell'infarto capsulare tre settimane dopo la foto-trombosi. In questa sezione coronale del cervello del ratto, le punte di freccia indicano il percorso dell'ago contenente la fibra ottica nel talamo e fino alla capsula interna. Queste sezioni seriali consecutive colorate mostrano l'estensione della lesione da infarto nella capsula interna.
Le frecce indicano la lesione da infarto.
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Panoramica
Questo manoscritto descrive una tecnica di modellizzazione dell'infarto capsulare mediante una tecnica foto-trombotica modificata. Questo approccio consente la creazione di un modello di infarto capsulare circoscritto che determina un deficit motorio persistente.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Neurobiologia
- Danno motorio
Sfondo
- Gli infarti capsulari sono associati a deficit motori.
- Le tecniche fototrombotiche vengono utilizzate per indurre lesioni cerebrali localizzate.
- Comprendere i meccanismi del deficit motorio è fondamentale per lo sviluppo di strategie terapeutiche.
- La mappatura del bersaglio è essenziale per la creazione di un modello accurato.
Scopo dello studio
- Sviluppare un modello affidabile di infarto capsulare.
- Studiare gli effetti degli infarti capsulari sulla funzione motoria.
- Utilizzare una tecnica foto-trombotica modificata per un indirizzamento preciso.
Metodi Utilizzati
- Identificazione dell'area degli arti anteriori nella capsula interna mediante virus adeno-associato esprimente GFP.
- Preparazione del ratto mediante anestesia e posizionamento nel telaio stereotassico.
- Sterilizzazione del cuoio capelluto e preparazione dell'incisione.
- Iniezione di lidocaina per minimizzare il dolore intraoperatorio.
Risultati principali
- Creazione con successo di un modello di infarto capsulare circoscritto.
- Dimostrazione di un deficit motorio persistente dopo l'infarto.
- Convalida della tecnica foto-trombotica modificata.
- Stabilimento di un metodo riproducibile per studi futuri.
Conclusioni
- La tecnica foto-trombotica modificata è efficace per modellare infarti capsulari.
- Questo modello può essere utilizzato per studiare i deficit motori e potenziali interventi.
- Sono necessarie ulteriori ricerche per esplorare i meccanismi alla base dei deficit motori.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questa tecnica fototrombotica consente una modellizzazione precisa dell'ictus della sostanza bianca attraverso il targeting selettivo della capsula interna, risparmiando la sostanza grigia adiacente. L'infarto capsulare circoscritto risultante provoca deficit motori persistenti, fornendo un sistema rilevante per la malattia utile alla riduzione del rischio meccanicistica di candidati neuroterapeutici. Il modello supporta la validazione degli obiettivi e la valutazione preclinica di interventi mirati alla patologia della sostanza bianca, affrontando una lacuna critica nella ricerca sugli ictus.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche relative alla fisiopatologia dell'ictus della sostanza bianca.
- Valore operativo: Fornisce un sistema rilevante per la malattia per la validazione funzionale di bersagli nel circuito motorio.
- Valore predittivo: Supporta la riduzione del rischio meccanicistico collegando la localizzazione dell'infarto a un deficit motorio persistente.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Genera volumi di lesione quantificabili mediante titolazione dell'intensità ottica per la valutazione della risposta dose-dipendente.
- Valore operativo: Fornisce modelli di infarto altamente riproducibili con letture di deficit motorio costanti.
- Prontezza del saggio: Prepara sistemi biologici validati per lo screening di composti successivi in ambito di neuroprotezione o neuro-rigenerazione.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità Translazionale: Modella l'ictus della sostanza bianca a livello comportamentale, circuitale e cellulare per la validazione preclinica.
- Progressione Basata sul Rischio: Fornisce indicazioni per decisioni di avanzamento o interruzione dello sviluppo basate sulla specificità della lesione e sulla correlazione con l'esito funzionale.
- Allineamento dei Biomarcatori: Facilita la correlazione tra l'estensione dell'infarto e la gravità del deficit motorio per lo sviluppo di biomarcatori predittivi.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dall'identificazione del bersaglio fino ai test di efficacia preclinica, consentendo un affinamento iterativo delle strategie neuroterapeutiche.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sulla vulnerabilità della sostanza bianca e sulla compromissione circuito-specifica delle vie motorie.
- Screening: Permette la standardizzazione dei saggi attraverso un controllo preciso delle lesioni e una valutazione quantitativa dei deficit motori.
- Analisi: Fornisce misurazioni volumetriche dell'infarto e parametri comportamentali per l'analisi comparativa tra condizioni diverse.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati della scoperta alla continuità preclinica mediante la fenotipizzazione persistente dei deficit motori.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per la verifica iterativa di composti neuroprotettivi e riabilitativi.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva nell'interazione con il bersaglio grazie a un modello selettivo di infarto della sostanza bianca.
- Valore operativo: Standardizzazione e riproducibilità mediante calibrazione dell'intensità del laser e puntamento stereotassico.
- Valore strategico: Riduzione del rischio biologico in fase avanzata, consentendo una riduzione precoce dei rischi meccanicistici delle vie della sostanza bianca.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione dei composti aggiustata per il rischio, basata sulla capacità di attenuare deficit motori persistenti in un modello validato.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella somministrazione di vettori virali, chirurgia stereotassica e fabbricazione di interfacce neurali ottiche.
- È dipendente da strumentazione di precisione, inclusi telai stereotassici, microiniettori e sistemi laser calibrati.
- Necessita di standardizzazione tra i gruppi di lavoro per quanto riguarda la titolazione virale, la preparazione delle fibre ottiche e il monitoraggio postoperatorio.
- Le considerazioni per l'adattamento includono coordinate stereotassiche specifiche per specie e le proprietà ottiche della sostanza grigia rispetto a quella bianca.
- I limiti pratici comprendono la complessità chirurgica e la necessità di una validazione postoperatoria mediante istologia e analisi del comportamento.
