Circoscritto capsulare Infarct Modeling usando una tecnica Photothrombotic
2 giugno 2016
Questo manoscritto descrive una tecnica di modellazione di capsulare infarto. Qui abbiamo utilizzato una tecnica photothrombotic modificato con bassa intensità della luce dopo la mappatura di destinazione pre-intervento chirurgico. Utilizzando questa tecnica, abbiamo creato un modello circoscritto infarto capsulare con disabilità motoria persistente.
L'obiettivo generale di questa tecnica è quello di creare un modello di infarto capsulare circoscritto con una compromissione motoria persistente utilizzando la tecnica fototrombotica. Prima di creare l'infarto capsulare, è necessario identificare l'area degli arti anteriori nella capsula interna introducendo un virus adeno-associato che esprime GFP nell'area degli arti anteriori della corteccia motoria. Inizia inserendo un ratto anestetizzato in un telaio stereotassico.
Quindi radere la testa del ratto e sterilizzare il cuoio capelluto utilizzando alcol al 70% e soluzione di povidone e iodio. Iniettare il 2% di lidocaina cloridrato sotto il cuoio capelluto nell'area dell'incisione del cuoio capelluto prevista per ridurre il dolore intraoperatorio. Applicare un unguento oftalmico per prevenire la secchezza degli occhi.
E posiziona un drappo sterile sull'animale. Dopo aver praticato un'incisione sulla linea mediana di due centimetri nel cuoio capelluto, posizionare il braccio stereotassico per identificare l'area degli arti anteriori della corteccia motoria secondo le coordinate stereotassiche. Praticare un foro di ingresso in questa posizione.
Sposta l'ago nel foro praticato e abbassa l'ago di un millimetro attraverso la dura madre e nella corteccia motoria. Utilizzare una micropompa ad alta precisione per iniettare lentamente un microlitro di virus. Lasciare l'ago in posizione per altri 10 minuti per evitare che rifluisca lungo il tratto dell'ago.
Una volta trascorsi 10 minuti, ritirare lentamente l'ago. Dopo aver pulito il sito operatorio con irrigazione salina, fissare la ferita con sutura in nylon 3-0. Quindi rilasciare il ratto dal telaio stereotassico e trasferirlo in una camera di recupero per il monitoraggio.
Somministrare analgesico per il controllo del dolore postoperatorio. Dopo due o tre settimane, sacrificare il ratto secondo i metodi approvati e sezionare il cervello crioprotetto. Dopo la colorazione per GFP, osservare gli assoni trasdotti AAV-GFP nella capsula interna con un microscopio a fluorescenza.
Confrontare le posizioni degli assoni trasdotti come si vede nell'immagine fluorescente con l'atlante del cervello di ratto per determinare con precisione le coordinate stereotassiche degli assoni trasdotti. Per preparare l'interfaccia neurale ottica, utilizzare prima un trapano da taglio per tagliare circa quattro centimetri di un ago spinale calibro 27 con uno stiletto all'interno. Quindi spogliare 10 centimetri della giacca di una fibra ottica.
Inserire il pezzo non incamiciato della fibra ottica in un tubo metallico. E fissa il tubo attorno alla fibra. Quindi utilizzare un pressore per bloccare due volte la parte inferiore 1/2 del tubo metallico.
Il tubo metallico riempie lo spazio tra la fibra ottica e il mozzo dell'ago spinale. Applicare resina epossidica termopolimerizzabile sulla fibra ottica. Applicare ulteriore resina epossidica sullo spazio vuoto nel mozzo.
E inserire la fibra ottica nell'ago spinale. Polimerizzare la resina epossidica per 20 minuti a 100 gradi Celsius per un fissaggio stabile. Una volta indurita, scindere la fibra ottica che sporge dall'ago spinale e quindi utilizzare fogli diamantati per lucidare la fibra ottica sulla punta dell'ago spinale.
Infine, collegare la parte del connettore FCPC del cavo patch all'accoppiatore del sistema laser verde. Quindi utilizzare un misuratore di potenza ed energia ottica digitale per misurare l'intensità della luce dalla punta della fibra ottica per garantire un'emissione accurata della luce. Posizionare un cuscinetto termico sotto il corpo dell'animale per mantenere la temperatura corporea a 37,5 gradi Celsius durante l'intervento chirurgico.
Inizia anestetizzando e preparando il ratto per l'intervento chirurgico come prima. Dopo aver praticato un'incisione sulla linea mediana di due centimetri, regolare l'altezza del morsetto nasale fino a quando Bregma e Lambda non sono allineati allo stesso livello. Il corretto allineamento è fondamentale per indirizzare correttamente la capsula interna.
Posizionare il braccio stereotassico per localizzare il sito per la fototrombosi. Quindi praticare un foro di due millimetri a questo punto. Quindi, lucidare e pulire la punta della fibra ottica dell'ONI, quindi fissarla al telaio stereotassico senza piegarla.
Controlla la punta dell'ONI per assicurarti che sia pulita e intatta. Misurare l'intensità del laser dalla punta della fibra ottica prima dell'inserimento dell'interfaccia ottica nel sito target del cervello di ratto. Regolare l'intensità del laser a 3,5 milliwatt sulla punta della fibra ottica.
Ora, abbassare l'ONI nell'area target della capsula interna utilizzando la coordinata dorso-ventrale determinata nella prima sezione del protocollo. Quindi, iniettare due milligrammi per chilogrammo di Rose Bengal attraverso la vena della coda e quindi avviare un timer per il conto alla rovescia impostato su un minuto. Trascorso il minuto, accendi il laser verde a 532 nanometri per 90 secondi per creare l'infarto.
Dopo una radiazione, rimuovere delicatamente l'ONI dal cervello. Dopo aver pulito il sito operatorio, fissare la ferita con sutura di nylon 3-0. Quindi rimuovere il ratto dal telaio stereotassico e trasferirlo in una camera di recupero.
Questa immagine mostra l'estensione delle lesioni infartuali attraverso intensità variabili di luce laser da due milliwatt a cinque milliwatt due settimane dopo la lesione fototrombotica. Le frecce indicano la lesione infartuale. L'intensità ottica della luce è considerata compresa tra tre milliwatt e quattro milliwatt in questo contesto sperimentale.
Le due immagini successive mostrano l'aspetto microscopico dell'infarto capsulare tre settimane dopo la fototrombosi. In questa sezione coronale del cervello di ratto, le punte delle frecce indicano il tratto dell'ago contenente la fibra ottica nel talamo e fino alla capsula interna. Queste sezioni colorate in serie mostrano l'estensione della lesione infartuale nella capsula interna.
Le frecce indicano la lesione infartuale.
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Panoramica
Questo manoscritto descrive una tecnica di modellazione dell'infarto capsulare utilizzando una tecnica fototrombotica modificata. Questo approccio consente la creazione di un modello di infarto capsulare circoscritto che si traduce in un deficit motorio persistente.
Componenti principali dello studio
Area della scienza
- Neuroscienza
- Neurobiologia
- Deficit motorio
Sfondo
- Gli infarti capsulari sono associati a deficit motori.
- Le tecniche fototrombotiche vengono utilizzate per indurre lesioni cerebrali localizzate.
- Comprendere i meccanismi del deficit motorio è cruciale per sviluppare strategie terapeutiche.
- La mappatura del bersaglio è essenziale per la creazione accurata del modello.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare un modello affidabile di infarto capsulare.
- Investigare gli effetti degli infarti capsulari sulla funzione motoria.
- Utilizzare una tecnica fototrombotica modificata per un targeting preciso.
Metodi utilizzati
- Identificazione dell'area degli arti anteriori nella capsula interna utilizzando il virus adeno-associato che esprime GFP.
- Preparazione del ratto mediante anestesia e posizionamento del telaio stereotassico.
- Sterilizzazione del cuoio capelluto e preparazione dell'incisione.
- Iniezione di lidocaina per minimizzare il dolore intraoperatorio.
Risultati principali
- Creazione con successo di un modello di infarto capsulare circoscritto.
- Dimostrazione di un deficit motorio persistente post-infarto.
- Validazione della tecnica fototrombotica modificata.
- Stabilimento di un metodo riproducibile per studi futuri.
Conclusioni
- La tecnica fototrombotica modificata è efficace per modellare gli infarti capsulari.
- Questo modello può essere utilizzato per studiare i deficit motori e potenziali interventi.
- Sono necessarie ulteriori ricerche per esplorare i meccanismi sottostanti dei deficit motori.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
This photothrombotic technique enables precise modeling of white matter stroke by selectively targeting the internal capsule while sparing adjacent gray matter. The resulting circumscribed capsular infarct produces persistent motor deficits, providing a disease-relevant system for mechanistic de-risking of neurotherapeutic candidates. The model supports target validation and preclinical assessment of interventions aimed at white matter pathology, addressing a critical gap in stroke research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to white matter stroke pathophysiology.
- Operational Value: Provides a disease-relevant system for functional target validation in motor circuitry.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by linking infarct location to persistent motor impairment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable lesion volumes via optical intensity titration for dose-response assessment.
- Operational Value: Delivers highly replicable infarct models with consistent motor deficit readouts.
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream compound screening in neuroprotection or neurorepair.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Models white matter stroke at behavioral, circuit, and cellular levels for preclinical validation.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions based on lesion specificity and functional outcome correlation.
- Biomarker Alignment: Facilitates correlation of infarct extent with motor deficit severity for predictive biomarker development.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target identification through preclinical efficacy testing, enabling iterative refinement of neurotherapeutic strategies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of white matter vulnerability and circuit-specific motor pathway disruption.
- Screening: Enables assay standardization through precise lesion control and quantitative motor deficit scoring.
- Analytics: Provides volumetric infarct measurements and behavioral readouts for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity via persistent motor deficit phenotyping.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for iterative testing of neuroprotective and rehabilitative compounds.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target engagement through selective white matter infarct modeling.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via laser intensity calibration and stereotaxic targeting.
- Strategic Value: Reduced late-stage biological risk by enabling early mechanistic de-risking of white matter pathways.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of compounds based on ability to mitigate persistent motor deficits in a validated model.
Implementation Considerations
- Requires expertise in viral vector delivery, stereotaxic surgery, and optical neural interface fabrication.
- Depends on precision instrumentation including stereotaxic frames, microinjectors, and calibrated laser systems.
- Necessitates cross-team standardization for viral titer consistency, optical fiber preparation, and postoperative monitoring.
- Adaptation considerations include species-specific stereotaxic coordinates and optical properties of gray versus white matter.
- Practical limitations include surgical complexity and the need for postoperative validation via histology and behavior.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:40
Identification of the Forelimb Area in the Internal Capsule Using AAV-GFP
3:09
Construction of the Optical Neural Interface
4:41
Photothrombotic Infarct of the Internal Capsule
6:44
Results: Microscopic Appearance of Capsular Infarct after Photothrombosis
7:38
Conclusion
