Name: Stabile ed efficiente Modificazione genetica di cellule nel topo adulto V-SVZ per lanalisi di cellule staminali neurali autonoma ed effetti non autonomi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Scopri la modificazione genetica stabile di cellule staminali neurali nel topo adulto usando particelle lentivirali. Questo metodo permette di analizzare effetti autonomi e non autonomi nella nicchia neurogenica ventricolare.

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Riconosciamo l&#39;aiuto di MJ Palop e il supporto tecnico del SCSIE della Universidad de Valencia. Ringraziamo anche Antonia Follenzi per gli utili commenti e la discussione del manoscritto. IF è supportato dalla Fundación Botín, dal Banco Santander Santander attraverso la sua Università Divisione Global, e da sovvenzioni dal Generalitat Valenciana (Programa Prometeo, ACOMP, e ISIC) e Ministerio de Economia y Competitividad (MINECO: SAF2011-23331, CIBERNED e RETIC tercel) . Questo lavoro è stato supportato anche da BFU2010-21823 e RETIC tercel sovvenzioni dal MINECO e il Consiglio europeo della ricerca (CER) 2012-StG (260511- PD-HUMMODEL) per AC BM-P. è il destinatario di una borsa di studio FPI spagnolo del MINECO.

<ol><li>Fuentealba, L. C., Obernier, K., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neural+stem+cells+bridge+their+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Adult neural stem cells bridge their niche.</a> Cell Stem Cell. 10 (6), 698-708 (2012).</li>
<li>Silva-Vargas, V., Crouch, E. E., Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neural+stem+cells+and+their+niche%3A+a+dynamic+duo+during+homeostasis%2C+regeneration%2C+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Adult neural stem cells and their niche: a dynamic duo during homeostasis, regeneration, and aging.</a> Curr Opin Neurobiol. 23 (6), 935-942 (2013).</li>
<li>Ponti, G., Obernier, K., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+progression+from+stem+cells+to+new+neurons+in+the+adult+brain+ventricular-subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Lineage progression from stem cells to new neurons in the adult brain ventricular-subventricular zone.</a> Cell Cycle. 12 (11), 1649-1650 (2013).</li>
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<li>Mirzadeh, Z., Merkle, F. T., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+confer+unique+pinwheel+architecture+to+the+ventricular+surface+in+neurogenic+regions+of+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells confer unique pinwheel architecture to the ventricular surface in neurogenic regions of the adult brain.</a> Cell Stem Cell. 3 (3), 265-278 (2008).</li>
<li>Shen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+SVZ+stem+cells+lie+in+a+vascular+niche%3A+a+quantitative+analysis+of+niche+cell-cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Adult SVZ stem cells lie in a vascular niche: a quantitative analysis of niche cell-cell interactions.</a> Cell Stem Cell. 3 (3), 289-300 (2008).</li>
<li>Tavazoie, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+specialized+vascular+niche+for+adult+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A specialized vascular niche for adult neural stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3 (3), 279-288 (2008).</li>
<li>Mirzadeh, Z., Doetsch, F., Sawamoto, K., Wichterle, H., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+subventricular+zone+en-face%3A+wholemount+staining+and+ependymal+flow%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">The subventricular zone en-face: wholemount staining and ependymal flow.</a> J Vis Exp. (39), (2010).</li>
<li>Ramirez-Castillejo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pigment+epithelium-derived+factor+is+a+niche+signal+for+neural+stem+cell+renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pigment epithelium-derived factor is a niche signal for neural stem cell renewal.</a> Nat Neurosci. 9 (3), 331-339 (2006).</li>
<li>Falcao, A. M., Marques, F., Novais, A., Sousa, N., Palha, J. A., Sousa, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+path+from+the+choroid+plexus+to+the+subventricular+zone%3A+go+with+the+flow%21%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The path from the choroid plexus to the subventricular zone: go with the flow!</a> Front Cell Neurosci. 6, (2012).</li>
<li>Delgado, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+NT-3+delivered+by+vasculature+and+CSF+promotes+quiescence+of+subependymal+neural+stem+cells+through+nitric+oxide+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Endothelial NT-3 delivered by vasculature and CSF promotes quiescence of subependymal neural stem cells through nitric oxide induction.</a> Neuron. 83 (3), 572-585 (2014).</li>
<li>Kokovay, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VCAM1+is+essential+to+maintain+the+structure+of+the+SVZ+niche+and+acts+as+an+environmental+sensor+to+regulate+SVZ+lineage+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">VCAM1 is essential to maintain the structure of the SVZ niche and acts as an environmental sensor to regulate SVZ lineage progression.</a> Cell Stem Cell. 11 (2), 220-230 (2012).</li>
<li>Porlan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MT5-MMP+regulates+adult+neural+stem+cell+functional+quiescence+through+the+cleavage+of+N-cadherin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">MT5-MMP regulates adult neural stem cell functional quiescence through the cleavage of N-cadherin.</a> Nat Cell Biol. 16 (7), 629-638 (2014).</li>
<li>Ihrie, R. A., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lake-front+property%3A+a+unique+germinal+niche+by+the+lateral+ventricles+of+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Lake-front property: a unique germinal niche by the lateral ventricles of the adult brain.</a> Neuron. 70 (4), 674-686 (2011).</li>
<li>Porlan, E., Perez-Villalba, A., Delgado, A. C., Ferròn, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+regulation+of+neural+stem+cells+in+the+subependymal+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Paracrine regulation of neural stem cells in the subependymal zone.</a> Arch Biochem Biophys. 1-2 (534), 11-19 (2013).</li>
<li>Mamber, C., Verhaagen, J., Hol, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+targeting+of+subventricular+zone+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">In vivo targeting of subventricular zone astrocytes.</a> Prog Neurobiol. 92 (1), 19-32 (2010).</li>
<li>Ferron, S. R., Andreu-Agullo, C., Mira, H., Sanchez, P., Marques-Torrejon, M. A., Fariñas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combined+ex%2Fin+vivo+assay+to+detect+effects+of+exogenously+added+factors+in+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A combined ex/in vivo assay to detect effects of exogenously added factors in neural stem cells.</a> Nat Protoc. 2 (4), 849-859 (2007).</li>
<li>Consiglio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+in+vivo+gene+transfer+into+adult+mammalian+neural+stem+cells+by+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Robust in vivo gene transfer into adult mammalian neural stem cells by lentiviral vectors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (41), 14835-14840 (2004).</li>
<li>Dull, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Third-Generation+Lentivirus+Vector+with+a+Conditional+Packaging+System%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">A Third-Generation Lentivirus Vector with a Conditional Packaging System.</a> J. Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).</li>
<li>Bomsel, M., Alfsen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entry+of+viruses+through+the+epithelial+barrier%3A+pathogenic+trickery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Entry of viruses through the epithelial barrier: pathogenic trickery.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 4 (1), 57-68 (2003).</li>
<li>Castellani, S., Di Gioia, S., Trotta, T., Maffione, A. B., Conese, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+lentiviral+vector-mediated+transduction+on+the+tightness+of+a+polarized+model+of+airway+epithelium+and+effect+of+cationic+polymer+polyethylenimine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Impact of lentiviral vector-mediated transduction on the tightness of a polarized model of airway epithelium and effect of cationic polymer polyethylenimine.</a> J Biomed Biotechnol. , (2010).</li>
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<li>Padmashali, R., You, H., Karnik, N., Lei, P., Andreadis, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adherens+junction+formation+inhibits+lentivirus+entry+and+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Adherens junction formation inhibits lentivirus entry and gene transfer.</a> PLoS One. 8 (11), (2013).</li>
<li>Yamashita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subventricular+zone-derived+neuroblasts+migrate+and+differentiate+into+mature+neurons+in+the+post-stroke+adult+striatum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Subventricular zone-derived neuroblasts migrate and differentiate into mature neurons in the post-stroke adult striatum.</a> J Neurosci. 26 (24), 6627-6636 (2006).</li>
<li>Platt, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+knockin+mice+for+genome+editing+and+cancer+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling.</a> Cell. 159 (2), 440-455 (2014).</li>
</ol>

Tutte le manipolazioni sono state effettuate in una camera di livello di biosicurezza 2. protocolli di animali sono stati approvati dal comitato etico dell&#39;Università di Valencia e sono stati tutti in conformità alla direttiva europea 2010/63 / UE.

LV offrono importanti vantaggi rispetto ad altri sistemi virali per la modificazione genetica degli adulti NSC 16,18. consegna stereotassica del lentivirus alla nicchia V-SVZ rappresenta un metodo efficace per etichettare e tracciare rado dividendo B1-NSC superare i limiti di altri metodi di uso comune come BrdU, che è diluito dopo molteplici divisioni cellulari, o retrovirus, che prendono di mira solo le cellule che proliferano al momento dell&#39;applicazione. LV, insieme con adenovirus, può infettare le ce...

La zona ventricolare-subventricular murino (V-SVZ), nelle pareti del ventricolo laterale rivolta verso lo striato, è una regione germinale molto attivo in cui un processo continuo di replicazione delle cellule progenitrici e differenziazione risultati nella produzione persistente bulbo olfattivo (OB ) interneuroni e oligodendrociti corpo calloso 1. La generazione per tutta la vita di queste cellule sembra essere sostenuta dalla presenza in questa regione di cellule neurali staminali (NSC; anche chiamate cellule B1), che esprimono l&#39;antigene astrociti proteina silicea fibrillare gliale (GFAP) e gambo marcatori di cellule, come nestina, Id1 e Sox2 2. GFAP-cellule che esprimono B1 generare cellule (TAP) (cellule C), che esprimono fattori di trascrizione Dlx2 transito amplificando progenitore (distale-meno homeobox 2) e Ascl1 (mammiferi achaete-Schute omologo 1) e dividere rapidamente un paio di volte prima che danno luogo a neuroblasti migrazione (cellule a) o oligodendroblasts 3. Appena generata prolifneuroblasti migrano rative anteriormente, formando il flusso migratorio rostrale (RMS) per l&#39;OB, in cui si integrano nel granulari e strati glomerulare come interneuroni inibitori differenziati. Migrazione giovani oligodendroblasts muovono al CC, dove diventano cellule NG2-positive immature che continuano a dividere localmente o differenziarsi in oligodendrociti mielinizzanti maturi 1,4. celle B1, che derivano da cellule gliali radiali fetali, conservano la morfologia allungata e polarizzata dei loro predecessori e presentano un rapporto altamente specializzato con la loro nicchia. Essi spaziano tra il ependima che allinea il ventricolo e la rete di vasi sanguigni che irrigano la nicchia V-SVZ. Il piccolo processo apicale delle cellule B1 intercala tra ependymocytes multiciliated e termina in un singolo ciglio primario non mobili, mentre il loro processo basale si estende lunghe distanze per avvicinarsi il plesso vascolare planare che irriga questo finale nicchia nel BAsal lamina dei capillari del plesso 2,5-8. Il modo più affidabile per distinguere B1-NSC da astrociti non neurogena, che sono anche GFAP +, nella nicchia V-SVZ intatto si basa sulla preparazione della parete laterale del ventricolo e la loro analisi del 3-D microscopia confocale tutto il montaggio dopo immunocolorazione per GFAP per etichettare il sottile processo apicale B1-NSC, β-catenina a delineare le membrane cellulari, e sia γ-tubulina come marcatore di corpi basali cilial o acetilata α-tubulina di etichettare l&#39;entità di ogni ciglio 5,8. Le osservazioni di questi interi-monti dalla superficie ventricolare hanno indicato che le cellule B1 e ependimali sono disposti in &quot;girandole&quot; 5, in cui i processi apicali uniciliated di uno o più GFAP + B1 cellule sono circondate da una rosetta di cellule ependimali multiciliated. La morfologia caratteristica delle cellule B1 correla con l&#39;evidenza sperimentale indicating che i vasi sanguigni / cellule endoteliali e ventricolare liquido cerebrospinale (CSF) costituiscono fonti regolamentati di segnali solubili che agiscono su NSC 2,6,9-11. In superficie ventricolare, omotipica e le interazioni apico-laterale eterotipica che coinvolgono cellule ependimali e B1 comprendono giunzioni strette e giunzioni aderenti 5,12. Inoltre, molecole di adesione coinvolte nei complessi giunzionali tra cellule B1 e ependimali, come N-caderina e V-CAM, hanno dimostrato di regolare non solo il posizionamento altamente organizzato di B1 nella nicchia V-SVZ, ma anche la loro quiescenza 12 , 13. Il monostrato di cellule ependimali-B1 sembra agire come barriera di diffusione che consente il flusso regolamentato di acqua e piccole molecole dal CSF, ma limitando il passaggio intercellulare grandi proteine ​​10,11. Evidenze sperimentali indicano che la posizione unica ciglio apicale delle cellule B1 potrebbe svolgere un ruolo di sensore di segnalazione polipeptidi presenti nel liquor 2,5-7. Cellule ependimali sono, di per sé, anche una sorgente di segnali solubili e di membrana con un ruolo nella regolazione del comportamento NSC 14,15. Nucleosidi tracciabili, come bromo-deossiuridina (BrdU), o retrovirus sono stati ampiamente utilizzati per marcare le cellule progenitrici, tra NSC, in vivo. Tuttavia, questi metodi non sono ottimali per il destino tracciamento a lungo termine, perché i segnali BrdU diluito attraverso divisioni cellulari ripetuti e retrovirus sembrano indirizzare preferenzialmente transitoriamente amplificare le cellule a causa della loro esigenza di proliferazione delle cellule per la trasduzione 16,17. Per esaminare NSC fisiologia in vivo, comprese le interazioni con i componenti di nicchia, è fondamentale stabilire un metodo per etichettare e tracciare le cellule raramente che dividono, come B1-NSC sono in gran parte a riposo e le loro cellule ependimali vicini non si dividono in condizioni fisiologiche 3. Qui, dimostriamo che vettori lentivirali (LV) consentono di marchio gene ad alta efficienzazione e modifica a lungo termine di NSC adulti e non dividendo le cellule ependimali, causa più ragionevolmente alla loro capacità di trasdurre e di integrarsi nel genoma delle cellule bersaglio in modo indipendente ciclo cellulare. Inoltre, si mostra come il percorso di consegna e virali aiuto titolo di trasdurre specificamente cellule ependimali, ma non le cellule B1 consentendo in tal modo l&#39;analisi di nicchia-dipendente, effetti ependimali su NSC.

<table><tbody><tr><td>Parte 1: Generazione di LV per la consegna in vivo.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Attrezzature:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima XL-100K</td><td></td></tr><tr><td>Rotore per ultracentrifuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>SW-28</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuga rotore</td><td>Beckman Coulter</td><td>SW-55</td><td></td></tr><tr><td>Provette per ultracentrifuga&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>358126</td> provette per ultracentrifuga <td>da 25 mm x 89 mm</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>326819</td> adattatori per ultracentrifuga <td>13 mm x 51 mm</td></tr><tr><td></td><td>Beckman Coulter</td><td>358156</td><td></td></tr><tr><td>piastra a 6 pozzetti</td><td>SPL</td><td>PLC-30006</td><td></td></tr><tr><td>piastra a 24 pozzetti</td><td>SPL</td><td>PLC-30024</td><td></td></tr><tr><td>piastra da 10 cm</td><td>SPL</td><td>PLC-20101</td> provette FACS <td>100 x 20</td></tr><tr><td></td><td>Afora</td><td>DE400800</td><td>12 mm x 75 mm, 5 ml</td></tr><tr><td>Filtro FACS sterile a tazza</td><td>BD</td><td>340626</td><td>30 & m</td></tr><tr><td>Filtro nitrocellulosico</td><td>Millipore</td><td>SCGPU05RE</td><td>0,22 &mu; m&nbsp;</td></tr><tr><td>Citometro a flusso</td><td>BD</td><td>LSR Fortessa</td><td>Laser blu 488 nm</td></tr><tr><td>Filtro Steritop</td><td>Biofil</td><td>FPE-204-500&nbsp;</td><td>0,22 &micro; </td></tr><tr><td>mReagenti:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>plasmide pMDLg/pRRE&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>#12251</td><td></td></tr><tr><td>Plasmide pRSV.REV per l'imballaggio del nucleo&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>#12253</td><td>Plasmide</td></tr><tr><td>pMD2G plasmide&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>#12259</td><td>Plasmide a busta</td></tr><tr><td>pRRL-SIN-PPT.PGK.EGFP.Wpre plasmide&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>#12252</td><td>Trasferisci il plasmide</td></tr><tr><td>vettoriale Dulbecco's Modified Eagle's Medium&nbsp;</td><td>Biowest</td><td>L0101-500</td><td>Per la coltura cellulare HeLa</td></tr><tr><td>Il terreno di Dulbecco modificato di Iscove</td><td>Life technologies</td><td>12440-053</td><td>Per colture cellulari 293T</td></tr><tr><td>Tris-EDTA (TE)</td><td></td><td></td><td>Tris-HCl (sigma, T5941), 0,1 mM EDTA (sigma, E5134), pH 7,6,&nbsp; Senza DNAsi/RNAsi, 0,2 &micro; m filtrato sterile</td></tr><tr><td>2x HBS</td><td></td><td></td><td>0,28 M NaCl (Sigma, S7653), 0,05 M HEPES (Sigma, H7523), 1,5 mM anidro Na2HPO4 (Sigma, S7907) in dH2O (preferibilmente non MilliQ). Regolare il pH a 7,0 con la soluzione di NaOH (Calbiochem, 567530).</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Biowest</td><td>S181B-500</td><td>Soluzione madre a 100x, utilizzato per preparare il terreno di coltura HeLa e 293T a una concentrazione finale di 10x.</td></tr><tr><td>Glutammina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513-100</td><td>Soluzione madre a 200 mM, utilizzata per preparare il terreno di coltura HeLa e 293T a una concentrazione finale di 6 mM.</td></tr><tr><td>Piruvato di sodio</td><td>Life technologies</td><td>11360-039</td><td>Soluzione madre a 100 mM, utilizzata per preparare il terreno di coltura HeLa e 293T a una concentrazione finale di 1 mM.</td></tr><tr><td>GlutaMAX Supplement</td><td>Life technologies</td><td>35050-061</td><td>Utilizzato per preparare il terreno di coltura 293T a una concentrazione finale dell'1%.</td></tr><tr><td>Penicillina/streptomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4458</td><td>La soluzione madre contiene 5.000 unità/ml di penicillina e 5 mg/ml di streptomicina. Utilizzato per preparare terreni di coltura HeLa e 293T a una concentrazione finale dell'1%.</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25200-056</td><td>Con rosso fenolo, contiene 2,5 g di tripsina suina e 0,2 g di EDTA 4Na/L HBSS.</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato&nbsp; (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1408</td><td>Senza cloruro di calcio e cloruro di magnesio, 10x, liquido, filtrato sterile, adatto per colture cellulari. Soluzione madre utilizzata per preparare 1x PBS in acqua per colture cellulari.</td></tr><tr><td>Polibrene (bromuro di esadimetrina)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9268</td><td>Polvere. Preparare una soluzione madre 1.000x a 8 mg/ml in dH<sub2O</td></tr><tr><td>Paraformaldeide grado EM 16%</td><td>EM Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Parte 2: Iniezione steratassica di LV nella ZES vera e propria o nel ventricolo laterale.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Attrezzatura:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vernier strumento stereotassico</td><td>NeuroLab, Leica</td><td>39463001</td><td>http://www.leicabiosystems.com/</td></tr> <tr><td>Cunningham mouse e adattatore per ratto neonatale</td><td>NeuroLab, Leica</td><td>39462950</td><td></td></tr><tr><td>Portasiringa</td><td>KD Scientific</td><td>KDS-311-CE</td><td></td></tr><tr><td>Siringa calibro 33</td><td>Hamilton</td><td>P/N&nbsp; &nbsp; &nbsp; 84851/00</td><td>#85RN</td></tr><tr><td>Trapano elettrico</td><td>Fine Science Tool</td><td>98096</td><td></td></tr><tr><td>Coperta termica</td><td>Ufesa</td><td>AL5512/01</td><td>230-240 V, 100-110 W, tipo C_AL01</td></tr><tr><td>Rasoio&nbsp;</td><td>Jata</td><td>MP373N</td><td>Modello: bellezza, 3 V, 300 mA, tipo HT-03.</td></tr><tr><td>Reagenti:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medetomidine</td><td>Esteve</td><td>DOMTOR&nbsp;</td><td>Soluzione commerciale a 1 mg/ml.</td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Merial</td><td>Imalgene 500&nbsp;</td><td>Soluzione commerciale a 50 mg/ml</td></tr><tr>Miscela <td></td><td></td><td>di medetomidina/ketamina</td><td>Preparare una miscela di lavoro di medetomidina a una concentrazione finale di 0,2 mg/ml di diluizione e ketamina a una concentrazione finale di 15 mg/ml in soluzione salina. Utilizzare come anestesia, iniettando un volume per ottenere una concentrazione finale di 0,5-1 mg di medetomidina per kg di peso corporeo e 50-75 mg di ketamina per kg di peso corporeo</td></tr>, <tr><td>Butorphanol</td><td>Pfizer</td><td>, soluzione madre torbugesica</td><td>a 10 mg/ml. Usato come analgesia a 1 mg/ml in soluzione salina.</td></tr><tr><td>Atipamezolo</td><td>Esteve</td><td>Antisedan</td><td>soluzione madre a 5 mg/ml, utilizzato in una concentrazione finale di 0,5 mg/ml in soluzione salina per uscire dall'anestesia.</td></tr><tr><td>Soluzione salina allo 0,9%</td><td>Braun</td><td>13465412</td><td></td></tr><tr><td>Histoacryl</td><td>Braun</td><td>1050052</td><td>Adesivo topico per la pelle</td></tr><tr><td>HydroGel</td><td>Clear H2O</td><td>70-01-5022</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34120</td><td>11 cm x 21 cm</td></tr><tr><td>Candeggina/Virkon</td><td>Dupont</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pennarello chirurgico</td><td>Staedler</td><td>313-9</td> Lubrificante oftalmico <td>permanente lumocolor</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td>SICCAFLUID</td><td>0,5 g/dosis, carbomer 974P</td></tr><tr><td>Povidone-iodio</td><td>Betadine</td><td>694109.6</td><td>10% povidone-iodio</td></tr><tr><td><forte>Nome</forte></td><td><forte>Azienda</forte></td><td><forte>Numero di catalogo</forte></td><td><forte>Commenti</forte></td></tr><tr><td><forte>Parte 3: Analisi istologica.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Attrezzature:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pompa peristaltica automatica</td><td>Cole-Parmer Inst. Co.</td><td>HV-07524-55</td><td>Masterflex L/S variatore di velocità, 1,6-100 giri/min, 230 V</td></tr><tr><td>Testa pompa</td><td>Cole-Parmer Inst. Co.</td><td>HV-07518-00</td><td>Testa pompa Masterflex L/S Easy-Load per tubi di precisione; Alloggiamento in PSF, rotore CRS</td></tr><tr><td>Tubo in silicone</td><td>Cole-Parmer Inst. Co.</td><td>HV-96410-16</td><td>Platinum L/S 16</td></tr><tr><td>Set di vene del cuoio capelluto</td><td>Vygon V-green</td><td>70246.05T</td><td>25 G, lunghezza del tubo 30 cm</td></tr><tr><td>Vibratomo</td><td>Leica</td><td>VT1000</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale</td><td>Olympus</td><td>FluoView FV10i</td><td></td></tr><tr><td>Piastra riscaldante</td><td>Tehtnica</td><td>SHP-10</td><td></td></tr><tr><td>Reagenti:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampone fosfato (PB)</td><td></td><td></td><td>0,2 M PB: 0,2 M Na2HPO4 (Sigma, S7907) e 0,2 M NaH2PO4 (Panreac, 141965.1211) in dH2O, regolare il pH a 7,2-7,4</td></tr><tr><td>Paraformaldeide (PFA)</td><td>Panreac</td><td>141451.1211</td><td>Preparare fresco ogni volta. Calore dH2O fino a 55&ndash; 60 &deg; C utilizzando una piastra riscaldante posta in una cappa aspirante e versare la polvere di PFA mescolando per ottenere una soluzione all'8%. La soluzione è di colore bianco torbido poiché il PFA non si dissolve facilmente. Aggiungere 1N NaOH goccia a goccia fino a quando la soluzione non si chiarisce. Raffreddare, filtrare la carta Whatman e aggiungere un volume equivalente di 0,2 M PB.</td></tr><tr><td>Soluzione</td><td></td><td></td> salina <td>0,9% NaCl in dH2O</td></tr><tr><td>Supercolla</td><td>LOCTITE</td><td>767547</td><td></td></tr><tr><td>Sodio azide</td><td>Panreac</td><td>122712.1608</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7126-100</td><td></td></tr><tr><td>Siero di capra normale</td><td>Millipore</td><td>S30-100</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td>Detergente</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-GFP di coniglio</td><td>ROCKLAND</td><td>600-401-215</td><td>Utilizzare a una diluizione 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Asino Anticorpo IgG (H+L) di coniglio</td><td>Sonde molecolari</td><td>A-21206</td><td>Utilizzare a una diluizione 1:750</td></tr><tr><td>6-Diamindino-2-fenilindolo dicloridrato idrato (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>Colorazione nucleare fluorescente. Utilizzare a 2 mg/ml in ddH2O. Conservare al buio a 4 °C.</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>EM Sciences</td><td>17984-25</td><td>Mezzo di montaggio per preparazioni fluorescenti</td></tr></tbody></table>

stabile ed efficiente modificazione genetica di cellule nel topo adulto v-svz per l&#39;analisi di cellule staminali neurali autonoma ed effetti non autonomi

Stable and Efficient Genetic Modification of Cells in the Adult Mouse V-SVZ for the Analysis of Neural Stem Cell Autonomous and Non-autonomous Effects

Relativamente cellule staminali somatiche quiescenti sostenere il rinnovamento cellulare per tutta la vita nella maggior parte dei tessuti adulti. Le cellule staminali neurali nel cervello dei mammiferi adulti sono limitate a due specifiche nicchie neurogena: la zona subgranulare del giro dentato dell&#39;ippocampo e la zona ventricolare-subventricolare (V-SVZ, chiamato anche zona subependimale o SEZ) nelle pareti del laterali ventricoli. Lo sviluppo di strategie in vivo di trasferimento genico per le popolazioni di cellule staminali adulte (cioè quelli del cervello dei mammiferi) con conseguente espressione a lungo termine di transgeni desiderati nelle cellule staminali e la loro progenie derivata è uno strumento cruciale nella corrente ricerca biomedica e biotecnologica. Qui, un metodo diretto in vivo è presentato per la modificazione genetica stabile di cellule di topo adulto V-SVZ che sfrutta la cella infezioni ciclo-indipendente LV e la citoarchitettura altamente specializzato della nicchia V-SVZ. In particolare, l&#39;attuale protocollo comportas l&#39;iniezione di LV vuoti (controllo) o LV codificanti cassette specifica espressione del transgene nelle memorie V-SVZ sé, per in vivo di targeting di tutti i tipi di cellule nella nicchia, o nel lume ventricolo laterale, per l&#39;orientamento dei ependimali solo le cellule. cassette di espressione vengono poi integrati nel genoma delle cellule trasdotte e proteine ​​fluorescenti, codificate anche dal LV, permettere la rivelazione delle cellule trasdotte per l&#39;analisi di cellule, effetti autonomi e non autonomi nicchia-dipendente sulle cellule marcate e loro progenie.

Sistema di erogazione gene LV-mediata può essere utilizzato per il lungo termine in vivo trasduzione di cellule nel topo adulto V-SVZ, permettendo loro di inseguimento e modificazione genetica durante la proliferazione, la migrazione e la differenziazione. L&#39;infezione e l&#39;espressione sono altamente efficaci e producono numerose cellule che possono essere facilmente distinta tra le altre cellule non infette con l&#39;espressione del reporter incluso. Abbiamo finora visualizzato cellule trasdotte con i gi...

Qui descriviamo una procedura basata sull'uso di particelle lentivirali per la modificazione genetica a lungo termine delle cellule staminali neurali e/o delle loro cellule ependimali adiacenti nella nicchia neurogenica ventricolare-subventricolare adulta che consente l'analisi separata degli effetti autonomi e non autonomi delle cellule staminali neurali.

Stabile ed efficiente Modificazione genetica di cellule nel topo adulto V-SVZ per l&#39;analisi di cellule staminali neurali autonoma ed effetti non autonomi

Relatively quiescent somatic stem cells support life-long cell renewal in most adult tissues. Neural stem cells in the adult mammalian brain are ...

L'obiettivo generale di questa procedura è somministrare piccoli volumi di particelle lentivirali ad alto titolo, contenenti costrutti di DNA specifici, alla zona ventricolo-subventricolare adulta del topo per infettare tutti i suoi tipi cellulari oppure al ventricolo laterale per colpire esclusivamente le cellule ependimali. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali riguardo le interazioni tra le cellule staminali neurali dell'ambiente ventricolo-subventricolare adulto e le cellule ependimali adiacenti. Il principale vantaggio di questa tecnica consiste nel fatto che i vettori lentivirali si integrano nel genoma delle cellule bersaglio in modo indipendente dal ciclo cellulare, consentendo una differenziazione a lungo termine di cellule che si dividono raramente. A illustrare la procedura insieme a me sarà la studentessa laureanda Beatriz Mart

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Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Controllare l'espansione delle cellule staminali somatiche è un freno notevole loro studio e l'uso in terapia. Qui si descrive un sistema per controllare temporalmente neurale espansione delle cellule staminali durante lo sviluppo e adulta, che può essere utilizzato per aumentare il numero di neuroni generati nel cervello di topo.

Ampliamento della embrionali e cellule staminali neurali adulte per<em&gt; In Utero</em&gt; Elettroporazione o Viral iniezione stereotassica

Fonte: Porlan, E., et al. Modificazione genetica stabile ed efficiente delle cellule nel topo adulto V-SVZ per l'analisi degli effetti autonomi e non autonomi delle cellule staminali neurali. J. Vis. Exp. (2016)Questo video dimostra la modificazione genetica stabile delle cellule staminali neurali (NSC) nella zona ventricolare-subventricolare (V-SVZ) attraverso l'iniezione stereotassica di un gene terapeutico portatore di virus in un modello murino. Il virus entra nelle NSC, subisce la...

Iniezione stereotassica di virus per la modificazione genetica stabile in un modello murino

Vettori virali per consentire la manipolazione genica mirata. Abbiamo dimostrato un metodo per l'espressione genica condizionale o ablazione nel midollo spinale topo, utilizzando iniezione stereotassica di un vettore virale nel corno dorsale, un luogo di rilievo di contatto sinaptico tra afferenze somatosensoriali primarie e neuroni del sistema nervoso centrale.

Iniezione stereotassica di un vettore virale per la manipolazione del gene condizionale nel midollo spinale del mouse

Qui si descrive un protocollo dettagliato per la generazione simultanea di colture di cellule precursore neuronali, sia come monostrati aderenti o neurosfere, dalla zona subventricolare e giro dentato di singoli topi adulti.

Un mouse, due culture: isolamento e la coltura di Adult Neural Stem Cells dalle due zone neurogena Mice individuale

Riportiamo un metodo basato sul Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS) per isolare le cellule staminali neurali (NSC) e la loro progenie dalla zona subventricolare (SVZ) del cervello del topo adulto. Applicato a topi transgenici FUCCI (Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator), consente lo studio della progressione del ciclo cellulare mediante imaging dal vivo.

Ordinamento delle cellule staminali neurali e di cellule progenitrici del topo adulto subventricolare Zone e Live-imaging loro dinamiche del ciclo cellulare

Descriviamo un protocollo di chirurgia stereotassica con un dispositivo fisso testa fatti in casa per microinjecting reagenti nello striato del cervello neonatale del mouse. Questa tecnica permette la manipolazione genetica in cellule neuronali di specifiche regioni del cervello di topo neonatale.

Chirurgia stereotassica per la manipolazione genetica in cellule striatali di cervelli di topo neonatale

Qui presentiamo un protocollo per lo sviluppo di modelli murini geneticamente modificati utilizzando cellule staminali embrionali, in particolare per il knock-in del DNA di grandi dimensioni (KI). Questo protocollo è ottimizzato utilizzando l'editing del genoma CRISPR / Cas9, con conseguente miglioramento significativo dell'efficienza KI rispetto al tradizionale metodo di targeting linearizzato del DNA mediato dalla ricombinazione omologa.

Targeting genico altamente efficiente mediato da CRISPR/Cas9 in cellule staminali embrionali per lo sviluppo di modelli murini manipolati da geni

Un metodo per l'isolamento di cellule staminali neurali e cellule progenitrici di oligodendrociti dal cervello di ratti vivi è presentato qui in dettaglio sperimentale. Permette di raccogliere più cellule dagli stessi animali senza comprometterne il benessere.

Il metodo di "mungitura del cervello" per l'isolamento di cellule staminali neurali e cellule progenitrici di oligodendrociti da ratti vivi

Qui, descriviamo un sistema di nucleofecazione progettato per migliorare l'efficienza del rilascio genico in cellule staminali neurali espanse (NSC) isolate dalla zona subventricolare murina adulta. I risultati dimostrano che questo metodo migliora significativamente la perturbazione genica nelle NSC, superando l'efficacia dei protocolli di trasfezione tradizionali e migliorando il tasso di sopravvivenza cellulare.

Isolamento, espansione e nucleofezione di cellule staminali neurali dalla zona subventricolare murina adulta

Qui, descriviamo un protocollo per l'ingegnerizzazione di cellule staminali riprogrammate chimicamente per ottenere una modulazione neuronale precisa differenziando queste cellule in cellule precursori dopaminergiche, trapiantandole in modelli murini della malattia di Parkinson e valutando i risultati comportamentali ed elettrofisiologici per confermare il successo dell'integrazione e l'efficacia funzionale delle cellule trapiantate.

Regolazione chemiogenetica nelle cellule precursori derivate da cellule staminali riprogrammate nel trattamento delle malattie neurodegenerative

Scopri la modificazione genetica stabile di cellule staminali neurali nel topo adulto usando particelle lentivirali. Questo metodo permette di analizzare effetti autonomi e non autonomi nella nicchia neurogenica ventricolare.

Stabile ed efficiente Modificazione genetica di cellule nel topo adulto V-SVZ per lanalisi di cellule staminali neurali autonoma ed effetti non autonomi (Video) | JoVE Journal

Stabile ed efficiente Modificazione genetica di cellule nel topo adulto V-SVZ per l'analisi di cellule staminali neurali autonoma ed effetti non autonomi

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