Name: Geomagnetico Field (Gmf) e Stabilimento Evolution: studio degli effetti di Gmf Storno su Arabidopsis thaliana Sviluppo e Gene Expression (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-30T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 4 s
Description: Scopri come invertire il campo geomagnetico con bobine di Helmholtz per studiare la morfologia e l'espressione genica di Arabidopsis thaliana. Questo metodo consente esperimenti controllati sull'evoluzione vegetale.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione a MEM dal Dipartimento di Scienze della Vita e Biologia dei Sistemi dell'Università di Torino, Italia. Gli autori ringraziano G. Gnavi per l'assistenza tecnica durante alcuni esperimenti. CTR è finanziato dal Wellcome Trust e dalla Royal Society (numero di sovvenzione 098436/Z/12/Z).

1. Impostazione della triassiale bobine NOTA: la figura 1 mostra le bobine triassiali utilizzati per invertire la GMF. <ol><li> Accendere il magnetometro a tre assi, cui sonda è inserita nelle bobine triassiale. </li><li> Accendere il computer e avviare il software magnetometro che consente ai dati di essere raccolti da tre assi del magnetometro. </li><li> Utilizzare i valori dei componenti riportati dal magnetometro per calcolare la grandezza del GMF. Ad esempio, con valori magnetometro: Bx = 6.39 microtesla, Da = 36.08 microtesla, Bz = 20.40 microtesla calcolare un&#39;intensità di campo di 41.94 mT utilizzando la seguente equazione: B = B GMF + B supplementare, dove altro B = (Bx 2 + Con 2 + 2 Bz) ½ (cioè 41.9 mT nell&#39;esempio.) </li><li> Accendere i tre alimentatori in corrente continua (dual range: 0-8V / 5A e 0-20V / 2.5A, 50W) ciascuno collegato a tre couples di bobine di Helmholtz e collegato ad un computer tramite una connessione GPIB (Figura 1B). </li><li> Impostare tensioni degli alimentatori per generare il campo magnetico desiderato con un campo vettoriale magnetico inverso. Ad esempio, con B GMF come al punto 1.3 e con le dimensioni della bobina della strumentazione qui descritto, impostare le tensioni V x = 0,00 V, V y = 30.52 V, V z = 0.00 V per generare un nuovo risultante B = B + B GMF bobine triassiali = (6.38, -36,08, 20.39) microtesla. cioè, un nuovo campo con lo stesso ordine di grandezza B GMF, ma punta a una direzione diversa. </li><li> Verificare il nuovo campo con il software magnetometro utilizzando la procedura descritta in 1.3. </li><li> Esporre piante sia per normale e invertita condizioni GMF utilizzando piastre di Petri come descritto nella sezione 2. </li><li> Eseguire esperimenti esposizione sham mantenendo l&#39;intensità del campo pari a | B GMF | e conservazionela componente verticale del campo uguale a quella della GMF ma alterare la direzione (cioè, &quot;Nord, est o ovest&quot;) del componente orizzontale del campo con correnti uguali nelle bobine triassiali rispetto alla condizione inversione di campo. A tale scopo, alterando la tensione delle bobine come descritto in 1.5. Nota: Regole Questa esposizione farsa fuori potenziale di riscaldamento sottile o effetti vibrazionali da entrambi le bobine stesse o dalle elettronici usati per controllare le bobine. </li><li> Eseguire esperimenti in doppio cieco, applicando le condizioni del campo accecati dal personale che svolgono il resto degli esperimenti e / o di interpretazione dei dati. </li></ol> 2. Preparazione dei Materiali e condizioni per la crescita delle piante vegetali <ol><li> Utilizzare semi di Arabidopsis thaliana, ecotipo Columbia 0 (Col 0), quindi inserire in una provetta da 1,5 ml e sterilizzare superficie mediante trattamento con un 5% (w / v) Soluzione di ipoclorito di calcio e 0,02% (v / v) Triton X-100 in 80% di etanolo (EtOH), per 10-12 minuti a 25-28 ° C, con agitazione continua. Poi risciacquare due volte con 80% EtOH, lavare con il 100% EtOH ed infine risciacquare con acqua distillata sterile. </li><li> Preparare 1 L di Murashige e Skoog 22 (MS) modificato con l&#39;aggiunta di medio: 2.297 g di SM (0,5 x MS basale Salt Miscela), 10 g di saccarosio, acqua deionizzata fino a 1 L, pH 5,8-6,0 regolato con KOH. Aggiungere 16 g di agar e autoclave per 20 min, 120 ° C. </li><li> Prima di solidificazione, versare 80 ml ​​di terreno in ciascuna (120 x 120 mm 2) piastre Petri quadrati. Seminare trenta semi sterili sul piatto, e quindi sigillare le piastre con un film ceroso. </li><li> Vernalize le piastre orizzontalmente al buio a 4 ° C per 2 giorni per potenziare e sincronizzare la germinazione, e quindi esporre piastre Petri di normale o invertita GMF. </li><li> Esporre semi in un ambiente controllato climatica a 22 ° C in posizione verticale in esperimenti paralleli sia all&#39;interno delle bobine triassiali e fuori le bobine triassialisotto un programma fotoperiodo di 8 ore tenebre e la luce 16 ore, utilizzando lampade a vapore di sodio (220 x 10 -6 E m -2 s -1). Utilizzare un film di gelatina blu per spotlight per ridurre la componente rossa delle lampade. </li><li> Esporre piante per 10 giorni prima di estrazione di RNA sia normale (controllo) e inversione (trattamento) GMF condizioni. </li><li> Dopo l&#39;esposizione, scattare foto di piastre di Petri. </li><li> Utilizzare il software ImageJ per calcolare lunghezza aree radice e foglia. <ol><li> Brevemente, misurare il lato della piastra Petri, quindi aprire l&#39;immagine della piastra Petri e utilizzando l&#39;opzione &quot;diritta&quot; linea per disegnare una linea che attraversa esattamente il lato piatto. </li><li> Nel menu &quot;analizzare&quot; selezionare &quot;scala set&quot; e inserire la distanza effettiva nella casella &quot;distanza nota&quot; (ad esempio, 120 mm), quindi inserire l&#39;unità di lunghezza (mm); infine fare clic sull&#39;opzione &quot;globale&quot; per configurare le impostazioni disponibili per tutte le misurazioni. </li><li> Per roolunghezza t, seguire attentamente la forma della radice utilizzando lo strumento a mano libera. Misurare la lunghezza utilizzando l&#39;opzione &quot;misura&quot; nel menu &quot;analizzare&quot;. Continuerà a misurare tutte le radici nella foto e salvare il file per ulteriori analisi statistiche. </li><li> Per superficie fogliare, dal menu &quot;immagine&quot;, utilizzare l&#39;opzione e quindi &quot;soglia di colore&quot; regolare. Selezionare la foglia individuo e nel menu &quot;analizzare&quot; selezionare &quot;analizzare particelle&quot;. Salvare le singole misure per le analisi statistiche. </li></ol></li></ol> 3. Arabidopsis RNA totale Estrazione, Quantitative Real-Time PCR (qPCR) Condizioni di reazione e Primer per Arabidopsis <ol><li> Raccogliere separatamente 30 germogli e 30 radici e congelare immediatamente in azoto liquido. Poi macinare in azoto liquido con mortaio e pestello. </li><li> Isolare RNA totale utilizzando un kit di purificazione e kit per il trattamento DNasi RNase-Free utilizzando manufacturistruzioni di Er. </li><li> Verifica qualità e quantità del campione utilizzando un kit di RNA elettroforesi nano e gel capillare secondo le istruzioni del produttore. Confermare la quantificazione di RNA spettrofotometricamente. </li><li> Utilizzare 2 mg di RNA totale e primer casuali utilizzando un kit cDNA trascrizione inversa per ottenere primi cDNA filo secondo le raccomandazioni del costruttore. </li><li> Eseguire tutti gli esperimenti su un Real-Time System con SYBR Green con ROX come standard di carico interno. </li><li> Eseguire la reazione con 25 ml di miscela costituita da 12,5 ml di 2x SYBR Green qPCR Master Mix, 0,5 ml di cDNA e 100 primer nm. Utilizzare i primer elencati nella tabella 1. Includere nei controlli controlli non-RT (utilizzando RNA totale, senza trascrizione inversa per monitorare la contaminazione del DNA genomico) e controlli non di modello (acqua invece di modello). </li><li> Calcola Primer efficienza per tutte le coppie di primer che utilizzano lo standardmetodo della curva 23. </li><li> Utilizzare le seguenti condizioni di PCR: CRU3, COTP1, RRTF1. 10 min a 95 ° C, 40 cicli di 15 s a 95 ° C, 30 sec a 58 ° C, e 30 sec a 72 ° C; UBP6, eEF1Balpha2, ACT1, GAPC2, CAT3, tapX, APX1, RbohD, FeSOD1 10 min a 95 ° C, 40 cicli di 15 s a 95 ° C, 20 sec a 57 ° C e 30 secondi a 72 ° C. </li><li> Leggere fluorescenza dopo ciascuna fase di ricottura e di estensione. Per tutte le corse, eseguire un sondo da 55 a 95 ° C includendo il segmento di dissociazione nel profilo termico. Utilizzare la schermata curva di dissociazione, si accede dalla scheda dei risultati per visualizzare il profilo di dissociazione (trama della fluorescenza in funzione della temperatura). Verificare che il set di dati raccolti durante il segmento di dissociazione dell&#39;esperimento viene selezionato per l&#39;analisi utilizzando la schermata di analisi / Setup. </li><li> Determinare il lgamma inear concentrazione modello a valore di ciclo soglia (valore Ct) eseguendo una serie di diluizioni di dieci volte (da 1 a 10 3 fold) utilizzando cDNA da tre estrazioni di RNA indipendenti analizzati in tre repliche tecniche 24,25. </li><li> Analizzare tutti i grafici di amplificazione con la Real-Time PCR strumento software per ottenere valori Ct. Calibrare e normalizzare i livelli di RNA relativi al livello dei migliori geni housekeeping come segue: 3.11.1) Accedi al amplificazione schermata trame attraverso la scheda Risultati, selezionare la rampa o plateau per cui i dati devono essere analizzati mediante lo schermo / Setup Analysis Selection, e quindi selezionare il DRN (baseline corretta fluorescenza normalizzato) dal menu a fluorescenza sul pannello di comando. Accedi al piatto dello schermo Valori di esempio attraverso la scheda Risultati per visualizzare i valori Ct per i pozzi campionati. </li><li> Utilizzare quattro geni di riferimento diversi [ad esempio, citoplasmatica deidrogenasi gliceraldeide-3-fosfato, (GAPC2), ubiquitina specific proteasi 6 (UBP6), Actin1 (ACT1) e il fattore di allungamento 1B subunità alfa 2 (eEF1Balpha2)] per normalizzare i risultati della PCR in tempo reale. Selezionare la classifica top gene utilizzando un software di analisi 26; e utilizzare il gene più stabile per la normalizzazione. <ol><li> Brevemente, organizzare i dati di ingresso in un foglio Excel con la prima colonna contiene i nomi dei geni e prima riga contenenti i nomi dei campioni. Quindi selezionare il software di analisi dal menu-bar. Utilizzare la finestra di dialogo per selezionare i dati di input. </li><li> Successivamente, verificare i campi nomi dei campioni, i nomi di geni e di uscita semplice solo. Fare clic sul pulsante Vai per eseguire l&#39;analisi. Selezionare la parte superiore gene classificato (che ha il valore di stabilità più piccolo) come gene candidato più stabilmente espresso. </li></ol></li><li> Dati Plot mostrando l&#39;espressione fold change differenziale sia germogli e radici. </li></ol> 4. Analisi statistica <ol><li> Esprimere i dati come valori medi ± errore standard. Confrontare il control e i gruppi di trattamento per l&#39;esecuzione di analisi della varianza (ANOVA) e il test di Tukey con Bonferroni e Dunn-Sidak prova Probabilità rettificato (0,95 fiducia%). </li></ol>

<ol><li>Maffei, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+field+effects+on+plant+growth%2C+development%2C+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Magnetic field effects on plant growth, development, and evolution.</a> Front. Plant Sci. 5, (2014).</li>
<li>Occhipinti, A., De Santis, A., Maffei, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetoreception%3A+an+unavoidable+step+for+plant+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Magnetoreception: an unavoidable step for plant evolution.</a> Trends Plant Sci. 19 (1), 1-4 (2014).</li>
<li>Harris, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+magnetic+fields+on+cryptochrome-dependent+responses+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Royal+Soc.+Interf%22%5BJournal%5D)">Effect of magnetic fields on cryptochrome-dependent responses in Arabidopsis thaliana.</a> J. Royal Soc. Interf. 6 (41), 1193-1205 (2009).</li>
<li>Phirke, P. S., Kubde, A. B., Umbarkar, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+magnetic+field+on+plant+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Seed+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">The influence of magnetic field on plant growth.</a> Seed Sci. Technol. 24 (2), 375-392 (1996).</li>
<li>Abe, K., Fujii, N., Mogi, I., Motokawa, M., Takahashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+a+high+magnetic+field+on+plant%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Sci.+Space%22%5BJournal%5D)">Effect of a high magnetic field on plant.</a> Biol. Sci. Space. 11, 240-247 (1997).</li>
<li>Volpe, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+zero-frequency+and+oscillating+magnetic+fields+with+biostructures+and+biosystems%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Interactions of zero-frequency and oscillating magnetic fields with biostructures and biosystems.</a> Photochem. Photobiol. Sci. 2 (6), 637-648 (2003).</li>
<li>Belyavskaya, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+effects+due+to+weak+magnetic+field+on+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Space.+Res%22%5BJournal%5D)">Biological effects due to weak magnetic field on plants.</a> Adv. Space. Res. 34 (7), 1566-1574 (2004).</li>
<li>Weber Bittl, R., S, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+radical+pairs+studied+by+time-resolved+EPR%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta-+Bioenerg%22%5BJournal%5D)">Transient radical pairs studied by time-resolved EPR.</a> Biochim. Biophys. Acta- Bioenerg. 1707 (1), 117-126 (2005).</li>
<li>Pazur Galland, P., A, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetoreception+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Plant+Res%22%5BJournal%5D)">Magnetoreception in plants.</a> J. Plant Res. 118 (6), 371-389 (2005).</li>
<li>Minorsky, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+geomagnetic+variations+affect+plant+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Atm.+Solar-Terrestr.+Phys%22%5BJournal%5D)">Do geomagnetic variations affect plant function.</a> J. Atm. Solar-Terrestr. Phys. 69 (14), 1770-1774 (2007).</li>
<li>Burda Vanderstraeten, J., H, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+magnetoreception+mediate+biological+effects+of+power-frequency+magnetic+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Tot.+Environ%22%5BJournal%5D)">Does magnetoreception mediate biological effects of power-frequency magnetic fields.</a> Sci. Tot. Environ. 417, 299-304 (2012).</li>
<li>Job, C., Rajjou, L., Lovigny, Y., Belghazi, M., Job, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+protein+oxidation+in+Arabidopsis+seeds+and+during+germination%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Patterns of protein oxidation in Arabidopsis seeds and during germination.</a> Plant Physiol. 138 (2), 790-802 (2005).</li>
<li>Wan, L. L., Ross, A. R. S., Yang, J. Y., Hegedus, D. D., Kermode, A. R. Phosphorylation of the 12 S globulin cruciferin in wild-type and abi1-1 mutant Arabidopsis thaliana (thalecress) seeds.. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWan%2C+LL+%22Biochem+J%22">Biochem J</a>. 404, 247-256 (2007).</li>
<li>Sancenon, V., Puig, S., Mira, H., Thiele, D. J., Penarrubia, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+copper+transporter+family+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of a copper transporter family in Arabidopsis thaliana.</a> Plant Mol. Biol. 51 (4), 577-587 (2003).</li>
<li>Foyer, C. H., Karpinska, B., Krupinska, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functions+of+Whirly1+and+Redox-Responsive+Transcription+Factor+1+in+cross+tolerance+responses+in+plants%3A+A+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Philos.Trans.Royal+Soc.B-Biol.Sci%22%5BJournal%5D)">The functions of Whirly1 and Redox-Responsive Transcription Factor 1 in cross tolerance responses in plants: A hypothesis.</a> Philos.Trans.Royal Soc.B-Biol.Sci. 369 (1640), 20130226(2014).</li>
<li>Myouga, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+heterocomplex+of+iron+superoxide+dismutases+defends+chloroplast+nucleoids+against+oxidative+stress+and+is+essential+for+chloroplast+development+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A heterocomplex of iron superoxide dismutases defends chloroplast nucleoids against oxidative stress and is essential for chloroplast development in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 20 (11), 3148-3162 (2008).</li>
<li>Mhamdi, A., Queval, G., Chaouch, S., Vanderauwera, S., Van Breusegem, F., Noctor, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalase+function+in+plants%3A+a+focus+on+Arabidopsis+mutants+as+stress-mimic+models%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exper.+Bot%22%5BJournal%5D)">Catalase function in plants: a focus on Arabidopsis mutants as stress-mimic models.</a> J. Exper. Bot. 61 (15), 4197-4220 (2010).</li>
<li>Bassham Contento, A. L., C, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increase+in+catalase-3+activity+as+a+response+to+use+of+alternative+catabolic+substrates+during+sucrose+starvation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Increase in catalase-3 activity as a response to use of alternative catabolic substrates during sucrose starvation.</a> Plant Physiol. Biochem. 48 (4), 232-238 (2010).</li>
<li>Kangasjarvi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+roles+for+chloroplast+stromal+and+thylakoid-bound+ascorbate+peroxidases+in+plant+stress+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Diverse roles for chloroplast stromal and thylakoid-bound ascorbate peroxidases in plant stress responses.</a> Biochem. J. 412, 275-285 (2008).</li>
<li>Begara-Morales, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+regulation+of+cytosolic+ascorbate+peroxidase+%28APX%29+by+tyrosine+nitration+and+S-nitrosylation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exper.+Bot%22%5BJournal%5D)">Dual regulation of cytosolic ascorbate peroxidase (APX) by tyrosine nitration and S-nitrosylation.</a> J. Exper. Bot. 65 (2), 527-538 (2014).</li>
<li>Li, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AtrbohD+and+AtrbohF+negatively+regulate+lateral+root+development+by+changing+the+localized+accumulation+of+superoxide+in+primary+roots+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">AtrbohD and AtrbohF negatively regulate lateral root development by changing the localized accumulation of superoxide in primary roots of Arabidopsis.</a> Planta. 241 (3), 591-602 (2014).</li>
<li>Skoog Murashige, T., F, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+revised+medium+for+rapid+growth+and+bioassays+with+tobacco+tissue+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Plant%22%5BJournal%5D)">A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures.</a> Physiol. Plant. 15, 473-497 (1962).</li>
<li>Pfaffl, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+mathematical+model+for+relative+quantification+in+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nuc.+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR.</a> Nuc. Acids Res. 29 (9), (2001).</li>
<li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MIQE+Guidelines%3A+Minimum+Information+for+Publication+of+Quantitative+Real-Time+PCR+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments.</a> Clin. Chem. 55 (4), 611-622 (2009).</li>
<li>Phillips, M. A., D'Auria, J. C., Luck, K., Gershenzon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+candidate+reference+genes+for+real-time+quantitative+PCR+of+plant+samples+using+purified+cDNA+as+template%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol.+Rep%22%5BJournal%5D)">Evaluation of candidate reference genes for real-time quantitative PCR of plant samples using purified cDNA as template.</a> Plant Mol. Biol. Rep. 27 (3), 407-416 (2009).</li>
<li>Andersen, C. L., Jensen, J. L., Orntoft, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalization+of+real-time+quantitative+reverse+transcription-PCR+data%3A+A+model-based+variance+estimation+approach+to+identify+genes+suited+for+normalization%2C+applied+to+bladder+and+colon+cancer+data+sets%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Normalization of real-time quantitative reverse transcription-PCR data: A model-based variance estimation approach to identify genes suited for normalization, applied to bladder and colon cancer data sets.</a> Cancer Res. 64 (15), 5245-5250 (2004).</li>
<li>Tsukaya, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+genetics+of+leaf+morphogenesis+in+dicotyledonous+plants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Plant+Res%22%5BJournal%5D)">Developmental genetics of leaf morphogenesis in dicotyledonous plants.</a> J. Plant Res. 108 (1092), 407-416 (1995).</li>
<li>Szymanowska-Pulka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Form+matters%3A+morphological+aspects+of+lateral+root+development%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Bot%22%5BJournal%5D)">Form matters: morphological aspects of lateral root development.</a> Ann. Bot. 112 (9), 1643-1654 (2013).</li>
<li>Black Bewley, J. D., Seeds, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBlack+Bewley%2C+JD+%22Physiology+of+development+and+germination%22">Physiology of development and germination</a>. , Plenum Press. New York. (1994).</li>
<li>Kato-Noguchi, H., Ota, K., Kujime, H., Ogawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+momilactone+on+the+protein+expression+in+Arabidopsis+germination%5BTitle%5D)+AND+%22Weed+Biol.+Manage%22%5BJournal%5D)">Effects of momilactone on the protein expression in Arabidopsis germination.</a> Weed Biol. Manage. 13 (1), (2013).</li>
<li>Khandelwal, A., Elvitigala, T., Ghosh, B., Quatrano, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+transcriptome+reveals+control+circuits+regulating+redox+homeostasis+and+the+role+of+an+AP2+transcription+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis transcriptome reveals control circuits regulating redox homeostasis and the role of an AP2 transcription factor.</a> Plant Physiol. 148 (4), 2050-2058 (2008).</li>
<li>Haddad, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen-sensing+mechanisms+and+the+regulation+of+redox-responsive+transcription+factors+in+development+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Respirat.+Res%22%5BJournal%5D)">Oxygen-sensing mechanisms and the regulation of redox-responsive transcription factors in development and pathophysiology.</a> Respirat. Res. 3 (1), (2002).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Abbiamo recentemente dimostrato che esiste una correlazione tra la stupefacente inversioni GMF e il momento in cui la deviazione della maggior parte dei lignaggi Angiosperme familiari verificato 2. Tuttavia, nonostante le ipotesi stimolanti e la pletora di studi sugli effetti di varie intensità GMF, l&#39;ipotesi che GMF inversione stessa può indurre cambiamenti significativi nell&#39;espressione genica delle piante e la morfologia non è mai stata dimostrata. Qui mostriamo per la prima volta, un metodo che utilizza un triassiale ottagonale bobina di Helmholtz per invertire GMF nel nostro laboratorio, e che l&#39;inversione del campo magnetico ambientale può causare variazioni fenotipiche e la modulazione dell&#39;espressione genica nelle piante. Per ottenere GMF inversione (o modifica) in un volume sufficiente per gli esperimenti di crescita delle piante (2 x 2 x 2 m 3), abbiamo costruito un sistema di bobine di Helmholtz ottagonale. Questo sistema non è disponibile in commercio (bobine di Helmholtz solito sono sagomate ad anello e più piccolo)e le spese per la costruzione sono stati notevoli. È importante sottolineare che questo sistema offre robusto modifica campo, con eccezionale tempo stabilità e l&#39;omogeneità del campo magnetico modificati. Il sistema è progettato e costruito per ridurre il valore della GMF di un millesimo delle condizioni normali o invertire qualsiasi delle tre dimensioni del campo magnetico. Tuttavia, la progettazione delle bobine non consente di generare una alta intensità di campo magnetico. Pertanto, questo strumento nella forma attuale non è adatto per esperimenti volti a valutare l&#39;effetto della elevata resistenza di campo magnetico su piante o altri organismi. In laboratorio, alterazione della GMF simili a quelli descritti in questo metodo è stato ottenuto con metodi diversi, compresi schermatura circondando la zona sperimentale da piastre metalliche ferromagnetiche con elevata permeabilità magnetica, che si discostano campi magnetici e li concentrano all&#39;interno del metallo stesso. The vantaggio di utilizzare bobine di Helmholtz è che il sistema permette alle piante di essere esposti a condizioni più naturali (luce, la ventilazione, ecc), che lo rendono ideale non solo per gli studi in vitro (come con l&#39;uso di piastre Petri) ma anche in vivo la crescita delle piante e gli esperimenti di sviluppo. Le dimensioni del nostro sistema creano uno spazio che permette una soppressione fino a &lt;1 / 1000e del natural GMF tutto a 25 x 25 x 25 cm 3 volume sferico (vedere Figura 1A), permettendo così di ospitare più piastre Petri o qualche piccola vasi per la crescita delle piante. Il metodo qui presentato è stato applicato a studi di biologia vegetale; tuttavia, il sistema consente una vasta gamma di sperimentazione, compresi virologia e microbiologia, nonché studi su nematodi (Caenorhabditis elegans, ad esempio), artropodi e piccoli animali (compresi topi e ratti). Pertanto, test dell&#39;ipotesi che l&#39;inversione del GMF è in gradoper indurre cambiamenti morfologici e trascrizionali potrebbe anche essere esteso a molti altri sistemi viventi, forse in ultima analisi anche per le cellule umane. La GMF è in continua evoluzione e fluttuante. Pertanto, nei nostri esperimenti una sfida importante è quello di fornire una costante compensazione della GMF per ottenere i nuovi valori GMF desiderati. Questo può essere raggiunto solo da un controllo continuo di valori dei campi magnetici attraverso la lettura dei valori magnetometri e compensazione della tensione. Pertanto, il sistema può compensare la parte lentamente variabile della GMF ma non fa nulla per le fluttuazioni di frequenza superiore. In conclusione, l&#39;utilizzo di bobine triassiali per invertire il vettore GMF stato determinante per dimostrare che questa inversione del vettore GMF è in grado di indurre vegetali cambiamenti morfologici e l&#39;espressione genica differenziale. I risultati ottenuti con il metodo presentato forniscono una prova convincente a sostegno dell&#39;ipotesi che la ri GMFversals avrebbe potuto essere una delle forze trainanti per l&#39;evoluzione piante su scale temporali geologiche 2.

Il campo magnetico della Terra (o equivalentemente il campo geomagnetico, GMF) è un fattore ambientale imprescindibile per tutti gli organismi viventi del pianeta, incluse le piante. La GMF è sempre stata una caratteristica naturale della Terra, così durante l&#39;evoluzione, tutti gli organismi viventi sperimentato la sua azione. Un numero crescente di prove dimostra che il GMF è in grado di influenzare molti processi biologici 1. La GMF non è uniforme e vi sono differenze significative locali nella sua grandezza e direzione sulla superficie della Terra. La GMF sulla superficie della Terra mostra una vasta gamma di grandezze, che vanno da meno di 30 microtesla per quasi 70 microtesla. Il GMF protegge la Terra e la sua biosfera dagli effetti letali di vento solare deviando maggior parte delle sue particelle cariche attraverso la magnetosfera 2. Le piante rispondono agli stimoli ambientali; e le risposte classiche a fattori abiotici come la luce e la gravità sono stati thoroughly descritto definendo le cosiddette risposte fototropiche e gravitropica. Molto poco, o nulla, si sa sui meccanismi di percezione e le risposte delle piante a campi magnetici, nonostante la pletora di lavori pubblicati su questo argomento e recentemente recensito 1. A differenza del campo gravitazionale, la GMF è cambiato costantemente nel corso dell&#39;evoluzione dell&#39;impianto rappresenta quindi un fattore di stress abiotico importante che è stata recentemente considerata una potenziale forza trainante alla fine di contribuire a piantare diversificazione e speciazione 2. Inversioni geomagnetiche (o escursioni) sono cambiamenti nella polarità del GMF. Durante la vita-storia della Terra, inversioni GMF si è verificato più volte. Questi esposti il ​​pianeta a periodi di ridotta forza GMF durante ogni transizione polarità. Alcuni autori hanno ipotizzato che queste transizioni periodi di bassa forza GMF avrebbero permesso radiazioni ionizzanti dal vento solare di raggiungere la superficie terrestre, inducendo in tal modo unasforzo coerente per gli organismi viventi, che avrebbe potuto essere abbastanza forte da indurre alterazioni del gene che alla fine portano a piantare evoluzione 2. Un&#39;analisi dettagliata di esperimenti che descrivono gli effetti dei campi magnetici sulle piante mostra un gran numero di notizie contrastanti, caratterizzate da una carenza di plausibili meccanismi di interazione biofisici. Molti esperimenti sono semplicemente irrealistico, mentre altri mancano un&#39;ipotesi verificabile e, in ultima analisi, non sono convincenti 3. Negli ultimi anni, lo stato di avanzamento della ricerca sugli effetti dei campi magnetici sulla pianta è stato rivisto 2,4-11. Recentemente, l&#39;effetto sia del campo magnetico a bassa ed alta è stata ampiamente discussa 1, con una particolare attenzione al coinvolgimento degli eventi di inversione GMF sull&#39;evoluzione pianta 2. Il mezzo più diretto per comprovare l&#39;ipotesi che le inversioni GMF influenzano l&#39;evoluzione pianta è di sintetizzare un GMFinversione in laboratorio testando la risposta delle piante alle condizioni di campo magnetico normali e invertiti. Per verificare l&#39;ipotesi, quindi abbiamo costruito una ottagonale Helmholtz coil coppie campo magnetico sistema di compensazione triassiale (bobine triassiali), che è in grado di invertire precisione le normali condizioni GMF. Abbiamo usato Arabidopsis thaliana come pianta modello e abbiamo testato l&#39;effetto di inversione GMF sull&#39;espressione genica di alcuni geni importanti: CRUCIFERIN 3 (CRU3), che codifica per una proteina di riserva 12S seme che è tirosina-fosforilata e il suo stato di fosforilazione è modulata in risposta di ABA nei semi di Arabidopsis thaliana 12,13; il rame Trasporti protein1 (COTP1), che codifica per una proteina superfamiglia trasporto heavy metal / disintossicazione con la funzione predominante nel suolo acquisizione Cu e polline di sviluppo 14; e Redox Responsive Trascrizione Factor1 (RRTF1),che codifica un membro del FER (fattore di risposta etilene) sottofamiglia B-3 di ERF / AP2 famiglia fattore di trascrizione che contiene un dominio AP2 che facilitano la sinergica co-attivazione di geni vie di espressione e conferisce tolleranza crociata per abiotiche e biotiche sottolinea 15. Inoltre abbiamo anche analizzato cinque geni coinvolti nelle risposte allo stress ossidativo: Fe superossido Dismutase1, (FSD1), che codifica un enzima citoplasmatico che enzimaticamente e rapidamente converte l&#39;anione superossido (O 2 -) e acqua (H 2 O) al perossido di idrogeno (H 2 O 2) e ossigeno molecolare (O 2) 16; Catalase3 (CAT3), che codifica e che enzima che catalizza la ripartizione di H 2 O 2 in acqua e ossigeno 17,18; Thylakoidal ascorbato perossidasi (tapX), che codifica una cloroplastica perossidasi tilacoidale che distrugge H 2 O2 19; ascorbato Peroxidase1 (APX1), che codifica una perossidasi citosolico che scavenges H 2 O 2 e rappresenta uno dei potenziali bersagli di modificazioni post-traduzionali mediata da molecole derivate NO 20; e NADPH- respiratoria proteina scoppio ossidasi D (RbohD) che codifica un enzima che genera O 2 - e svolge un ruolo cardine nella regolazione della crescita, lo sviluppo e le risposte allo stress in Arabidopsis 21. La nostra metodologia campo inversione fornisce la prima evidenza che GMF inversione può indurre un cambiamento significativo nell&#39;espressione genica morfologia e di A. radici e germogli. thaliana Questo protocollo fornisce un modo innovativo per valutare l&#39;effetto di inversione GMF sulla morfologia delle piante e l&#39;espressione genica e può essere utilizzato per valutare l&#39;effetto potenziale di GMF inversione su altri aspetti del comportamento delle piante, e quindi guidare discussione del role di GMF inversione sull&#39;evoluzione delle piante.

<table><tbody><tr><td>Magnetometro a tre assi</td><td>Bartington</td><td>Mag-03MC</td><td>magnetometro triassiale fluxgate</td></tr><tr><td>Alimentatore magnetometro</td><td>Bartington&nbsp;</td><td>Mag-03PSU</td><td>magnetometro triassiale fluxgate Magnetometro</td></tr><tr><td>software</td><td>Bartington&nbsp;</td>Alimentatore CC del <td>magnetometro triassiale fluxgate</td> <td>Mag03DAM</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td>E3642A</td><td></td></tr><tr><td>Ipoclorito di calcio&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>211389</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>X100&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo&nbsp;</td><td>Lampade a</td> vapori di sodio Sigma <td>2860</td><td></td></tr><tr><td>GroLux&nbsp;</td><td>Kit di RNA per piante OSRAM Sylvania</td><td>600W</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>74903</td><td></td></tr><tr><td>DNasi senza RNasi</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalizzatore Agilent 2100</td><td>Tecnologie Agilent</td><td>G2938B</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop ND-1000&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>non disponibile</td><td></td></tr><tr><td>Kit di trascrizione inversa del cDNA ad alta capacità&nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>4368813</td><td></td></tr><tr><td>Mx3000P</td><td>Agilent Technologies</td><td>401512</td><td></td></tr><tr><td>2x MaximaTM SYBR Green qPCR Master Mix&nbsp;</td><td>Fermentas International, Inc</td><td>K0221</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma</td><td>P7793-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Murashige e Skoog Basal Medium Sigma</td><td></td><td>M5519&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Piastra Petri quadrata (120 x120 mm2)</td><td>Sigma</td><td>Z692344&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

geomagnetico field (gmf) e stabilimento evolution: studio degli effetti di gmf storno su<em&gt; arabidopsis thaliana</em&gt; sviluppo e gene expression

Geomagnetic Field (Gmf) and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression

Una delle osservazioni più stimolanti di evoluzione delle piante è una correlazione tra la presenza di campo magnetico terrestre (GMF) rigiri (o escursioni) e il momento della radiazione di Angiosperme. Ciò ha portato ad ipotizzare che alterazioni GMF polarità possono svolgere un ruolo nell&#39;evoluzione delle piante. Qui, si descrive un metodo per testare questa ipotesi esponendo Arabidopsis thaliana per invertire artificialmente condizioni GMF. Abbiamo usato un magnetometro a tre assi ei dati raccolti sono stati utilizzati per calcolare l&#39;entità del GMF. Tre alimentatori DC sono stati collegati a tre coppie bobina Helmholtz e sono stati controllati da un computer per modificare le condizioni GMF. Le piante coltivate in piastre di Petri sono stati esposti sia normale e invertite le condizioni GMF. Sono stati inoltre effettuati esperimenti di esposizione Sham. Piante esposte sono stati fotografati durante l&#39;esperimento e le immagini sono state analizzate per calcolare la lunghezza delle radici e le aree di foglie. Arabidopsis RNA totale è stato estratto e quantitativaTime-PCR reale (qPCR) è stato analizzato l&#39;espressione genica di CRUCIFERIN 3 (CRU3), trasporto del rame protein1 (COTP1), Redox Responsive Trascrizione Factor1 (RRTF1), Fe superossido dismutasi 1, (FSD1), Catalase3 (CAT3), Thylakoidal ascorbato perossidasi (tapX), un ascorbato citosolica Peroxidase1 (APX1), e NADPH / respiratorio proteina scoppio ossidasi D (RbohD). Quattro differenti geni di riferimento sono stati analizzati per normalizzare i risultati della qPCR. Il migliore dei quattro geni è stato selezionato e il gene più stabile per la normalizzazione è stato utilizzato. I nostri dati dimostrano per la prima volta che invertendo la polarità GMF utilizzando bobine triassiali ha effetti significativi sulla crescita delle piante e l&#39;espressione genica. Questo supporta l&#39;ipotesi che GMF inversione contribuisce a indurre cambiamenti nello sviluppo pianta che potrebbero giustificare una pressione superiore selettiva, portando infine a pevoluzione lant.

L&#39;obiettivo di questo protocollo è quello di fornire un metodo per valutare se l&#39;inversione del campo magnetico terrestre (GMF), può influenzare lo sviluppo delle piante e l&#39;espressione genica di Arabidopsis thaliana ecotipo Col 0. bobine triassiali come mostrato in Figura 1A sono utilizzati per invertire la GMF quando set con le tensioni di unità appropriate (Figura 1B), ottenuto come descritto al punto 1.5 nel protocollo. Le dimensioni delle bobine triassiali sono ~ 2 x 2 x 2 m 3, che ha permesso spazio sufficiente con condizioni GMF invertiti per ospitare più piastre di Petri. I controlli sono stati coltivati ​​nelle stesse condizioni ambientali e alle normali valori GMF. Dopo 10 giorni di esposizione normale e invertita condizioni GMF, il fenotipo delle piante mostrato evidenti alterazioni morfologiche. Come mostrato in figura 2, piante di controllo (cioè, coltivati ​​in condizioni normali GMF) mostravano lunghezze radicolari con Prob significativamente (Dunn-Sidak e Bonferroni rettificato &lt;0,001;T di Student = 10,68, df = 31) valori elevati (29.41 mm; SEM = 1,04; N = 32) rispetto alle piante esposte a invertita GMF (17.53 mm; SEM = 0,58; N = 36). Negli impianti GMF-invertite, la morfologia dei germogli è stata anche modificata mostrando un ridotto sviluppo di espansione foglio. Le piante esposte a condizioni normali hanno mostrato una superficie media foglia di 4,95 millimetri 2 (SEM 0,025, N = 54), mentre le piante esposte a condizioni GMF invertite hanno mostrato in modo significativo (Dunn-Sidak e Bonferroni rettificato Prob = &lt;0.001; t di Student = 31.32, df = 53) valori foglia inferiore dell&#39;area (3,71 millimetri 2; SEM = 0.032; N = 54). Pertanto, l&#39;esposizione di Arabidopsis a condizioni invertite GMF ha indotto una riduzione in lunghezza radice e superficie fogliare. Foglia espansione e la crescita delle radici dipendono sia la divisione e l&#39;allungamento di 27 cellule. Pertanto, lo sviluppo della pianta, la produttività e la forma fisica generale dipendono da un ottimale Ripresa e la radice del sistema architettura &lt;sup&gt; 28. La lunghezza della radice e foglia ridotte dimensioni delle piante esposte a condizioni GMF invertiti indica la presenza di un sistema di rilevamento in grado di percepire non solo variazioni di intensità del campo magnetico, ma anche per rispondere alle variazioni del campo magnetico &quot;direzione&quot; rispetto alla gravità. L&#39;ipotesi che GMF inversione può influenzare la crescita delle piante trova prove convincenti nei nostri esperimenti, che dimostrano che le condizioni di inversione GMF possono influenzare in modo significativo lo sviluppo della pianta. I cambiamenti morfologici sono stati accompagnati anche da cambiamenti nell&#39;espressione genica. Tra geni housekeeping, il gene più stabile era il fattore di allungamento 1B subunità alfa 2. Il primo gruppo di geni (CRU3, COTP1, RRTF1) mostrava un&#39;alterazione drammatica dell&#39;espressione genica (Figura 3). Sparare espressione di tutti i tre geni è risultato significativamente aumentato (P &lt;0,05) di circa 2,5 volte in impianti esposti a riservad condizioni GMF. Espressione radice di CRU3 stata sovraregolati nelle radici di piante esposte a condizioni normali di GMF, ma era significativamente (P &lt;0.05) downregulated in condizioni GMF invertiti. L&#39;opposto è stato trovato per COTP1 e RRTF1, che sono stati downregulated in condizioni normali e upregulated in presenza di GMF inversione (Figura 3). Cruciferin (una globulina 12 S) è il più abbondante proteina di riserva nei semi di A. thaliana e altre crocifere e viene sintetizzata come un precursore nel reticolo endoplasmatico rugoso. E &#39;poi ​​trasportato ai vacuoli di stoccaggio delle proteine ​​13. Piantina germinazione richiede la ripartizione dei cruciferin, che viene utilizzato come una prima fonte di azoto. Down-regulation dei cruciferin degrado riduce lo sviluppo di embrioni alterando strutture cellulari o componenti delle cellule di sviluppo 29,30. I nostri risultati mostrano che la sovraregolazione di CRU3 correla conminore espansione del foglio e una lunghezza radice ridotta, indicando così che questo gene in sensibile a GMF inversione e che la sua sovraespressione può contribuire alla riduzione dello sviluppo delle piante. Inoltre, GMF inversione induce una sottoregolazione significativa di CRU3 nelle radici, che è correlato con una lunghezza radice ridotta. Il rame è un cofattore essenziale per i processi chiave di piante, ma esercita effetti dannosi quando in eccesso; quindi, overexpressing trasporto del rame compromette la crescita delle piante. L&#39;effetto di GMF inversione è stata una sovraespressione significativo di COTP1 in entrambi i germogli e le radici, spiegando così la crescita delle piante ridotta. Lo stress Ion altera il metabolismo dei cloroplasti, che è strettamente legata allo stato redox della cellula. In Arabidopsis il fattore di trascrizione RRTF1 è importante per l&#39;espressione di geni associati alla capacità di adattarsi a cambiamenti redox 31. Pertanto, quando le piante sono esposte a stimoli esterni possono modificare il loro sviluppo fisiologico eAl programmi è prevista una sovraespressione di questo importante fattore di trascrizione. Inversione del GMF indotto un significativo sovraespressione di RRTF1 in entrambi i germogli e le radici, indicando così le risposte più elevati di stress ossidativo delle piante alle condizioni GMF invertiti. Risultati interessanti sono ottenuti analizzando i cinque geni coinvolti nello stress ossidativo. In generale, tutti i geni estratti e analizzati nei germogli non mostrano differenze significative (P&gt; 0,05) quando le piante sono state coltivate in condizioni normali o invertiti GMF (Figura 4 e Figura 5). Tuttavia, un significativo down-regulation è sempre osservata in radici di piante esposte a condizioni GMF invertiti. In particolare, CAT3 ha mostrato la down-regulation più alta (Figura 5), seguita in ordine di sottoregolazione da APX1, FSD1, RBOHD e tapX (Figura 4). Tolleranza trasversale di unstress biotici e biotici è fornito dalla attivazione di diversi geni coinvolti in numerose vie biochimiche. fattore di trascrizione RRTF1 facilita la sinergica coattivazione dell&#39;espressione genica di queste vie 15,31, e può essere potenzialmente coinvolti nello stress ossidativo 32. Pertanto, upregulation di RRTF1 è previsto quando scavenging ossigeno si riduce. L&#39;abbassamento di radice enzimi evacuazione correla con la upregulation di RRTF1, che agisce in risposta a un aumento dello stress ossidativo. La drammatica downregulation radice di CAT3, APX1 e tapX indica la ridotta capacità delle cellule di root per pulire H 2 O 2, che è accompagnato dalla ridotta capacità di dismutate l&#39;anione superossido da sottoregolazione di FSD1. Le risposte lo stress ossidativo è più elevata nelle radici, che sembrano essere il luogo principale di invertito percezione GMF. Figura 1. geomagnetico sistema di compensazione campo. (A) bobine triassiali (comprendenti una coppia di bobine ottagonali per ciascuno dei tre assi perpendicolari) utilizzati per invertire il campo vettoriale geomagnetico. (B) Un alimentatore controllato da computer è connesso a ciascuna coppia di bobine di Helmholtz. (Tensioni all&#39;interno di queste cifre sono arbitrari) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53286/53286fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53286/53286fig2.jpg" /> Figura 2. Effetti di inversione di campo geomagnetico su Arabidopsis morfologia. Dopo dieci giorni di esposizione, piante di controllo (ad esempio, quelli esposti alle normali condizioni GMF) mostrano una significativa maggior lunghezza radice e più expanvolantini ded rispetto agli impianti che sono stati esposti a condizioni GMF invertiti. Bar metrico = 18 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53286/53286fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53286/53286fig3.jpg" /> Figura 3. Effetti di inversione di campo geomagnetico sull&#39;espressione genica Arabidopsis. Dopo dieci giorni di esposizione, RNA totale di controllo e piante trattate è stato estratto ed analizzato mediante Real-Time PCR per l&#39;analisi di espressione. L&#39;effetto di inversione del GMF è stato quello di indurre un cambiamento drastico nella espressione genica di tutti i geni che sono stati testati CRU3, Cruciferin 3;. COTP1, rame Trasporto protein1; RRTF1, Redox Responsive Trascrizione Factor1. Barre indicano errore standard; asterischi indica significative (p &lt;0,05) differenze tra plformiche esposti a condizioni GMF invertito e normali. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53286/53286fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53286/53286fig4.jpg" /> Figura 4. Effetti di inversione di campo geomagnetico su Arabidopsis geni antiossidanti legate. Dopo dieci giorni di esposizione, l&#39;RNA totale di controllo e di piante trattate è isolato e impiegato per l&#39;analisi dell&#39;espressione genica mediante Real-Time PCR. L&#39;effetto di inversione del GMF è stato quello di indurre cambiamenti significativi nell&#39;espressione genica sparare; tuttavia, un drastico downregulation è stata osservata in espressione genica radicale delle piante coltivate in condizioni GMF invertite tapX, Thylakoidal Ascorbato perossidasi,. APX1, ascorbato Peroxidase1, FSD1, Fe superossido Dismutase1; RbohD, NA. DPH / respiratoria scoppio ossidasi proteina D Bar indicano errore standard; asterischi indica significativi (p &lt;0.05) le differenze tra le piante esposte a condizioni invertite GMF e normali. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53286/53286fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53286/53286fig5.jpg" /> Figura 5. Effetti della inversione di campo geomagnetico su Arabidopsis catalasi 3 (CAT3) l&#39;espressione genica. Dopo dieci giorni di esposizione, l&#39;RNA totale di controllo e di piante trattate è isolato e impiegato per l&#39;analisi dell&#39;espressione genica mediante Real-Time PCR. L&#39;effetto di inversione del GMF è stato quello di indurre cambiamenti significativi nell&#39;espressione genica sparare; tuttavia, una drastica downregulation stata osservata espressione genica radicale delle piante coltivate in condizioni GMF invertiti. Barre indicano erro normar; asterischi indica significativi (p &lt;0.05) le differenze tra le piante esposte a condizioni invertite GMF e normali. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53286/53286fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

Questo protocollo descrive un metodo per testare l'ipotesi che l'inversione del campo geomagnetico effettivo (GMF) induca un'espressione genica differenziale e alteri la morfologia di Arabidopsis thaliana. Un sistema ottagonale triassiale di coppie di bobine di Helmholtz è stato utilizzato per generare artificialmente condizioni GMF invertite nella camera di crescita delle piante.

Geomagnetico Field (Gmf) e Stabilimento Evolution: studio degli effetti di Gmf Storno su<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Sviluppo e Gene Expression

One of the most stimulating observations in plant evolution is a correlation between the occurrence of geomagnetic field (GMF) reversals (or excursions) ...

L'obiettivo generale di questa procedura è produrre l'inversione del campo magnetico terrestre o GMF mediante bobine di Helmholz controllate da un alimentatore. In definitiva, si dimostra che l'inversione del GMF influisce sulla morfologia e sull'espressione genica delle piante. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'evoluzione vegetale, come ad esempio se l'inversione del campo magnetico terrestre abbia potuto svolgere un ruolo nell'evoluzione e nell'adattamento delle piante.Il principale vantaggio di questa tecnica è che può essere utilizzato per verificare gli effetti biologici potenziali di campi magnetici deboli in un organismo modello semplice, che può essere coltivato con numerose repliche, tutte in condizioni rigorosamente controllate. La dimostrazione di questa procedura sarà effettuata da Alberto Bocco e da uno studente da me guidato, nonché da Kiara aa. È una studentessa di dottorato nel mio laboratorio e CIA Bertea, che è professore associato nel mio gruppo.Per iniziare, accendere le tre alimentazioni in corrente continua collegate alle tre coppie di coppie di bobine di Helmholtz e accendere il magnetometro a tre assi il cui sonda è inserita nelle bobine triassiali. Accendere il computer ed avviare il software del magnetometro che permette di raccogliere i dati dal magnetometro a tre assi. Le alimentazioni sono inoltre collegate a un computer tramite connessione A-G-P-I-B per il controllo.Impostare le tensioni delle alimentazioni elettriche per generare il campo magnetico desiderato con un vettore di campo magnetico invertito, come descritto nel protocollo testuale. Posizionare i semi dell'ecotipo Columbia di Arabidopsis Aliana in un tubo da 1,5 millilitri, sterilizzati mediante trattamento con una soluzione di ipoclorito di calcio per 10-12 minuti a 25-28 gradi Celsius con agitazione continua. Successivamente, risciacquare i semi due volte con etanolo all'80%, seguito da un lavaggio con etanolo al 100%.E infine, un risciacquo con acqua distillata sterile. Preparare un litro di mezzo Murrah Shiga e SCOG modificato come descritto nel protocollo testuale prima della solidificazione. Versare 80 millilitri di mezzo in ogni piastra di Petri quadrata, disponendo 30 semi sterili su ogni piastra.Quindi sigillare le piastre con un film ceroso. Incubare le piastre in posizione orizzontale al buio a quattro gradi Celsius per due giorni per potenziare e sincronizzare la germinazione. Preparare le lampade a vapore di sodio coprendo il fascio luminoso con un film di gelatina blu per ridurre la componente rossa delle lampade dopo la vernalizzazione.Preparare l'esposizione delle piastre di Petri a GMF normale o invertito. Esporre i semi in un ambiente climatizzato a 22 gradi Celsius in posizione verticale. In esperimenti paralleli sia all'esterno che all'interno delle bobine triassiali.Con un fotoperiodo di otto ore di buio e 16 ore di luce. Dopo l'esposizione, scattare fotografie delle piastre di Petri per calcolare la lunghezza delle radici e la superficie fogliare. Misurare innanzitutto il lato della piastra di Petri.Quindi aprire l'immagine della piastra di Petri nel software ImageJ e utilizzare l'opzione linea retta per tracciare una linea che attraversi esattamente il lato della piastra. Nel menu Analizza, selezionare Imposta scala e inserire la distanza reale nel campo Distanza nota. Quindi inserire l'unità di lunghezza.E infine fare clic sull'opzione globale per rendere le impostazioni disponibili per tutte le misurazioni della lunghezza della radice. Seguire attentamente la forma della radice utilizzando lo strumento a mano libera. Misurare la lunghezza utilizzando l'opzione di misura nel menu analizza.Continuare a misurare tutte le radici nell'immagine e salvare il file per ulteriori analisi statistiche. Per la superficie fogliare, dal menu dell'immagine utilizzare l'opzione aggiusta, seguita da soglia colore, selezionare la singola foglia e, nel menu analizza, scegliere analizza particelle, salvando le singole misurazioni per l'analisi statistica. Raccogliere separatamente 30 getti e 30 radici e congelarli immediatamente in azoto liquido.Quindi macinare in azoto liquido con mortaio e pestello prima di isolare l'RNA totale come descritto nel protocollo testuale; eseguire tutti gli esperimenti su un sistema in tempo reale utilizzando cyber green one con ROX come standard interno di carico, effettuare la reazione con una miscela di 25 microlitri. Utilizzando i primer elencati nel protocollo testuale, includere controlli senza trascrizione inversa per monitorare la contaminazione da DNA genomico, oltre a controlli senza stampo. Leggere la fluorescenza dopo ogni fase di annealing e di estensione.Le due lenti di ingrandimento rappresentano i dati raccolti, inclusi i tratti di associazione e dissociazione. Passare alla schermata di analisi e configurazione e verificare che sia selezionato il set di dati raccolto durante il segmento di dissociazione dell'esperimento. Per l'analisi di tutte le prove, eseguire un'analisi della curva di fusione da 55 a 95 gradi Celsius includendo il segmento di dissociazione nel profilo termico.Utilizzare la schermata della curva di dissociazione accessibile tramite la scheda dei risultati per visualizzare il profilo di dissociazione. Analizzare tutti i tracciati di amplificazione con il software dello strumento di PCR in tempo reale.Per ottenere i valori CT, calibrare e normalizzare i livelli relativi di RNA con il livello dei migliori geni di controllo. Accedere alla schermata dei grafici di amplificazione tramite la scheda dei risultati. Selezionare la rampa o la fase plateau per cui devono essere analizzati i dati utilizzando la schermata di analisi, selezione e configurazione.Quindi selezionare la fluorescenza normalizzata corretta per la linea di base dal menu della fluorescenza sul pannello dei comandi. Accedere alla schermata dei valori campione della piastra attraverso la scheda dei risultati. Per visualizzare i valori CT per le pozzette campionate.Utilizzare quattro geni di riferimento diversi per normalizzare i risultati della PCR in tempo reale. Selezionare il gene con il punteggio più alto utilizzando il software di analisi e usare il gene più stabile per la normalizzazione. Organizzare brevemente i dati di input in un foglio Excel con la prima colonna contenente i nomi dei geni e la prima riga contenente i nomi dei campioni.Quindi selezionare il software di analisi dalla barra del menu. Utilizzare la finestra di dialogo per selezionare i dati di input. Successivamente, verificare i nomi dei campioni, i nomi dei geni e selezionare solo l'output semplice.Fare clic sul pulsante vai per eseguire l'analisi, selezionando il gene con il rango più alto come gene candidato maggiormente stabile nell'espressione. Dopo 10 giorni di esposizione, le piante di controllo mostrano una lunghezza radicale significativamente maggiore e foglioline più espanse rispetto alle piante esposte a condizioni di GMF invertito dopo 10 giorni di esposizione. L'effetto dell'inversione del GMF è stato un cambiamento drastico nell'espressione genica di tutti i geni testati, inclusa la crucifera nella proteina trasportatrice del rame uno e nel fattore di trascrizione responsivo alla redox uno; le barre indicano l'errore standard, l'asterisco indica differenze significative tra piante esposte a condizioni di GMF invertito e normale.L'effetto dell'inversione del GMF non ha indotto cambiamenti significativi nell'espressione genica delle parti aeree. Tuttavia, è stata osservata una drastica downregolazione nell'espressione genica radicale delle piante coltivate. In condizioni di GMF invertito, questi geni includono thal, aate perossidasi, aate perossidasi, una superossido dismutasi del ferro, una N-A-D-P-H, ossidasi della risposta respiratoria, proteina e catalizzatore tre.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in pochi minuti fino a oggi, a seconda dell'esperimento richiesto, se eseguita correttamente. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona idea di come invertire o alterare il campo geomagnetico ed eseguire studi morfologici e genetici su piante esposte. Durante il tentativo di questa procedura, è importante rimuovere ogni fonte di campo magnetico dalla zona circondata dalle bobine a elmetto.È importante che le bobine del casco e i loro generatori non producano calore o vibrazioni. L'investigatore dovrebbe rimanere in cecità riguardo alla condizione di esposizione al campo magnetico fino a quando non saranno stati registrati i dati finali. Questa tecnica ha permesso ai ricercatori nel campo della magnetoricezione di esplorare l'effetto dei campi magnetici sull'evoluzione delle piante, sul comportamento e sulla navigazione animale e sulle linee cellulari umane.In futuro, speriamo di condurre studi simili in condizioni di microgravità al fine di valutare come l'alterazione del campo magnetico influenzerà la crescita delle piante in ambiente spaziale. L'uso di sistemi che generano campi magnetici deboli non è considerato pericoloso. Tuttavia, è necessario adottare le normali precauzioni e consultare un elettricista qualificato prima di utilizzare apparecchiature come le alimentazioni per le coppie di bobine di Helm.

geomagnetic-field-gmf-plant-evolution-investigating-effects-gmf

Research

Ricerca

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Le basi molecolari delle risposte fitocromo spazio-specifica è indagato con le piante transgeniche che presentano tessuti e carenze fitocromo organo-specifiche. L'isolamento di cellule specifiche esporre indotte esaurimento fitocromo cromoforo da Fluorescence-Activated cella Ordinamento seguita da analisi di microarray viene utilizzata per identificare i geni coinvolti nello spazio-risposte specifiche fitocromo.

Indagare tessuti e risposte fitocromo organo-specifici utilizzando FACS-Cell-assistita di tipo profili specifici di espressione in Arabidopsis thaliana</em

Una ricerca fondamentale in biologia cellulare è quello di definire i meccanismi che sono alla base l'identità degli organelli che rendono le cellule eucariotiche. Qui vi proponiamo un metodo per identificare i geni responsabili per l'integrità morfologica e funzionale degli organelli vegetali usando la microscopia a fluorescenza e di nuova generazione strumenti di sequenziamento.

Microscopia a fluorescenza-Screening e sequenziamento di prossima generazione: Strumenti utili per l&#39;identificazione di geni coinvolti in organelli Integrity

Descriviamo un protocollo mediante diapositive da camera e media per immobilizzare cotiledoni di impianto per l'imaging confocale dell'epidermide più giorni di sviluppo, documentazione differenziazione stomatica. Proteine ​​fluoroforo-tag possono essere monitorati in modo dinamico attraverso l'espressione e la localizzazione subcellulare, aumentare la comprensione dei ruoli possibili durante la divisione cellulare e la differenziazione delle cellule-tipo.

A lungo termine, ad alta risoluzione confocale Lapse Imaging Tempo di<em&gt; Cotyledon Arabidopsis</emEpidermide&gt; durante la germinazione

Vi presentiamo la procedura per assemblare un seme saggio di biancheria da letto di mano (SCBA) da Arabidopsis thaliana semi. La SCBA ha dimostrato di essere uno strumento potente per esplorare geneticamente e in vitro come il germinazione del seme controlli endosperma nei semi dormienti e in risposta a stimoli luminosi. L'autorespiratore in linea di principio applicabile in qualsiasi situazione in cui l'endosperma è sospettato di influenzare la crescita embrionale.

Un cappotto Seed Bedding Assay per esplorare geneticamente<em&gt; In Vitro</em&gt; Come la Germinazione Controlli endosperma del seme in<em&gt; Arabidopsis thaliana</em

Cromatina immunoprecipitazione è una tecnica potente per l'identificazione di DNA siti di Arabidopsis proteine ​​in vivo vincolante. Questa procedura include cromatina reticolazione e frammentazione, immunoprecipitazione con anticorpi selettivi contro la proteina di interesse, e l'analisi qPCR di DNA legato. Descriviamo un semplice saggio di ChIP ottimizzato per piante di Arabidopsis.

Immunoprecipitazione della cromatina Saggio per la identificazione di Arabidopsis interazioni proteina-DNA<em&gt; In Vivo</em

L'obiettivo di questo protocollo è dimostrare l'accelerazione del tasso di crescita iniziale delle piante applicando campi magnetici statici senza energia esterna.

Valorizzazione del tasso di crescita iniziale delle Piante Agrarie mediante l&#39;utilizzo di campi magnetici statici

Questo protocollo descrive un metodo per osservare l'embriogenesi in Arabidopsis tramite liquidazione ovulo seguita dal controllo della formazione di pattern di embrione sotto un microscopio.

Un metodo per la caratterizzazione di embriogenesi in Arabidopsis

Questo protocollo descrive un metodo semplice per analizzare segnali di calcio negli impianti generati da insetti Pentatomomorfi, come gli afidi. Thaliana di Arabidopsis trasformate con il biosensore di calcio GFP GCaMP3 consentire per l'imaging in tempo reale in vivo della dinamica del calcio con un'alta risoluzione temporale e spaziale.

Registrazione in tempo reale In Vivo di Arabidopsis segnali di calcio durante l'alimentazione dell'insetto utilizzando un biosensore fluorescente

Gibberellina percezione sensore 1 (GPS1) è il primo Förster risonanza energia basati su trasferimento biosensore per misurare i livelli cellulari di fitormoni gibberellina con un'alta risoluzione spazio-temporale. Questo protocollo segnala sul metodo per visualizzare e quantificare i livelli cellulari gibberellina utilizzando il biosensore codificato geneticamente nlsGPS1 in Arabidopsis ipocotili e punte delle radici.

Visualizzazione livelli gibberellina cellulare utilizzando l'energia di risonanza di Förster NlsGPS1 Transfer (FRET) biosensore

Una delicata macchina di caricamento touch-force è costruita da spazzole per capelli umani, bracci robotici e un controller. Le spazzole per capelli sono azionate da bracci robotici installati sulla macchina e si muovono periodicamente per applicare la forza tocco sulle piante. La forza dei tocchi di capelli guidati da macchine è paragonabile a quella dei tocchi applicati manualmente.

Un protocollo dello schermo mutante di segnalazione della forza di manodopera e ripetibile per lo studio della Thigmomorphogenesis di un modello di arabidopsis thaliana

La segnalazione sistemica del calcio extracellulare innescata dal glutammato è fondamentale per l'induzione delle risposte della difesa delle piante al mento meccanico e all'attacco di erbivoro nelle piante. Questo articolo descrive un metodo per visualizzare la dinamica spaziale e temporale di entrambi questi fattori utilizzando piante di thaliana arabidopsis che esprimono biosensori fluorescenti sensibili al calcio e al glutammato.

Imaging in tempo reale a ampio campo dei segnali di ferita locali e sistemici in Arabidopsis

Scopri come invertire il campo geomagnetico con bobine di Helmholtz per studiare la morfologia e l'espressione genica di Arabidopsis thaliana. Questo metodo consente esperimenti controllati sull'evoluzione vegetale.

Geomagnetico Field (Gmf) e Stabilimento Evolution: studio degli effetti di Gmf Storno su Arabidopsis thaliana Sviluppo e Gene Expression (Video) | JoVE Journal

Geomagnetico Field (Gmf) e Stabilimento Evolution: studio degli effetti di Gmf Storno su

Esplora altri video