Geomagnetico Field (Gmf) e Stabilimento Evolution: studio degli effetti di Gmf Storno su

L'obiettivo generale di questa procedura è produrre l'inversione del campo magnetico terrestre o GMF mediante bobine di Helmholz controllate da un alimentatore. In definitiva, si dimostra che l'inversione del GMF influisce sulla morfologia e sull'espressione genica delle piante. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'evoluzione vegetale, come ad esempio se l'inversione del campo magnetico terrestre abbia potuto svolgere un ruolo nell'evoluzione e nell'adattamento delle piante.

Il principale vantaggio di questa tecnica è che può essere utilizzato per verificare gli effetti biologici potenziali di campi magnetici deboli in un organismo modello semplice, che può essere coltivato con numerose repliche, tutte in condizioni rigorosamente controllate. La dimostrazione di questa procedura sarà effettuata da Alberto Bocco e da uno studente da me guidato, nonché da Kiara aa. È una studentessa di dottorato nel mio laboratorio e CIA Bertea, che è professore associato nel mio gruppo.

Per iniziare, accendere le tre alimentazioni in corrente continua collegate alle tre coppie di coppie di bobine di Helmholtz e accendere il magnetometro a tre assi il cui sonda è inserita nelle bobine triassiali. Accendere il computer ed avviare il software del magnetometro che permette di raccogliere i dati dal magnetometro a tre assi. Le alimentazioni sono inoltre collegate a un computer tramite connessione A-G-P-I-B per il controllo.

Impostare le tensioni delle alimentazioni elettriche per generare il campo magnetico desiderato con un vettore di campo magnetico invertito, come descritto nel protocollo testuale. Posizionare i semi dell'ecotipo Columbia di Arabidopsis Aliana in un tubo da 1,5 millilitri, sterilizzati mediante trattamento con una soluzione di ipoclorito di calcio per 10-12 minuti a 25-28 gradi Celsius con agitazione continua. Successivamente, risciacquare i semi due volte con etanolo all'80%, seguito da un lavaggio con etanolo al 100%.

E infine, un risciacquo con acqua distillata sterile. Preparare un litro di mezzo Murrah Shiga e SCOG modificato come descritto nel protocollo testuale prima della solidificazione. Versare 80 millilitri di mezzo in ogni piastra di Petri quadrata, disponendo 30 semi sterili su ogni piastra.

Quindi sigillare le piastre con un film ceroso. Incubare le piastre in posizione orizzontale al buio a quattro gradi Celsius per due giorni per potenziare e sincronizzare la germinazione. Preparare le lampade a vapore di sodio coprendo il fascio luminoso con un film di gelatina blu per ridurre la componente rossa delle lampade dopo la vernalizzazione.

Preparare l'esposizione delle piastre di Petri a GMF normale o invertito. Esporre i semi in un ambiente climatizzato a 22 gradi Celsius in posizione verticale. In esperimenti paralleli sia all'esterno che all'interno delle bobine triassiali.

Con un fotoperiodo di otto ore di buio e 16 ore di luce. Dopo l'esposizione, scattare fotografie delle piastre di Petri per calcolare la lunghezza delle radici e la superficie fogliare. Misurare innanzitutto il lato della piastra di Petri.

Quindi aprire l'immagine della piastra di Petri nel software ImageJ e utilizzare l'opzione linea retta per tracciare una linea che attraversi esattamente il lato della piastra. Nel menu Analizza, selezionare Imposta scala e inserire la distanza reale nel campo Distanza nota. Quindi inserire l'unità di lunghezza.

E infine fare clic sull'opzione globale per rendere le impostazioni disponibili per tutte le misurazioni della lunghezza della radice. Seguire attentamente la forma della radice utilizzando lo strumento a mano libera. Misurare la lunghezza utilizzando l'opzione di misura nel menu analizza.

Continuare a misurare tutte le radici nell'immagine e salvare il file per ulteriori analisi statistiche. Per la superficie fogliare, dal menu dell'immagine utilizzare l'opzione aggiusta, seguita da soglia colore, selezionare la singola foglia e, nel menu analizza, scegliere analizza particelle, salvando le singole misurazioni per l'analisi statistica. Raccogliere separatamente 30 getti e 30 radici e congelarli immediatamente in azoto liquido.

Quindi macinare in azoto liquido con mortaio e pestello prima di isolare l'RNA totale come descritto nel protocollo testuale; eseguire tutti gli esperimenti su un sistema in tempo reale utilizzando cyber green one con ROX come standard interno di carico, effettuare la reazione con una miscela di 25 microlitri. Utilizzando i primer elencati nel protocollo testuale, includere controlli senza trascrizione inversa per monitorare la contaminazione da DNA genomico, oltre a controlli senza stampo. Leggere la fluorescenza dopo ogni fase di annealing e di estensione.

Le due lenti di ingrandimento rappresentano i dati raccolti, inclusi i tratti di associazione e dissociazione. Passare alla schermata di analisi e configurazione e verificare che sia selezionato il set di dati raccolto durante il segmento di dissociazione dell'esperimento. Per l'analisi di tutte le prove, eseguire un'analisi della curva di fusione da 55 a 95 gradi Celsius includendo il segmento di dissociazione nel profilo termico.

Utilizzare la schermata della curva di dissociazione accessibile tramite la scheda dei risultati per visualizzare il profilo di dissociazione. Analizzare tutti i tracciati di amplificazione con il software dello strumento di PCR in tempo reale.

Per ottenere i valori CT, calibrare e normalizzare i livelli relativi di RNA con il livello dei migliori geni di controllo. Accedere alla schermata dei grafici di amplificazione tramite la scheda dei risultati. Selezionare la rampa o la fase plateau per cui devono essere analizzati i dati utilizzando la schermata di analisi, selezione e configurazione.

Quindi selezionare la fluorescenza normalizzata corretta per la linea di base dal menu della fluorescenza sul pannello dei comandi. Accedere alla schermata dei valori campione della piastra attraverso la scheda dei risultati. Per visualizzare i valori CT per le pozzette campionate.

Utilizzare quattro geni di riferimento diversi per normalizzare i risultati della PCR in tempo reale. Selezionare il gene con il punteggio più alto utilizzando il software di analisi e usare il gene più stabile per la normalizzazione. Organizzare brevemente i dati di input in un foglio Excel con la prima colonna contenente i nomi dei geni e la prima riga contenente i nomi dei campioni.

Quindi selezionare il software di analisi dalla barra del menu. Utilizzare la finestra di dialogo per selezionare i dati di input. Successivamente, verificare i nomi dei campioni, i nomi dei geni e selezionare solo l'output semplice.

Fare clic sul pulsante vai per eseguire l'analisi, selezionando il gene con il rango più alto come gene candidato maggiormente stabile nell'espressione. Dopo 10 giorni di esposizione, le piante di controllo mostrano una lunghezza radicale significativamente maggiore e foglioline più espanse rispetto alle piante esposte a condizioni di GMF invertito dopo 10 giorni di esposizione. L'effetto dell'inversione del GMF è stato un cambiamento drastico nell'espressione genica di tutti i geni testati, inclusa la crucifera nella proteina trasportatrice del rame uno e nel fattore di trascrizione responsivo alla redox uno; le barre indicano l'errore standard, l'asterisco indica differenze significative tra piante esposte a condizioni di GMF invertito e normale.

L'effetto dell'inversione del GMF non ha indotto cambiamenti significativi nell'espressione genica delle parti aeree. Tuttavia, è stata osservata una drastica downregolazione nell'espressione genica radicale delle piante coltivate. In condizioni di GMF invertito, questi geni includono thal, aate perossidasi, aate perossidasi, una superossido dismutasi del ferro, una N-A-D-P-H, ossidasi della risposta respiratoria, proteina e catalizzatore tre.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in pochi minuti fino a oggi, a seconda dell'esperimento richiesto, se eseguita correttamente. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona idea di come invertire o alterare il campo geomagnetico ed eseguire studi morfologici e genetici su piante esposte. Durante il tentativo di questa procedura, è importante rimuovere ogni fonte di campo magnetico dalla zona circondata dalle bobine a elmetto.

È importante che le bobine del casco e i loro generatori non producano calore o vibrazioni. L'investigatore dovrebbe rimanere in cecità riguardo alla condizione di esposizione al campo magnetico fino a quando non saranno stati registrati i dati finali. Questa tecnica ha permesso ai ricercatori nel campo della magnetoricezione di esplorare l'effetto dei campi magnetici sull'evoluzione delle piante, sul comportamento e sulla navigazione animale e sulle linee cellulari umane.

In futuro, speriamo di condurre studi simili in condizioni di microgravità al fine di valutare come l'alterazione del campo magnetico influenzerà la crescita delle piante in ambiente spaziale. L'uso di sistemi che generano campi magnetici deboli non è considerato pericoloso. Tuttavia, è necessario adottare le normali precauzioni e consultare un elettricista qualificato prima di utilizzare apparecchiature come le alimentazioni per le coppie di bobine di Helm.