Bioluminescenza Imaging di un Modello immunocompetenti Animal Glioblastoma

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di dimostrare le tecniche appropriate per il monitoraggio delle cellule tumorali e della crescita tumorale intracranica utilizzando l'imaging a bioluminescenza in vivo per verificare l'utilità della modificazione della luciferasi delle cellule tumorali murine GL261. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nello studio dell'immunologia dei tumori e dell'approccio immunoterapeutico. Ad esempio, se la modifica dello stress influisce sulla proliferazione cellulare GL261 e cresce in vivo.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che la modifica della luciferasi delle cellule tumorali GL261 facilita il monitoraggio non invasivo della loro crescita e risposta al trattamento in situ. Quando la coltura cellulare di luciferasi GL261 raggiunge il 70% di confluenza in un pallone T75, raccogliere le cellule mediante tripsinizzazione. Contare le cellule e trasferirle in una piastra a 24 pozzetti a densità graduate.

Dopo tre ore in un incubatore per colture cellulari, aprire il software di imaging a bioluminescenza e inizializzare il sistema di imaging. Quando la fotocamera si è raffreddata a 90 gradi Celsius negativi, impostare il software di imaging su Luminescente con un tempo di esposizione di 10 secondi e un Binning medio. Quindi incubare le cellule in 25 microlitri di luciferina per pozzetto per un minuto a temperatura ambiente e posizionare la piastra sulla stazione di imaging.

Selezionare Acquisisci per avviare l'imaging. Quando un'immagine è stata ottenuta con successo, vengono visualizzate una finestra dell'immagine e una tavolozza degli strumenti. Fare clic su Strumenti Regioni di interesse e selezionare 6 per 4 dall'icona a fessura.

Coprire l'area del segnale con fenditure 6 per 4 e selezionare l'icona a forma di matita nella scheda Misure. Apparirà una finestra con una tabella delle misure della regione di interesse come unità di fotoni al secondo per steradiante per centimetro quadrato. Per eseguire un saggio di proliferazione in vitro, raccogliere le colture cellulari come appena dimostrato quando raggiungono il 70% di confluenza.

E utilizzare una pipetta multicanale per posizionare le cellule tumorali in 20 pozzetti ciascuno di una piastra da 96 pozzetti a 1,5 volte 10 per la terza cellula per 80 microlitri di terreno RPMI per pozzetto. Per limitare l'evaporazione delle colture cellulari, riempire i pozzetti vuoti circostanti con 100 microlitri di terreno RPMI fresco. Quindi, per valutare la proliferazione cellulare, aggiungere 20 microlitri di reagente MTS a ciascun pozzetto di cellule.

E incubare la piastra a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Dopo tre ore, utilizzare un lettore di micropiastre per misurare l'assorbanza a 490 nanometri. Per normalizzare i valori di assorbanza, dividere i valori di ogni giorno per le letture corrispondenti ottenute il primo giorno.

Il giorno dell'impianto, sospendere una volta da 10 a 5 cellule per microlitro in HBSS senza calcio e magnesio da una coltura di cellule tumorali confluenti al 70%. Successivamente, dopo aver confermato il livello appropriato di sedazione con il pizzicamento delle dita, radere la parte superiore della testa di ciascun animale da esperimento. Usando una punta di cotone, pulisci ogni cranio con il 2% di clorexidina.

Quindi applicare il lubrificante sugli occhi di ciascun topo. Ora usa un bisturi sterile per fare un'incisione sagittale lunga circa 1 centimetro sopra l'osso occipitale parietale del primo animale. E pulire nuovamente la superficie del cranio con perossido di idrogeno al 3% notando l'apparente bregma.

Quindi, utilizzando un ago sterile calibro 25, praticare un foro di 3 millimetri nel cranio a destra del bregma e appena dietro la sutura coronale. Per garantire la profondità di iniezione appropriata, utilizzare le forbici per tagliare 3 millimetri dall'estremità appuntita di un puntale per pipetta da 20 microlitri e far scorrere una siringa Hamilton da 26 calibri nel puntale fino a quando 3 millimetri dell'ago sporgono dall'estremità del puntale. Inserire l'ago nel foro del cranio e iniettare lentamente 3 microlitri di 3 volte 10 alla quinta delle cellule tumorali in un periodo di un minuto.

Lasciare l'ago in posizione per un altro minuto e poi ritirarlo lentamente. Sostituire l'osso esposto con una soluzione di perossido di idrogeno al 3% e clorexidina al 2%. Quindi, dopo aver asciugato il cranio con un applicatore di cotone fresco, ritaglia un pezzo di cera sterile per ossa di 3 millimetri quadrati e attacca la cera a un'estremità nuda di un applicatore con punta di cotone.

Coprire il sito di iniezione con la cera ossea. Quindi usa una pinza per tirare ogni lato del cuoio capelluto sopra la cera. Dopo aver chiuso la ferita e somministrato l'appropriata analgesia post-operatoria, ripetere la procedura per ogni animale da esperimento.

Per visualizzare la crescita del tumore intracranico, inizializzare prima la stazione di imaging come appena dimostrato. Successivamente, dopo aver confermato il livello appropriato di sedazione mediante pizzicamento della coda, impostare i parametri del sistema di imaging come appena dimostrato. Ad eccezione della selezione di Auto per il tempo di esposizione.

Quando il sistema di imaging è pronto, posizionare i topi sulla stazione di imaging e selezionare Acquisisci per ottenere immagini dell'espressione della luciferasi. Quando l'immagine è stata acquisita con successo, selezionare lo strumento Regione di interesse dalla tavolozza degli strumenti e Auto dall'icona del cerchio. Circondare le aree di segnale per definire le regioni di interesse e quindi ottenere misurazioni delle regioni come unità di fotoni al secondo, per steradiante per centimetro quadrato.

Infine, rimuovere i topi dalla camera di imaging e monitorare gli animali portatori di tumore fino a quando non si sono completamente ripresi. L'imaging in bioluminescenza in vitro di cellule GL261 infettate con lentivirus contenenti luciferasi mostra una robusta espressione di luciferasi simile ai livelli di luciferasi espressi da una linea cellulare di glioblastoma umano che esprime luciferasi U87MG di controllo positivo. Come previsto, le cellule GL261 non infette non mostrano alcuna espressione di luciferasi di fondo.

Prima dell'impianto intracranico, non si osservano differenze nei tassi di crescita in vitro della luciferasi GL261 e delle linee cellulari GL261. Come dimostra l'imaging seriale a bioluminescenza di animali iniettati per via intracranica con tumore, le cellule tumorali che esprimono luciferasi GL261 mostrano anche un tasso di crescita rapido e costante in vivo senza differenze significative nei tassi di sopravvivenza tra i gruppi sperimentali portatori di tumore osservati. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere utilizzata per visualizzare fino a 25 topi all'ora se eseguita correttamente.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica migliora la capacità dell'imaging a bioluminescenza di essere utile nel monitorare la crescita tumorale di GL261 in vivo, promuovendo lo studio delle risposte immunoterapeutiche in modelli murini immunocompetenti.