Bioluminescenza Imaging di un Modello immunocompetenti Animal Glioblastoma

L'obiettivo generale di questo protocollo è dimostrare le tecniche corrette per monitorare la crescita delle cellule tumorali e dei tumori intracranici mediante imaging bioluminescente in vivo, al fine di verificare l'utilità della modifica con luciferasi delle cellule tumorali murine GL261. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nello studio dell'immunologia tumorale e degli approcci immunoterapici, ad esempio se la modifica genetica influisce sulla proliferazione delle cellule GL261 e sulla loro crescita in vivo.

Il principale vantaggio di questa tecnica è che la modifica delle cellule tumorali GL261 con luciferasi facilita il monitoraggio non invasivo della loro crescita e della risposta al trattamento in situ. Quando la coltura cellulare GL261 espressiva di luciferasi raggiunge una confluenza del 70% in una fiasca T75, raccogliere le cellule mediante tripsinizzazione. Contare le cellule e quindi trasferirle in una piastra a 24 pozzetti a densità graduate.

Dopo tre ore in un incubatore per colture cellulari, aprire il software di imaging bioluminescente e inizializzare il sistema di imaging. Quando la telecamera avrà raggiunto la temperatura di meno 90 gradi Celsius, impostare il software di imaging su Luminescenza con un tempo di esposizione di 10 secondi e un Binning Medio. Incubare quindi le cellule in 25 microlitri di luciferina per pozzetto per un minuto a temperatura ambiente e posizionare la piastra sulla stazione di imaging.

Selezionare Acquisisci per iniziare l'acquisizione delle immagini. Quando un'immagine è stata ottenuta con successo, verranno visualizzate una finestra dell'immagine e una tavolozza degli strumenti. Fare clic su Strumenti per le Regioni di Interesse e selezionare 6 per 4 dall'icona della fessura.

Coprire l'area del segnale con 6 per 4 fessure e selezionare l'icona matita nella scheda Misure. Apparirà una finestra con una tabella delle misurazioni della regione di interesse in unità di fotoni al secondo per steradiante per centimetro quadrato. Per eseguire un saggio di proliferazione in vitro, raccogliere le colture cellulari come appena dimostrato quando raggiungono una confluenza del 70%.

E utilizzare una pipetta multicanale per posizionare le cellule tumorali in 20 pozzetti ciascuno di una piastra a 96 pozzetti, a 1,5 × 10³ cellule per 80 microlitri di mezzo RPMI per pozzetto. Per limitare l'evaporazione delle colture cellulari, riempire i pozzetti vuoti circostanti con 100 microlitri di mezzo RPMI fresco. Successivamente, per valutare la proliferazione cellulare, aggiungere 20 microlitri di reagente MTS in ciascun pozzetto contenente cellule.

E incubare la piastra a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Dopo tre ore, utilizzare un lettore di micropiastre per misurare l'assorbanza a 490 nanometri. Per normalizzare i valori di assorbanza, dividere i valori di ogni giorno per le letture corrispondenti ottenute al primo giorno.

Il giorno dell'impianto, sospendere 1 × 10⁵ cellule per microlitro in HBSS senza calcio e magnesio provenienti da una coltura cellulare tumorale al 70% di confluenza. Successivamente, dopo aver verificato il corretto livello di sedazione mediante pizzicamento del dito del piede, rasare la parte superiore della testa di ciascun animale sperimentale. Utilizzando un applicatore con punta di cotone, pulire ogni cranio con clorhexidina al 2%.

Quindi applicare un lubrificante sugli occhi di ogni topo. Ora utilizzare un bisturi sterile per effettuare un'incisione sagittale di circa 1 centimetro sopra l'osso parietale-occipitale del primo animale. Pulire nuovamente la superficie del cranio con perossido di idrogeno al 3%, notando il bregma apparente.

Quindi, utilizzando un ago sterile da 25 gauge, praticare un foro di 3 millimetri nel cranio a destra del bregma e appena dietro la sutura coronale. Per garantire la corretta profondità di iniezione, usare delle forbici per tagliare 3 millimetri dall'estremità appuntita di una punta da pipetta da 20 microlitri e inserire una siringa Hamilton da 26 gauge nella punta fino a far sporgere 3 millimetri dell'ago dall'estremità della punta. Inserire l'ago nel foro nel cranio e iniettare lentamente 3 microlitri di 3 volte 10 alla 5a delle cellule tumorali nell'arco di un minuto.

Lasciare l'ago in posizione per un altro minuto, quindi ritirarlo lentamente. Scambiare l'osso esposto con una soluzione di perossido di idrogeno al 3% e clorhexidina al 2%. Dopodiché, dopo aver asciugato il cranio con un nuovo applicatore di cotone, ritagliare un pezzo di cera ossea sterile di 3 millimetri quadrati e fissare la cera all'estremità scoperta di un applicatore di cotone.

Coprire il sito di iniezione con la cera per ossa. Quindi utilizzare la pinza per tirare ciascun lato del cuoio capelluto sopra la cera. Dopo aver chiuso la ferita e somministrato l'analgesia post-operatoria appropriata, ripetere la procedura per ogni animale sperimentale.

Per acquisire immagini della crescita del tumore intracranico, inizializzare innanzitutto la stazione di acquisizione come appena dimostrato. Successivamente, dopo aver verificato il livello adeguato di sedazione mediante pinzatura della coda, impostare i parametri del sistema di acquisizione come appena dimostrato, fatta eccezione per la selezione di "Auto" per il tempo di esposizione.

Quando il sistema di imaging è pronto, posizionare i topi sulla stazione di imaging e selezionare Acquisisci per ottenere le immagini dell'espressione della luciferasi. Una volta completata l'acquisizione dell'immagine, selezionare lo Strumento di area di interesse dalla barra degli strumenti e Auto dall'icona del cerchio. Delimitare le aree del segnale per definire le aree di interesse, quindi ottenere le misurazioni delle aree come unità di fotoni al secondo per steradiante per centimetro quadrato.

Infine, rimuovere i topi dalla camera di imaging e monitorare gli animali con tumore fino al completo recupero. L'analisi in vitro di imaging bioluminescente di cellule GL261 infettate con lentivirus contenente luciferasi mostra un'espressione robusta di luciferasi simile ai livelli di luciferasi espressi da una linea cellulare positiva di controllo di glioblastoma umano U87MG esprimente luciferasi. Come previsto, le cellule GL261 non infettate non mostrano espressione di fondo di luciferasi.

Prima dell'impianto intracranico, non si osserva alcuna differenza nei tassi di crescita in vitro delle linee cellulari GL261 luciferasi e GL261. Come dimostra l'imaging bioluminescente seriale di animali con tumori intracranici, le cellule tumorali esprimenti la luciferasi GL261 mostrano anche un tasso di crescita rapido e costante in vivo, senza differenze significative nei tassi di sopravvivenza tra i gruppi sperimentali portatori di tumore. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere utilizzata per eseguire l'imaging fino a 25 topi all'ora se eseguita correttamente.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica potenzia la capacità dell'imaging bioluminescente di monitorare in modo utile la crescita del tumore GL261 in vivo, favorendo ulteriormente lo studio delle risposte immunoterapiche in modelli murini immunocompetenti.