Name: Bioluminescenza Imaging di un Modello immunocompetenti Animal Glioblastoma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Scopri l'imaging bioluminescente in vivo per monitorare la crescita tumorale intracranica usando cellule GL261 modificate con luciferasi. Questo metodo consente lo studio non invasivo dell'immunoterapia nel glioblastoma.

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Vorremmo ringraziare Rajwant Kaur per l'assistenza tecnica. Vorremmo ringraziare Maxwell Tom per l'assistenza nella preparazione del lentivirus. Questo lavoro è stato supportato dalla cattedra Reza e Georgianna Khatib in chirurgia dei tumori della base cranica presso l'UCSF e dal professore e dalla cattedra Michael J. Marchese presso la Northwestern University.

Tutte le procedure descritte di seguito sono stati esaminati e approvati dal Istituzionale uso di animali e del Comitato di cura presso la Northwestern University e sono stati condotti in condizioni sterili. 1. Modifica delle cellule GL261 con Firefly luciferasi Esprimendo Reporter NOTA: vettori lentivirali basati su HIV-1 esprimono luciferasi di lucciola (Fluc) sotto il controllo del promotore della milza fuoco formando virus (SFFV). Il gene reporter ottico è stato clonato nel vettore plasmide pHRSIN-CSGW-dlNotI. <ol><li> Mantenere 293-T cellule modificata mezzo di Eagle Dulbecco (DMEM) supplementato con 10% di siero fetale bovino (FBS) e cellule GL261 in medium RPMI supplementato con 10% FBS e 1% di penicillina-streptomicina a 37 ° C in atmosfera umidificata contenente 95 % di aria e 5% di anidride carbonica (CO 2). </li><li> Quando la coltura cellulare 293-T raggiunge 80% di confluenza in un pallone T-75, lavare le cellule una volta con phtampone osphate salino (PBS) senza Ca2 + e Mg2 +, incubare le cellule con 3 ml di tripsina (0,05%) a 37 ° C per 5 min, triturare con una pipetta da 5 ml tenendo il pallone leggermente inclinato e raccogliere tutte le celle dal fondo della beuta. Trasferire il 3 ml di sospensione cellulare trypsinized in un tubo da 15 ml e aggiungere 7 ml di terreno RPMI carne (un totale di 10 ml della sospensione cellulare). </li><li> Mescolare la sospensione cellulare bene con una pipetta da 5 ml. Prelevare 100 ml di sospensione cellulare dal tubo e contare il numero di cellule utilizzando emocitometro. Per fare ciò, mescolare 100 ml di sospensione cellulare con 300 ml di soluzione trypan blu e inserire 2 ml della miscela in un emocitometro. Contare il numero di cellule senza colorazione blu da quattro viste separate sotto un microscopio. In media il numero di cellule da ogni punto di vista, dato che questo numero rappresenta 10 4 cellule / ml. </li><li> Nel frattempo, centrifugare la provetta contenente la sospensione cellulare a 300 xg per 7 minuti. Aspirare media e risospendere il pellet di cellule con mezzo fresco RPMI fare una sospensione cellulare GL261 a densità di 1,0 x 10 6 / ml. Seed 2,5 x 10 6 cellule GL261 con 2,5 ml di RPMI supporti in un pallone T-175 con 27,5 ml DMEM (giorno 1). </li><li> Dopo 24 ore, sostituire il supporto con 20 ml di DMEM fresco (giorno 2). </li><li> Per produrre il vettore lentivirale, mescolare 54 microlitri trasfezione reattivo con 2 ml di DMEM privo di siero per 5 min. Aggiungere 3 g di gag-pol, 3 mg di virus della stomatite vescicolare G busta (VSV-G), e 4,5 mg di Fluc (PSIN-Fluc) in DMEM con il reagente di trasfezione, e incubare per 20 minuti a RT. Eliminare la miscela DNA nella boccetta 293-T (T-175) e incubare a 37 ° C in una camera umidificata contenente il 95% di aria e 5% di CO 2 per 48 ore (giorno 2). </li><li> Aggiungere 10 ml di DMEM fresco a 24 ore dopo la trasfezione (volume totale di 293-T terreno di coltura cellulare dovrebbe essere circa 30 ml) (giorno 3). </li><li> Per dividere le celle in un GL26124 pozzetti, lavare le cellule una volta con PBS senza Ca2 + e Mg2 +, incubare le cellule con 5 ml di tripsina (0,05%) a 37 ° C per 5 min, triturare con una pipetta da 5 ml tenendo il pallone leggermente inclinato , raccogliere tutte le cellule dal fondo del pallone, e contare le cellule tramite emocitometro come al punto 1.2. Nel frattempo, centrifugare la provetta a 300 xg per 7 minuti. Aspirare i media e sospendere nuovamente le pellet cellulari con fresco RPMI medio per effettuare una sospensione cellulare GL261 a densità di 2,5 x 10 4 / ml. Seed 2,5 x 10 4 cellule GL261 con 1 ml di media RPMI in una piastra da 24 pozzetti (giorno 3). </li><li> Raccogliere 30 ml del supernatante lentivirale con 10 ml pipetta dal pallone 293-T (T-175) a 48 ore dopo la trasfezione e trasferire il surnatante in tubo da 50 ml. Aspirare il supernatante 30 ml lentivirale tramite una siringa da 50 ml, attraverso un filtro a siringa da 0,22 micron, e il surnatante virale Aliquotare in 1 ml aliquote (giorno 4). </li><li> Sostituire le 1 ml di RMedia PMI in piastra cellule GL261 (24 pozzetti) con 1 ml del supernatante lentivirale e incubare a 37 ° C in una camera umidificata (giorno 4). </li><li> Dopo 48 ore di infezione lentivirale, sostituire il mezzo di 1 ml di fresco RPMI (giorno 6). </li><li> Dopo 24 ore, ripetere l&#39;infezione lentivirale delle cellule GL261 (giorno 7). </li><li> Dopo il 2 ° 48 ore di infezione lentivirale, sostituire il mezzo di 1 ml di fresco RPMI (giorno 9). </li><li> Continua a crescere le cellule GL261 luciferasi modificato (ad essere indicato come cellule GL261.luc) ed espandere la coltura cellulare in un pallone T-75. </li><li> Quando la coltura cellulare GL261.luc raggiunge il 70% di confluenza in un pallone T-75, raccogliere le cellule mediante tripsinizzazione e contare da emocitometro come al punto 1.2. Piatto la cellula GL261.luc in una piastra da 24 pozzetti a densità di laurea (1,0 x 10 6, 5.0 x 10 5, 2.5 x 10 5, 1.0 x 10 5, 5.0 x 10 4, 2.5 x 10 4 cellule / pozzetto) e incubare a 37 ° C in un Humidicamera cato contenente il 95% di aria e 5% di CO 2 per 3 ore. </li><li> Misurare cellulare attività luciferasi rispetto alla luciferasi modificato U-87 MG (U87.luc), le cellule utilizzando bioluminescenza (Figura 1). <ol><li> Avviare il software immagine (clic sull&#39;icona sul desktop) e inizializzare il sistema di imaging (fare clic sul pulsante &quot;inizializzare&quot;). L&#39;inizializzazione inizierà automaticamente e potrebbe richiedere diversi minuti per il sistema di check-up e la macchina fotografica di raffreddare fino a -90 ° C. </li><li> Aggiungere 25 ml di luciferina (sale di potassio D-Luciferin, 150 mg / kg) in tutti i pozzetti. </li><li> Incubare le cellule con luciferina per 1 minuto a temperatura ambiente e immagine la piastra per 10 secondi. Per configurare il sistema di imaging, selezionare &quot;luminescenti&quot;, &quot;10 secondi&quot; il tempo di esposizione, e binning &quot;Medio&quot;. Posizionare la piastra 24 pozzetti sulla stazione di imaging e fare clic sul pulsante &quot;Ripresa&quot; per avviare l&#39;immagine. </li><li> Dopo che l&#39;immagine viene acquisita con successo, si vedrà una finestra di immagine e strumento di palette sullo schermo. Fare clic su &quot;ROI (regioni di interesse) Strumenti&quot; e selezionare 6 x 4 dall&#39;icona fessura. Creare 6 x 4 feritoie per coprire l&#39;area del segnale sul immagine del 24-pozzetti e fare clic sulla scheda misure (icona della matita). Osservare una finestra con una tabella di misurazioni ROI come unità di fotoni al secondo per steradiante per centimetro quadrato (fotoni / sec / sr / cm 2). </li><li> Cellule uso U87.luc, in precedenza modificati con la stessa lentivirus usato qui per GL261 modifica 11, come un controllo per valutare l&#39;attività della luciferasi in cellule GL261.luc trasdotte. </li></ol></li></ol> 2. In Vitro proliferazione Assay <ol><li> Quando le colture cellulari e GL261 GL261.luc raggiungono il 70% di confluenza in un pallone T-75, raccogliere entrambe le linee cellulari mediante tripsinizzazione e contare come al punto 1.2, e cellule piastra in una piastra a 96 pozzetti ad una densità di 1500 cellule 80 ml di terreno RPMI per pozzetto con una pipetta multicanale per minimizzare il tempo e l&#39;errore pipettaggio. Seed ogni linea cellulare in totale 20 pozzi. Per limitare l&#39;evaporazione nei pozzetti popolati da cellule, riempire pozzi vuoti con 100 ml di fresco media RPMI. </li><li> Valutare la proliferazione cellulare utilizzando un test colorimetrico proliferazione cellulare. Qui usiamo il test proliferazione cellulare MTS. Usando una pipetta multicanale, aggiungere 20 ml di reagente di MTS in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti contenente cellule. </li><li> Incubare la piastra a 37 ° C in una camera umidificata contenente il 95% di aria e 5% di CO 2 per 3 ore. Misurare l&#39;assorbanza a 490 nm usando un lettore per micropiastre. Questo viene ripetuto nei giorni 1, 2, 4, e 7, dopo la placcatura. Per normalizzare valori di assorbanza, i valori di ogni giorno sono divisi per i corrispondenti letture ottenute al giorno 1 (Figura 2). </li></ol> 3. Tumore delle cellule impianto Nota: Autoclave tutte le attrezzature. Preparare area chirurgica spruzzando un disinfettante (soluzione di clorexidina al 2%) e coprire con absorbent tende. Al fine di mantenere condizioni di sterilità, indossare guanti chirurgici sterili durante l&#39;intervento chirurgico, e dividere l&#39;area chirurgica in due aree di nastro di colore. Area 1 è etichettato come &quot;Clean&quot; e contiene forniture sterilizzati; Area 2 è etichettato come &quot;sporco&quot; e contiene materiali utilizzati. <ol><li> Prima dell&#39;intervento degli animali, preparare una sospensione di cellule per l&#39;iniezione intracranica. Celle di raccolta da un confluenti 70% T-75 pallone mediante tripsinizzazione e contare le cellule tramite emocitometro come al punto 1.2, e fare una sospensione cellulare con una densità di 1,0 x 10 5 cellule / microlitro in soluzione salina bilanciata Hanks &#39;senza Ca 2+ e Mg 2+ (HBSS). </li><li> Anestetizzare topi con iniezione intraperitoneale di 200 microlitri miscela contenente 100 mg / kg di ketamina e 10 mg / kg di xilazina in soluzione fisiologica 0,9%. Per confermare il corretto anestesia, pizzicare la punta del mouse. Se il mouse è completamente sotto anestesia, il mouse non dovrebbe rispondere allo stimolo. </li><li> Amministrare 0.1 mg / buprenorfina kg per via sottocutanea per alleviare il dolore post-operatorio. </li><li> Radere la parte superiore della testa degli animali utilizzando tagliaunghie e pulito con un applicatore di cotone imbevuto di tip soluzione di clorexidina al 2%. Applicare pomata occhio per mantenere un&#39;adeguata lubrificazione durante l&#39;intervento chirurgico. </li><li> Eseguire un&#39;incisione sagittale lungo circa 1 cm sopra l&#39;osso parieto-occipitale con un bisturi sterile. Per visualizzare il bregma, pulire la superficie del cranio con un applicatore di cotone-tip imbevuto di una soluzione di perossido di idrogeno al 3%. </li><li> Forare il cranio con un ago sterile da 25 G a fare un piccolo foro 3 mm a destra del bregma e appena dietro la sutura coronale. </li><li> Per assicurarsi che il sito di iniezione intracranica è ad una profondità di 3 mm dal cranio, tagliato 3 mm da estremità appuntita di un puntale di 20 microlitri con le forbici e inserire una siringa nella punta della pipetta. </li><li> Inserire la siringa perpendicolarmente al foro creato in precedenza, e iniettare lentamente il sus cellule tumoralipensione contenente 3.0 x 10 5 cellule in 3 ml HBSS, per un periodo di 1 min. Lasciare l&#39;ago in posizione per un altro minuto, e poi estrarre lentamente l&#39;ago. </li><li> Tampone cranio con applicatore cotone imbevuto di punta 3% di perossido di idrogeno e la soluzione di clorexidina 2%. Asciugare la superficie del cranio con l&#39;applicatore di cotone-punta. Tagliare la cera ossea sterile circa 3 mm 3 dimensioni e fissare la cera ossea sul lato dell&#39;estremità dell&#39;applicatore cotone punta. Applicare la cera osso per coprire il buco con l&#39;applicatore di cotone-punta. </li><li> Disegnare il ciascun lato del cuoio capelluto insieme sul cranio con pinze, e fiocco per chiudere la ferita. Pulire la ferita con un batuffolo di cotone imbevuto di punta soluzione di clorexidina al 2%. </li><li> Monitorare tutti i mouse dopo l&#39;intervento fino a quando diventano ambulatoriale e mantenere la normale attività. Tipicamente, il tempo di recupero è di circa 30 min. Non restituire i topi in gabbia con altri animali fino a quando non hanno pienamente recuperato da anestesia. </li></ol><ol><li> Spruzzare una generosa quantità di disinfettante (soluzione di dimetil cloruro di ammonio 0,05%) su un tovagliolo di carta pulito. Utilizzare il tovagliolo di carta imbevuto di disinfettante-per pulire a fondo il foglio nero, coni naso e divisorio all&#39;interno della camera di imaging dove gli animali saranno in contatto con il dispositivo. Pulire accuratamente tutte le superfici con un fazzoletto di carta pulito e asciutto. Ripetere questo ancora una volta e attendere 5 minuti. </li><li> Inizializzare la stazione di imaging come al punto 1.14.1. </li><li> Anestetizzare il mouse con una miscela di 300 ml contenente 200 ml di ketamina / xilazina e 100 ml di luciferina (sale di potassio D-Luciferin, 150 mg / kg) mediante iniezione intraperitoneale. </li><li> Attendere 10 minuti dopo l&#39;iniezione e confermare se i topi sono completamente sotto anestesia da pizzicare la coda. Per configurare il sistema di imaging, selezionare &quot;luminescenti&quot;, tempo di esposizione &quot;Auto&quot;, e binning &quot;Medio&quot;. Mettere i topi sulla ferr immaginisu e fare clic sul pulsante &quot;Ripresa&quot; per avviare l&#39;immagine. Verificare che il tempo dopo l&#39;iniezione è coerente con ogni sessione di imaging. </li><li> Dopo che l&#39;immagine viene acquisita con successo, dovrebbe apparire una finestra di immagine e tavolozza degli strumenti. Fare clic su &quot;Strumenti ROI&quot; e selezionare &quot;auto&quot; dall&#39;icona cerchio. Per definire ROI, circondare la zona del segnale dell&#39;immagine, e poi prendere le misure del ROI come unità di fotoni / sec / sr / cm 2. </li><li> Prendere i topi dalla camera di imaging e monitorare i topi fino a diventare ambulatoriale e mantenere l&#39;attività normale. In genere il tempo di recupero è di circa 15 min. Non restituire i topi in gabbia con altri animali fino a quando non hanno pienamente recuperato da anestesia. </li><li> Monitorare la crescita tumorale di imaging bioluminescenza due volte a settimana fino a quando gli animali presentano i seguenti sintomi: perdita di peso (perdita di oltre il 20% rispetto al peso prima dell&#39;impianto), inappetenza (anoressia completa per 24 ore), e la mancanza di purposefu sostenutarisposta a stimoli l dolce (debole tentativo di alzarsi), momento in cui devono essere eutanasia. Euthanize animali con questi sintomi utilizzando una camera di CO 2 seguita da dislocazione cervicale. <ol><li> Topi posto nella camera di eutanasia (fare non sovraffollate della camera) e afflusso compressi di CO 2 per 5-6 min. Osservare che tutti gli animali sono incoscienza e non respira dopo circa 5 min. </li><li> Prendere i topi dalla camera. Assicurarsi che il cuore non batte per sentire il petto tra il pollice e l&#39;indice e controllare che non vi è alcun riflesso corneale. </li><li> Trattenere il mouse in posizione prona su una superficie piana e afferrare la parte posteriore del collo alla base del cranio, con una mano e base della coda con il pollice e l&#39;indice dell&#39;altra mano. </li><li> Trattenere la testa e tirare rapidamente la coda all&#39;indietro. Assicurarsi che il cranio è separato dalla prima vertebra cervicale con il pollice e l&#39;indice. </li></ol></li><li> Normaalize valori di luminescenza per ogni giorno contro letture corrispondenti ottenuti al primo giorno dell&#39;imaging bioluminescenza come al punto 2.3 (Figura 3A). </li><li> Per l&#39;analisi statistica, generare curve di sopravvivenza utilizzando lo stimatore di Kaplan-Meier 12 e confrontare le differenze tra le curve di sopravvivenza con un log-rank test 13. </li></ol>

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</ol>

Non ci sono conflitti di interesse da divulgare.

GL261 cellule di glioma murino, quando impiantato intracranially in immunocompetenti singenico C57BL / 6 topi, offrono diversi vantaggi rispetto ai modelli di xenotrapianto animali glioma umano. Molti dei tumori xenotrapiantati crescere come lesioni incapsulati che non ricapitolano accuratamente la malattia umana invasiva. Al contrario, GL261 tumore dimostra non solo l&#39;invasione nel cervello adiacente, ma anche neovascolarizzazione, figure mitotiche, e profonda la necrosi 7. Soprattutto quando si studia immunologia tumore o strategie di immunoterapia 15, 16, il topo C57BL / 6 mantiene un sistema immunitario intatto 8. Studi precedenti hanno dimostrato robusto espressione della citochina immunosoppressiva TGF-β e tumori intracranici contenere immunosoppressori cellule T regolatori simili a glioblastoma umano 9, 10. La semplice tecnica qui descritta permette di espressione stabile della luciferasi da parte delle cellule GL261. Abbiamo recentemente riportato similar in vitro e in vivo la crescita delle cellule GL261.luc rispetto alle cellule GL261, oltre alle analoghe caratteristiche istologiche del tumore e cellule immunitarie infiltrarsi 17. GL261.luc cellule stabilmente esprimono luciferasi che catalizza l&#39;ossidazione del substrato luciferina conversione dell&#39;energia chimica per fotoni e quindi luce rilevabile. Luciferina può essere somministrato senza rischi negli animali e attraversa la barriera emato-encefalica dopo l&#39;iniezione intraperitoneale o endovenosa. In piccoli animali ricerca come topi, la bioluminescenza può essere rilevata esternamente in modo non invasivo 11. Pertanto, la crescita del tumore può essere valutata in serie senza la necessità di sacrifici animali o costose RM o TC. Le fasi critiche nel protocollo riguardano non solo la trasduzione lentivirale, ma anche la verifica di espressione stabile di luciferasi in vitro prima di iniziare qualsiasi esperimenti in vivo. La perdita di trasduzione può require infezione lentivirus ripetizione. Introduzione di un gene di resistenza agli antibiotici nel vettore di espressione può essere usato anche per selezionare per l&#39;espressione della luciferasi. È necessaria tecnica meticolosa per l&#39;impianto intracranico di inserire riproducibile un consistente numero di cellule in una posizione anatomica precisa per permettere il confronto di diversi gruppi di trattamento. Una differenza principale tra questo studio e studi precedenti luciferasi cellule esprimenti GL261 è l&#39;uso di una tecnica per la mano libera impiantare cellule rispetto all&#39;uso di un telaio stereotassico 18. Abbiamo precedentemente dimostrato risultati impianto coerenti con la tecnica a mano libera 19. Il vantaggio della tecnica libera mano è la capacità di eseguire analisi ad alto rendimento di diversi agenti di trattamento. Nelle nostre mani, siamo in grado di impiantare circa 60 animali in 1 ora. Dopo aver imparato la tecnica, le future applicazioni della tecnica sono illimitate. Come GL261 demonstrates elevati mitosi e la rapida crescita del tumore simile a glioblastoma umano, trattamenti anti-proliferativi possono essere valutati. Analogamente, terapie anti-invasive e antiangiogenici possono essere utilizzati come i tumori GL261 sono invasive e angiogenico. Deve essere usata cautela nel valutare l&#39;effetto di agenti chemioterapici volte a bersagli umani. Rispetto ai precedenti studi che utilizzano xenotrapianti glioblastoma umano esprimono luciferasi 20, questo sarebbe considerato una limitazione del nostro modello. Inoltre, l&#39;effetto di strategie di immunoterapia di crescita del tumore può essere studiato nel modello xenotrapiantati GL261.

Il glioma maligno è il tumore cerebrale umano più comune e più letale. Anche se trattato con resezione chirurgica massimale, radioterapia e chemioterapia, la sopravvivenza mediana rimane di 15-20 mesi nei principali centri di riferimento per i tumori cerebrali1, 2, 3. La forma più aggressiva di glioma maligno, il glioblastoma, è caratterizzata da figure mitotiche, neovascolarizzazione, invasione nel cervello adiacente e necrosi pseudopalizzata. Gli xenotrapianti di tumore cerebrale ortotopico che utilizzano cellule tumorali cerebrali umane hanno svolto una funzione essenziale nella ricerca neuro-oncologica e hanno facilitato la traduzione preclinica per la sperimentazione di nuovi agenti, prima dell'ingresso negli studi clinici sull'uomo. Mentre la maggior parte dei modelli di xenotrapianto umano ricapitola molte caratteristiche della malattia umana, una limitazione fondamentale di tutti i sistemi modello di xenotrapianto basati sull'uomo è l'uso di animali immunodeficienti4. 
L'assenza di una risposta dell'ospite intatta modifica chiaramente la crescita del tumore sia in termini di morfologia tumorale, sia di efficienza dell'attecchimento. Sebbene alcune ipotesi siano accettabili nell'interpretazione dei risultati dei modelli xenotrapiantati, il raggiungimento di conclusioni pertinenti nell'area della valutazione terapeutica è una sfida. Alcune caratteristiche biologiche fondamentali sono probabilmente simili negli animali immunodeficienti e immunocompetenti, ma altre come l'infiammazione associata al tumore, l'invasione dei tessuti, la risposta alle lesioni sono probabilmente molto diverse. Al contrario, GL261 è una linea cellulare di glioma murino indotto chimicamente che ricapitola accuratamente il glioma quando impiantata nel cervello di topi singenici immunocompetenti C57BL/65. Simile alla malattia umana, la crescita intracranica del tumore porta rapidamente e in modo riproducibile a sintomi neurologici e alla morte degli animali6-10. 
La crescita tumorale sottocutanea può essere misurata direttamente. La crescita intracranica del tumore può essere misurata solo con il sacrificio animale o con costosi studi di imaging. L'espressione stabile dell'enzima luciferasi consente l'imaging a bioluminescenza intracranica non invasivo ed economico11. La bioluminescenza delle cellule GL261 trasfettate con luciferasi si correla bene con la crescita del tumore intracranico. Recentemente abbiamo confrontato direttamente GL261 con cellule GL261 modificate con luciferasi e non abbiamo dimostrato alcuna differenza nella crescita e nell'invasione in vitro, nel profilo immunologico delle citochine, nella sopravvivenza in vivo di topi portatori di tumore intracranico C57BL/6 o nell'infiltrato di cellule immunitarie. Questa tecnica è applicabile agli studi preclinici sul glioblastoma che prevedono il monitoraggio non invasivo della crescita tumorale.

<table><tbody><tr><td>D-luciferina, sale di potassio</td><td>Oro Biotecnologia</td><td>LUCK-100</td><td>Conservare lontano dalla luce</td></tr><tr><td>Living Image Software</td><td>Calibro Life Sciences</td><td>Contattare per Preventivo</td><td>nessuno</td></tr><tr><td>Xenogen Lumina</td><td>Caliper Life Sciences</td><td>Contattare per Preventivo</td><td>nessuno</td></tr><tr><td>24-well; Coltura tissutale standard; </td><td>Falcon</td><td>a</td> fondo piatto 353047 <td></td></tr><tr><td>CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay&nbsp;</td><td>Promega</td><td>G3582</td><td>nessuno</td></tr><tr><td>Synergy 2 Lettore multimodale</td><td>BioTek</td><td>Contatto per preventivo</td><td>nessuno</td></tr><tr><td>96 pozzetti Piastra di analisi, piastra nera, fondo trasparente con coperchio, coltura tissutale Tretaed</td><td>Coster</td><td>3603</td><td>nessuno</td></tr><tr><td>Ketaset</td><td>Pfizer</td><td>NDC 0856-2013-01</td><td>Sostanza di controllo</td></tr><tr><td>xilazina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>23076-35-9</td><td>nessuno</td></tr><tr><td>28G Ago (con siringa)&nbsp;</td><td>Pescatore &nbsp;</td><td>22-004-270</td><td>AKA Siringa da insulina</td></tr><tr><td>2% clorexidina</td><td>Fisher</td><td>NC9756995</td><td>AKA " Nolvasan"</td></tr><tr><td>Perossido di idrogeno al 3%</td><td>Fisher</td><td>H312P-4</td><td>Conservare lontano dalla luce</td></tr><tr><td>Unguento oftalmico</td><td>Cardinal Health</td><td>1272830</td><td>AKA " Akwa Tears"</td></tr><tr><td>25G 1 1/2 ago</td><td>BD Becton Dickinson</td><td>305127</td><td>nessuno</td></tr><tr><td>Bisturi monouso</td><td>Piuma</td><td>2975</td><td>N. 21</td></tr><tr><td>Garza</td><td>Fisher</td><td>22028563</td><td>Autoclave prima dell'uso</td></tr><tr><td>Termoforo</td><td>Dunlap</td><td>HP950</td><td>nessuno</td></tr><tr><td>Cucitrice per pelle, graffette, dispositivo di rimozione</td><td>Stoelting</td><td>59020</td><td>nessuno</td></tr><tr><td>PDI Alchol Prep Pads</td><td>Fisher</td><td>23-501-711</td><td>nessuno</td></tr><tr><td>Clip per ferite Reflex da 7 mm Confezione da 100</td><td>Brain Tree Scientific, INC</td><td>203 Autoclave 1000</td><td>prima dell'uso</td></tr><tr><td>Reflex 7 mm Wound Clip Applier</td><td>Brain Tree Scientific, INC</td><td>204 Autoclave 1000</td><td>prima dell'uso</td></tr><tr><td>Reflex 7 mm Wound Clip Remover</td><td>Brain Tree Scientific, INC</td><td>205 1000</td><td>none</td></tr><tr><td>Tampone con punta rotonda a terminazione singola con manico in legno</td><td>Qosmedix</td><td>10107</td><td>Autoclave prima dell'uso</td></tr><tr><td>Soluzione salina bilanciata di Hanks senza Ca2+ e Mg2+ (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14170-112</td><td>nessuno</td></tr><tr><td>Siringa</td><td>Hamilton Hamilton</td><td>80300</td><td>nessuno</td></tr><tr><td>Reagente di trasfezione FuGENE 6</td><td>Promega</td><td>E2961</td><td>nessuno</td></tr><tr><td>Cera d'osso</td><td>Apparato</td><td>di Harvard 599864</td><td>nessuno</td></tr></tbody></table>

bioluminescenza imaging di un modello immunocompetenti animal glioblastoma

Bioluminescence Imaging of an Immunocompetent Animal Model for Glioblastoma

A differenza dei modelli animali di xenotrapianto di glioma umano comunemente riportati, gli xenotrapianti di glioma murino GL261 ricapitolano quasi tutte le caratteristiche cliniche e istopatologiche rilevanti della malattia umana. Quando le cellule GL261 vengono impiantate per via intracranica in topi singenici C57BL/6, il modello ha l'ulteriore vantaggio di mantenere intatto un microambiente immunitario. L'espressione stabile della luciferasi nelle cellule GL261 consente un monitoraggio non invasivo ed economico della bioluminescenza della crescita tumorale intracranica. Abbiamo recentemente dimostrato che l'espressione della luciferasi nelle cellule GL261 non influenza le proprietà di crescita del tumore, l'espressione immunomodulatoria delle citochine delle cellule tumorali, l'infiltrazione di cellule immunitarie nel tumore o la sopravvivenza globale degli animali portatori del tumore intracranico. Pertanto, sembra che il modello di glioma della luciferasi GL261 possa essere utile nello studio di nuove modalità chemioterapiche e immunoterapeutiche. Qui riportiamo la tecnica per generare un'espressione stabile della luciferasi nelle cellule GL261 e come studiare la crescita in vitro e in vivo delle cellule tumorali mediante imaging a bioluminescenza.

GL261 cellule sono state infettate con luciferasi contenente lentivirus come descritto sopra nei passaggi 1. In vitro l&#39;imaging bioluminescenza dimostra espressione luciferasi robusto simile a livelli nel controllo positivo U87.luc linea cellulare di glioblastoma umano (Figura 1). Come previsto, le cellule non infette GL261 mostrano alcuna espressione sfondo luciferasi. Questo passaggio è semplice ma fondamentale da eseguire prima di ulteriori studi che utilizzano la linea di cellula infettata per confermare espressione stabile luciferasi. Espressione luciferasi dopo l&#39;impianto intracranico. Prima dell&#39;impianto intracranica, abbiamo dimostrato alcuna differenza nel tasso di crescita in vitro di GL261.luc rispetto alle cellule GL261 (Figura 2). Per la crescita intracranica e analisi di sopravvivenza, cellule sono state iniettate nella brains di topi C57BL / 6 come da protocollo punto 3. La crescita del tumore in topi portatori di tumori GL261.luc è stato analizzato in serie per l&#39;imaging bioluminescenza utilizzando il protocollo punto 4 e hanno dimostrato la crescita tumorale rilevabile (Figura 3A). I topi che portano rapidamente e in modo coerente tumori GL261.luc diventato moribondo e sono stati sottoposti a eutanasia. È importante sottolineare che non vi è alcuna differenza nella sopravvivenza globale tra GL261.luc e tumore GL261 cuscinetto animali (Figura 3B). In vivo bioluminescenza può quindi essere utilizzato per monitorare la risposta ai trattamenti sperimentali glioblastoma. La rapida crescita del tumore e la sopravvivenza globale affidabile breve può produrre grandi quantità di dati in un tempo relativamente breve lasso di tempo. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53287/53287fig1.jpg" /> Figura 1. Attività luciferasi in cellule GL261.luc. U87.luc, le cellule GL261.luc e GL261 (controllo negativo) sono stati placcati in densità di1,0 x 10 6, 5.0 x 10 5, 2.5 x 10 5, 1.0 x 10 5, 5.0 x 10 4, e 2,5 x 10 4 cellule / pozzetto da sinistra a destra. Luminescence (fotoni / sec / sr / cm 2) è stata misurata con la stazione di imaging lumina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53287/53287fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53287/53287fig2.jpg" /> Figura 2. espressione luciferasi non influenza la proliferazione delle cellule GL261. GL261.luc cellule non provocano un differenza nella proliferazione come dimostrano MTS saggio di proliferazione cellulare. Il grafico mostra volte superiore, rispetto al giorno 1, come determinato dal confronto tra il valore medio di assorbanza (media ± SEM) al punto di tempo thespecified per il valore medio al giorno 1 (spaiati t valori -test per i confrontitra ogni linea cellulare: P = 0,7796) 14. Barre di errore rappresentano i valori medi (media ± SEM) da campioni quadruplicato in ogni giorno. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53287/53287fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53287/53287fig3.jpg" /> Figura 3. espressione luciferasi dose non influisce su in vivo la crescita del tumore e la sopravvivenza degli animali. (A) Monitoraggio bioluminescenza dimostra progressiva crescita del tumore intracranico GL261.luc in topi C57BL / 6. (B) analisi di sopravvivenza di Kaplan-Meier dimostra alcuna differenza nella sopravvivenza globale per i topi impiantati intracranially sia con GL261 (linea continua) o GL261.luc cellule (linea tratteggiata).Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

GL261 le cellule di glioma forniscono un utile modello animale immunocompetente di glioblastoma. Gli obiettivi di questo protocollo sono dimostrare tecniche adeguate per il monitoraggio della crescita tumorale intracranica utilizzando l'imaging in bioluminescenza in vivo e verificare l'utilità delle cellule GL261 modificate con luciferasi per lo studio dell'immunologia tumorale e degli approcci immunoterapeutici per il trattamento del glioblastoma.

Bioluminescenza Imaging di un Modello immunocompetenti Animal Glioblastoma

In contrast to commonly reported human glioma xenograft animal models, GL261 murine glioma xenografts recapitulate nearly all relevant clinical and ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è dimostrare le tecniche corrette per monitorare la crescita delle cellule tumorali e dei tumori intracranici mediante imaging bioluminescente in vivo, al fine di verificare l'utilità della modifica con luciferasi delle cellule tumorali murine GL261. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nello studio dell'immunologia tumorale e degli approcci immunoterapici, ad esempio se la modifica genetica influisce sulla proliferazione delle cellule GL261 e sulla loro crescita in vivo.Il principale vantaggio di questa tecnica è che la modifica delle cellule tumorali GL261 con luciferasi facilita il monitoraggio non invasivo della loro crescita e della risposta al trattamento in situ. Quando la coltura cellulare GL261 espressiva di luciferasi raggiunge una confluenza del 70% in una fiasca T75, raccogliere le cellule mediante tripsinizzazione. Contare le cellule e quindi trasferirle in una piastra a 24 pozzetti a densità graduate.Dopo tre ore in un incubatore per colture cellulari, aprire il software di imaging bioluminescente e inizializzare il sistema di imaging. Quando la telecamera avrà raggiunto la temperatura di meno 90 gradi Celsius, impostare il software di imaging su Luminescenza con un tempo di esposizione di 10 secondi e un Binning Medio. Incubare quindi le cellule in 25 microlitri di luciferina per pozzetto per un minuto a temperatura ambiente e posizionare la piastra sulla stazione di imaging.Selezionare Acquisisci per iniziare l'acquisizione delle immagini. Quando un'immagine è stata ottenuta con successo, verranno visualizzate una finestra dell'immagine e una tavolozza degli strumenti. Fare clic su Strumenti per le Regioni di Interesse e selezionare 6 per 4 dall'icona della fessura.Coprire l'area del segnale con 6 per 4 fessure e selezionare l'icona matita nella scheda Misure. Apparirà una finestra con una tabella delle misurazioni della regione di interesse in unità di fotoni al secondo per steradiante per centimetro quadrato. Per eseguire un saggio di proliferazione in vitro, raccogliere le colture cellulari come appena dimostrato quando raggiungono una confluenza del 70%.E utilizzare una pipetta multicanale per posizionare le cellule tumorali in 20 pozzetti ciascuno di una piastra a 96 pozzetti, a 1,5 × 10³ cellule per 80 microlitri di mezzo RPMI per pozzetto. Per limitare l'evaporazione delle colture cellulari, riempire i pozzetti vuoti circostanti con 100 microlitri di mezzo RPMI fresco. Successivamente, per valutare la proliferazione cellulare, aggiungere 20 microlitri di reagente MTS in ciascun pozzetto contenente cellule.E incubare la piastra a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Dopo tre ore, utilizzare un lettore di micropiastre per misurare l'assorbanza a 490 nanometri. Per normalizzare i valori di assorbanza, dividere i valori di ogni giorno per le letture corrispondenti ottenute al primo giorno.Il giorno dell'impianto, sospendere 1 × 10⁵ cellule per microlitro in HBSS senza calcio e magnesio provenienti da una coltura cellulare tumorale al 70% di confluenza. Successivamente, dopo aver verificato il corretto livello di sedazione mediante pizzicamento del dito del piede, rasare la parte superiore della testa di ciascun animale sperimentale. Utilizzando un applicatore con punta di cotone, pulire ogni cranio con clorhexidina al 2%.Quindi applicare un lubrificante sugli occhi di ogni topo. Ora utilizzare un bisturi sterile per effettuare un'incisione sagittale di circa 1 centimetro sopra l'osso parietale-occipitale del primo animale. Pulire nuovamente la superficie del cranio con perossido di idrogeno al 3%, notando il bregma apparente.Quindi, utilizzando un ago sterile da 25 gauge, praticare un foro di 3 millimetri nel cranio a destra del bregma e appena dietro la sutura coronale. Per garantire la corretta profondità di iniezione, usare delle forbici per tagliare 3 millimetri dall'estremità appuntita di una punta da pipetta da 20 microlitri e inserire una siringa Hamilton da 26 gauge nella punta fino a far sporgere 3 millimetri dell'ago dall'estremità della punta. Inserire l'ago nel foro nel cranio e iniettare lentamente 3 microlitri di 3 volte 10 alla 5a delle cellule tumorali nell'arco di un minuto.Lasciare l'ago in posizione per un altro minuto, quindi ritirarlo lentamente. Scambiare l'osso esposto con una soluzione di perossido di idrogeno al 3% e clorhexidina al 2%. Dopodiché, dopo aver asciugato il cranio con un nuovo applicatore di cotone, ritagliare un pezzo di cera ossea sterile di 3 millimetri quadrati e fissare la cera all'estremità scoperta di un applicatore di cotone.Coprire il sito di iniezione con la cera per ossa. Quindi utilizzare la pinza per tirare ciascun lato del cuoio capelluto sopra la cera. Dopo aver chiuso la ferita e somministrato l'analgesia post-operatoria appropriata, ripetere la procedura per ogni animale sperimentale.Per acquisire immagini della crescita del tumore intracranico, inizializzare innanzitutto la stazione di acquisizione come appena dimostrato. Successivamente, dopo aver verificato il livello adeguato di sedazione mediante pinzatura della coda, impostare i parametri del sistema di acquisizione come appena dimostrato, fatta eccezione per la selezione di "Auto" per il tempo di esposizione.Quando il sistema di imaging è pronto, posizionare i topi sulla stazione di imaging e selezionare Acquisisci per ottenere le immagini dell'espressione della luciferasi. Una volta completata l'acquisizione dell'immagine, selezionare lo Strumento di area di interesse dalla barra degli strumenti e Auto dall'icona del cerchio. Delimitare le aree del segnale per definire le aree di interesse, quindi ottenere le misurazioni delle aree come unità di fotoni al secondo per steradiante per centimetro quadrato.Infine, rimuovere i topi dalla camera di imaging e monitorare gli animali con tumore fino al completo recupero. L'analisi in vitro di imaging bioluminescente di cellule GL261 infettate con lentivirus contenente luciferasi mostra un'espressione robusta di luciferasi simile ai livelli di luciferasi espressi da una linea cellulare positiva di controllo di glioblastoma umano U87MG esprimente luciferasi. Come previsto, le cellule GL261 non infettate non mostrano espressione di fondo di luciferasi.Prima dell'impianto intracranico, non si osserva alcuna differenza nei tassi di crescita in vitro delle linee cellulari GL261 luciferasi e GL261. Come dimostra l'imaging bioluminescente seriale di animali con tumori intracranici, le cellule tumorali esprimenti la luciferasi GL261 mostrano anche un tasso di crescita rapido e costante in vivo, senza differenze significative nei tassi di sopravvivenza tra i gruppi sperimentali portatori di tumore. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere utilizzata per eseguire l'imaging fino a 25 topi all'ora se eseguita correttamente.Dopo il suo sviluppo, questa tecnica potenzia la capacità dell'imaging bioluminescente di monitorare in modo utile la crescita del tumore GL261 in vivo, favorendo ulteriormente lo studio delle risposte immunoterapiche in modelli murini immunocompetenti.

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