Un modello cellule endoteliali Planar for Imaging immunologiche Synapse Dynamics

L'obiettivo generale di questa tecnica è quello di utilizzare le cellule endoteliali come un nuovo tipo di modello cellulare planare presentante antigene per studiare i processi fondamentali di segnalazione antigenica. Questo metodo può aiutarci ad affrontare questioni chiave nel campo dell'immunità adattativa, come ad esempio il modo in cui le dinamiche di rimodellamento subcellulare e molecolare sono coordinate spazialmente e temporalmente all'interno della sinapsi immunologica. Il vantaggio principale di questa tecnica è che l'endotelio forma una superficie PC praticamente planare.

Ciò consente l'imaging con una risoluzione spazio-temporale ottimale nel contesto di una superficie cellulare fisiologicamente complessa e formabile. Sebbene questo metodo si concentri sull'attivazione delle cellule di memoria CD, quattro TH positivi, può essere applicato anche per lo studio di una varietà di tipi di cellule T, antigene e processi di segnalazione. Oggi, Chris ed io vi mostreremo come eseguire il secondo Begin codificando il transetto di cellule endoteliali microvascolari primarie umane o dermiche con YFP di membrana e rosso DS solubile tramite affezione nucleare NU e di piastrella le cellule trasfettate su piastre di coltura per l'imaging di cellule vive.

Il giorno successivo sostituire il terreno di coltura cellulare con terreno fresco integrato con interferone gamma per indurre l'espressione di M MHC 2 sulle cellule endoteliali, seguita dalla stimolazione delle cellule con 20 nanogrammi per millilitro di TNF alfa 24 ore dopo, il terzo giorno, da 30 a 60 minuti. Prima di iniziare l'esperimento, incubare l'endotelio con un microgrammo per millilitro, ciascuno dei superantigeni batterici stafilococco enterotossina B e tossina della sindrome da shock tossico uno a 37 gradi Celsius. Durante l'incubazione, contare il numero di cellule vitali dalla coltura linfocitaria di interesse e trasferire due volte da 10 a un sesto delle cellule in una provetta conica da 15 millilitri.

Quindi, far girare le celle e risospendere il pellet in due millilitri di tampone A appena preparato in modo tale che non rimangano grappoli di cellule. Quindi aggiungere due micromolari RA due al campione di cellule T, tappare la provetta e capovolgerla immediatamente in modo omogeneo. Distribuire il colorante su tutta la sospensione cellulare.

Dopo un'incubazione di 30 minuti a 37 gradi Celsius, centrifugare i linfociti marcati e risospendere delicatamente ma accuratamente le cellule in 20-40 microlitri di tampone A fresco per ottenere un'immagine dal vivo, le cellule accendono il sistema di microscopio e aprono il software di acquisizione delle immagini appropriato. Impostare i parametri appropriati per l'imaging time-lapse multicanale automatizzato, nonché l'intervallo per l'acquisizione da 10 a 30 secondi e una durata totale di circa 20-60 minuti. Quindi, aggiungi olio fresco all'obiettivo.

Montare una capsula del microscopio contenente 0,5 millilitri di tampone A sull'adattatore del tavolino di riscaldamento e accendere immediatamente l'adattatore precedentemente impostato a 37 gradi Celsius. Dopo due o tre minuti di equilibrio, utilizzare una pipetta da 20 microlitri per aggiungere i due linfociti caricati dell'AR a riposo nella camera del microscopio montata e attivare l'imaging in campo chiaro. Selezionare il percorso della luce verso gli oculari e utilizzare la manopola di messa a fuoco della rotta per portare l'obiettivo a contatto con il fondo del piatto del microscopio.

Quindi utilizzare l'oculare e la manopola di messa a fuoco fine per individuare le cellule T depositate sul fondo della parabola e utilizzare i controlli dello stadio XY per selezionare un campo contenente almeno 10 celle quando sono state individuate le celle appropriate. Passa dal campo chiaro alla sorgente luminosa fluorescente e dall'imaging IP alla telecamera CCD. Ottimizza i parametri di acquisizione e poi acquisisci le immagini a riposo Fira 2 3 40 e FIRA 2 3 80.

Uno dei passaggi chiave per generare risultati di successo è un'attenta ottimizzazione dei parametri di acquisizione della fluorescenza, assicurando che venga raccolto un segnale sufficiente e, nel caso di fira due, che il rapporto di base 3 43 80 sia vicino a uno. Quando sono stati impostati i due tempi di esposizione FIRA, sostituire la capsula di cellule T con una capsula da microscopio di cellule endoteliali utilizzando una pipetta di trasferimento monouso, rimuovere rapidamente il terreno e sciacquare le cellule una volta con un millilitro di tampone di preriscaldamento A, quindi sostituire il lavaggio con 0,5 millilitri di tampone fresco A.Utilizzando l'obiettivo, identificare i campi in cui le cellule endoteliali fluorescenti appaiono sane. Quindi regolare i parametri di acquisizione per la membrana YFP e DS RED come appena dimostrato per fira due.

Facendo attenzione che l'intensità media del segnale fluorescente in ciascun canale sia compresa tra il 25 e il 75% della gamma dinamica del rivelatore. Prima di condurre l'esperimento di imaging su cellule vive, acquisire diversi intervalli di immagini delle sole cellule endoteliali per stabilire una linea di base con il software automatizzato. Quindi inserendo la punta di un piccolo volume nel supporto vicino al centro dell'obiettivo.

Erogare lentamente cinque microlitri di fira concentrata, due linfociti caricati al centro del campo di imaging del piatto del microscopio. Man mano che i linfociti si depositano, apportare regolazioni fini alla messa a fuoco per garantire che le interfacce delle cellule endoteliali delle cellule T siano mantenute sul piano focale. Con gli obiettivi 40 e 63 x, da 10 a 20 celle per campo è ottimale.

Dopo l'intervallo di osservazione desiderato, continuare l'imaging e pipettare immediatamente CIN direttamente nel piatto del microscopio fino a una concentrazione finale di due micromolari per indurre una sfera di flusso di calcio massima. Due segnali. Quando si applicano i trattamenti alle cellule, fare attenzione a mantenere una forte attenzione sulla superficie dell'endotelio marcata YFP della membrana apicale per garantire una risoluzione ottimale del rimodellamento delle sinapsi immunitarie.

In assenza di superantigene sul CD specifico del superantigene endoteliale, quattro linfociti TH positivi si diffondono rapidamente, si polarizzano e migrano lateralmente sulle cellule endoteliali. Durante questo processo, i linfociti estendono sporgenze di breve durata o ILP nella superficie endoteliale, che sono evidenti come anelli di fluorescenza YFP di membrana analoghi alle impronte in presenza di superantigene, i contatti stretti cellula-cellula guidati dalle ILP sono associati all'inizio di un flusso di calcio che porta ad un accumulo di ILP stabilizzate all'interno della sinapsi immunologica. Tali array di ILP sono accoppiati a una segnalazione sostenuta del calcio.

Gli anelli di fluorescenza di membrana che si formano durante le interazioni tra cellule T e cellule endoteliali corrispondono alle sporgenze delle cellule T che guidano punti di invaginazione discreti nelle cellule endoteliali, come confermato dalla dimostrazione che questi anelli sono correlati spazialmente e cineticamente con le zone di citoplasma spostato ed escluso. Entro pochi minuti dalla co-incubazione delle cellule endoteliali e delle cellule T, in presenza di adesione e segnalazione del superantigene, le molecole associate alla segnalazione antigenica vengono arricchite all'interno delle impronte pota e delle ILP della sinapsi immunologica. Infatti, la sinapsi immunologica endoteliale delle cellule T mostra un'architettura tridimensionale discreta punteggiata da ILP delle cellule T che si estendono nella superficie cellulare presentante l'antigene all'interno della quale è arricchito il meccanismo molecolare di riconoscimento dell'antigene.

Con questo approccio, è possibile superare gli ostacoli chiave all'interno dei modelli PC esistenti, consentendo l'osservazione di un'architettura subcellulare 3D altrimenti non rilevabile e il rapido rimodellamento delle interfacce fisiologiche delle cellule T e dei PC. Ciò offre il potenziale per nuovi livelli di comprensione dei processi di segnalazione antigenica.