Name: Un modello cellule endoteliali Planar for Imaging immunologiche Synapse Dynamics (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Scopri un modello cellulare planare con cellule endoteliali per studiare la dinamica delle sinapsi immunologiche e l'attivazione dei linfociti T. Questa tecnica consente imaging ad alta risoluzione dei processi di segnalazione antigenica.

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Ringraziamo il Dr. Peter T. Sage per la sua assistenza nella generazione di alcune delle immagini rappresentative. Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione NIH R01 al C.V.C. (HL104006).

<ol><li>von Andrian, U. H., Mackay, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+function+and+migration.+Two+sides+of+the+same+coin%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">T-cell function and migration. Two sides of the same coin.</a> N. Engl. J. Med. 343 (14), 1020-1034 (2000).</li>
<li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+receptors+of+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Adhesion receptors of the immune system.</a> Nature. 346 (6283), 425-434 (1990).</li>
<li>Shaw, A. S., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+the+T+cell+receptor+go+the+distance%3A+a+topological+view+of+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Making the T cell receptor go the distance: a topological view of T cell activation.</a> Immunity. 6 (4), 361-369 (1997).</li>
<li>Monks, C. R., Freiberg, B. A., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+segregation+of+supramolecular+activation+clusters+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells.</a> Nature. 395 (6697), 82-86 (1998).</li>
<li>Delon, J., Stoll, S., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+T-cell+interactions+with+antigen+presenting+cells+in+culture+and+in+intact+lymphoid+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Imaging of T-cell interactions with antigen presenting cells in culture and in intact lymphoid tissue.</a> Immunol Rev. 189, 51-63 (2002).</li>
<li>Brossard, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifocal+structure+of+the+T+cell+-+dendritic+cell+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Multifocal structure of the T cell - dendritic cell synapse.</a> Eur J Immunol. 35 (6), 1741-1753 (2005).</li>
<li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+context+of+T+cell+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The cellular context of T cell signaling.</a> Immunity. 30 (4), 482-492 (2009).</li>
<li>Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+techniques+for+assaying+lymphocyte+activation+in+action%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action.</a> Nat Rev Immunol. 11 (1), 21-33 (2011).</li>
<li>Cebecauer, M., Spitaler, M., Serge, A., Magee, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signalling+complexes+and+clusters%3A+functional+advantages+and+methodological+hurdles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Signalling complexes and clusters: functional advantages and methodological hurdles.</a> J Cell Sci. 123, 309-320 (2010).</li>
<li>Oddos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+high-resolution+imaging+of+intercellular+immune+synapses+using+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">High-speed high-resolution imaging of intercellular immune synapses using optical tweezers.</a> Biophys J. 95 (10), L66-L68 (2008).</li>
<li>Grakoui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunological+synapse%3A+a+molecular+machine+controlling+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285 (5425), 221-227 (1999).</li>
<li>Bunnell, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor+ligation+induces+the+formation+of+dynamically+regulated+signaling+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">T cell receptor ligation induces the formation of dynamically regulated signaling assemblies.</a> J Cell Biol. 158 (7), 1263-1275 (2002).</li>
<li>Yokosuka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newly+generated+T+cell+receptor+microclusters+initiate+and+sustain+T+cell+activation+by+recruitment+of+Zap70+and+SLP-76%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76.</a> Nat Immunol. 6 (12), 1253-1262 (2005).</li>
<li>Seminario, M. C., Bunnell, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+initiation+in+T-cell+receptor+microclusters%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Signal initiation in T-cell receptor microclusters.</a> Immunol Rev. 221, 90-106 (2008).</li>
<li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+bilayers+at+the+vanguard+of+immune+cell+activation+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Supported bilayers at the vanguard of immune cell activation studies.</a> J Struct Biol. 168 (1), 152-160 (2009).</li>
<li>Martinelli, R., Carman, C. V. Lymphocyte Endothelilal Interactions. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMartinelli%2C+R+%22Encyclopedia+of+Cell+Biology%22">Encyclopedia of Cell Biology</a>. Bradshaw, R. A., Stahl, P. , Elsevier. London. (2015).</li>
<li>Choi, J., Enis, D. R., Koh, K. P., Shiao, S. L., Pober, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+lymphocyte-endothelial+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">T lymphocyte-endothelial cell interactions.</a> Annu Rev Immunol. 22, 683-709 (2004).</li>
<li>Marelli-Berg, F. M., Jarmin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+presentation+by+the+endothelium%3A+a+green+light+for+antigen-specific+T+cell+trafficking%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Lett%22%5BJournal%5D)">Antigen presentation by the endothelium: a green light for antigen-specific T cell trafficking?</a> Immunol Lett. 93 (2-3), 109-113 (2004).</li>
<li>Sage, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+recognition+is+facilitated+by+invadosome-like+protrusions+formed+by+memory%2Feffector+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antigen recognition is facilitated by invadosome-like protrusions formed by memory/effector T cells.</a> J Immunol. 188 (8), 3686-3699 (2012).</li>
<li>Kumari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+foci+facilitate+activation+of+the+phospholipase+C-gama+in+primary+T+lymphocytes+via+the+WASP+pathway+%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Actin foci facilitate activation of the phospholipase C-gama in primary T lymphocytes via the WASP pathway .</a> eLife. , (2015).</li>
<li>Marelli-Berg, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Major+histocompatibility+complex+class+II-expressing+endothelial+cells+induce+allospecific+nonresponsiveness+in+naive+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Major histocompatibility complex class II-expressing endothelial cells induce allospecific nonresponsiveness in naive T cells.</a> J Exp Med. 183 (4), 1603-1612 (1996).</li>
<li>Ma, W., Pober, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+endothelial+cells+effectively+costimulate+cytokine+production+by%2C+but+not+differentiation+of%2C+naive+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human endothelial cells effectively costimulate cytokine production by, but not differentiation of, naive CD4+ T cells.</a> J Immunol. 161 (5), 2158-2167 (1998).</li>
<li>Perez, V. L., Henault, L., Lichtman, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+antigen+presentation%3A+stimulation+of+previously+activated+but+not+naive+TCR-transgenic+mouse+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Immunol%22%5BJournal%5D)">Endothelial antigen presentation: stimulation of previously activated but not naive TCR-transgenic mouse T cells.</a> Cell Immunol. 189 (1), 31-40 (1998).</li>
<li>Epperson, D. E., Pober, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen-presenting+function+of+human+endothelial+cells.+Direct+activation+of+resting+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antigen-presenting function of human endothelial cells. Direct activation of resting CD8 T cells.</a> J Immunol. 153 (12), 5402-5412 (1994).</li>
<li>Shiao, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+effector+memory+CD4%2B+T+cells+directly+recognize+allogeneic+endothelial+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human effector memory CD4+ T cells directly recognize allogeneic endothelial cells in vitro and in vivo.</a> J Immunol. 179 (7), 4397-4404 (2007).</li>
<li>Marelli-Berg, F. M., Okkenhaug, K., Mirenda, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+two-signal+model+for+T+cell+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">A two-signal model for T cell trafficking.</a> Trends Immunol. 28 (6), 267-273 (2007).</li>
<li>Carman, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcellular+diapedesis+is+initiated+by+invasive+podosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Transcellular diapedesis is initiated by invasive podosomes.</a> Immunity. 26 (6), 784-797 (2007).</li>
<li>Carman, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+for+transcellular+diapedesis%3A+probing+and+pathfinding+by+%27invadosome-like+protrusions%27%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms for transcellular diapedesis: probing and pathfinding by 'invadosome-like protrusions'.</a> J Cell Sci. 122 ((Pt 17)), 3025-3035 (2009).</li>
<li>Dustin, M. L., Tseng, S. Y., Varma, R., Campi, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell-dendritic+cell+immunological+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">T cell-dendritic cell immunological synapses.</a> Curr Opin Immunol. 18 (4), 512-516 (2006).</li>
<li>Saito, T., Yokosuka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+synapse+and+microclusters%3A+the+site+for+recognition+and+activation+of+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunological synapse and microclusters: the site for recognition and activation of T cells.</a> Curr Opin Immunol. 18 (3), 305-313 (2006).</li>
<li>Gomez, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HS1+functions+as+an+essential+actin-regulatory+adaptor+protein+at+the+immune+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">HS1 functions as an essential actin-regulatory adaptor protein at the immune synapse.</a> Immunity. 24 (6), 741-752 (2006).</li>
<li>Burbach, B. J., Medeiros, R. B., Mueller, K. L., Shimizu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+receptor+signaling+to+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">T-cell receptor signaling to integrins.</a> Immunol Rev. 218, 65-81 (2007).</li>
<li>Vicente-Manzanares, M., Sanchez-Madrid, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+cytoskeleton+during+leukocyte+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Role of the cytoskeleton during leukocyte responses.</a> Nat Rev Immunol. 4 (2), 110-122 (2004).</li>
<li>Ma, Z., Janmey, P. A., Finkel, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+receptor+deformation+model+of+TCR+triggering%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+J%22%5BJournal%5D)">The receptor deformation model of TCR triggering.</a> Faseb J. 22 (4), 1002-1008 (2008).</li>
<li>Ma, Z., Sharp, K. A., Janmey, P. A., Finkel, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface-anchored+monomeric+agonist+pMHCs+alone+trigger+TCR+with+high+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Surface-anchored monomeric agonist pMHCs alone trigger TCR with high sensitivity.</a> PLoS Biol. 6 (2), e43(2008).</li>
<li>Groves, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bending+mechanics+and+molecular+organization+in+biological+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Phys+Chem%22%5BJournal%5D)">Bending mechanics and molecular organization in biological membranes.</a> Annu Rev Phys Chem. 58, 697-717 (2007).</li>
<li>Xu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+T+cell+receptor+activation+by+dynamic+membrane+binding+of+the+CD3epsilon+cytoplasmic+tyrosine-based+motif%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of T cell receptor activation by dynamic membrane binding of the CD3epsilon cytoplasmic tyrosine-based motif.</a> Cell. 135 (4), 702-713 (2008).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Nel complesso, questo protocollo descrive i metodi per indagare le cellule endoteliali come i) understudied APC fisiologici e ii) come un nuovo tipo di &#39;planare cellulare modello APC&#39;. Per quanto riguarda il primo, è diventato sempre più apprezzato che APC non ematopoietiche periferiche (o &#39;stromali&#39;) svolgono, un ruolo non ridondanti critici (ad esempio, rispetto a ematopoietiche APC) nel modellare le risposte immunitarie adattive 16-18. Tra tali &#39;semi-professionale&#39; APC, vas...

Linfociti T sono un ramo del sistema immunitario adattativo caratterizzato dalla capacità di riconoscere efficientemente antigene peptide (Ag) vincolato al complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) molecole attraverso i recettori delle cellule T (TCR) 1. Linfociti naïve costitutivamente migrano e Scan &#39;Ag cellule presentanti professionali »(APC, ad esempio, cellule dendritiche) all&#39;interno dei linfonodi, mentre le cellule di memoria / T effettrici devono sorvegliare efficacemente una gamma estremamente ampia di APC e potenziali cellule bersaglio all&#39;interno dei tessuti periferici. Nel min seguente iscrizione iniziale delle cognate Ag su un APC, linfociti arrestare la loro migrazione e cominciano a formare un professionista intimo un&#39;interfaccia cellula-cellula chiamato &#39;sinapsi immunologica&#39; (IS). Sostenuta (cioè, 30-60 min) È contatti sono tenuti per amplificare e sostenere segnalazione 2-7. Studi emergenti identificano che all&#39;interno della IS, è la formazione continua e rapida remodeling di discrete segnalazione sub-cellulare micro-cluster (ad esempio, contengono MHC / Ag-TCR, F-actina, adesione e molecole di segnalazione), che determinano la forza e la qualità della conseguente risposta immunitaria 2-7. Tuttavia, i dettagli dinamici e meccanismo di regolazione di questo processo non sono completamente compresi 8,9. Ciò deriva in gran parte da problemi tecnici connessi con topologie irregolari di superfici APC e l&#39;orientamento mal controllata dei piani di interazione cellula-cellula, i problemi che limitano profondamente imaging spazio-temporale richiesto avvicina 8-10 (Figure1A). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53288/53288fig1.jpg" /> Figura 1. Una fisiologica Planar APC cellulare Modello for Imaging immunologiche Synapse Dynamics. Lo schema mostra l&#39;imaging tradizionale di sinapsi immunologica tra una cellula T e un professio<html> nal APC (A) e cellule T e un modello tradizionale lipidico planare doppio strato APC (B) rispetto a questo romanzo endoteliale modello planare APC (C). APC professionali forniscono sinapsi immunologiche fisiologiche ma offrono interfaccia mal orientata cellula-cellula (cioè, rispetto al piano ottimale di imaging xy; risoluzione ~ 0,2 micron), che compromette notevolmente spaziale (piano di imaging z risoluzione ~ 1 micron) e temporale (cioè, a causa della necessità di eseguire la scansione ripetutamente attraverso tutti i piani di imaging z) Risoluzione di imaging. Modelli a doppio strato hanno una topologia planare che fornisce la risoluzione ottimale delle immagini spazio-temporale, ma sono anche molto semplificate, non fisiologica e rigida. Questo modello delle cellule endoteliali combina la topologia planare di doppi strati lipidici con il substrato fisiologico di un classico APC per fornire la risoluzione ottimale di imaging spaziale e temporale in un ambiente fisiologico.m / files / ftp_upload / 53288 / 53288fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Il lavoro precedente ha parzialmente aggirato questi ostacoli attraverso lo sviluppo di modelli di substrato planare (ad esempio, doppi strati lipidici e superfici rivestiti con anticorpo) che forniscono la risoluzione spazio-temporale ottimale (cioè, mediante il fissaggio alla superficie di attivazione delle cellule T in un unico piano che è parallelo al di imaging ottimale xy piano) 11-15 (Figura 1B). Questi modelli hanno facilitato importanti conoscenze sulle dinamiche subcellulari / molecolari che controllano la segnalazione antigenico nelle cellule T, tra cui la scoperta di actina dinamico / TCR segnalazione micro-cluster 7,11-14. Tuttavia, tali modelli sono intrinsecamente avevano semplificato, così come rigida (precludendo sviluppo / studio delle caratteristiche topologiche 3-dimensionali) (Figura 1B). Pertanto, rimane incerto su come relazionarsi tali risultati al PHYsiologic cellula-cellula sorveglianza immunitaria. Sebbene ancora poco studiato, vascolari e cellule endoteliali linfatiche stanno emergendo come un grande (vale a dire, maggiore in numero rispetto a tutti APC professionali, da ~ 1.000 volte) compartimento periferico di &#39;semi-professionale&#39; APC 16-18. Queste cellule esprimono MHC-I-, MHC-II e una moltitudine di molecole co-stimolatore (ad esempio, CD40, LFA3, ICOSL, 4-1BB, OX40L, TL1A, PD-L1, ma non CD80 e CD86) e sono strategicamente posizionato all&#39;interfaccia sangue tessuto in cui servono le funzioni di sentinella specializzate 16-18. Studi precedenti hanno dimostrato che le cellule endoteliali possono effettivamente ri-stimolare effettori / memoria, ma non ingenua, le cellule T 19-25. Così, le cellule endoteliali sono suscettibili di svolgere ruoli unici APC in fase effettrice delle risposte immunitarie adattive all&#39;interno dei tessuti periferici, come ad esempio l&#39;influenza locale all&#39;attivazione delle cellule T, la differenziazione, la memoria e la tolleranza 16,17,26. Criticamente, quando coltivate in vitro, le cellule endoteliali formano superfici cellulari praticamente piane e sono immediatamente transfectable (ad esempio, con i reporter proteina fluorescente). Queste caratteristiche sono ideali per imaging ad alta risoluzione spazio-temporale delle dinamiche topologiche durante le interazioni cellula-cellula 19,27. Così le cellule endoteliali potrebbe servire come &#39;cellulare planare APC&#39; modello fisiologico distintamente adatto per lo studio dei meccanismi di rimodellamento sottocellulari / molecolare che guidano riconoscimento dell&#39;antigene e regolano le risposte (Figura 1C) 19,20. Precedentemente stabilito tecniche di imaging complementari (comprese trasfezione di cellule endoteli con accessori proteina fluorescente della membrana plasmatica e citosol) per studiare i dettagli di interazione leucociti-endotelio durante adesione e migrazione transendoteliale 27, hanno mostrato che i leucociti sondare attivamente superficie dell&#39;endotelio dalla dinamica l&#39;inserimento di und retrazione del sub-micron-scala, sporgenze cilindriche ricco di actina (~ 200-1.000 nm di diametro e profondità) definito invadosome-come sporgenze (vale a dire, &#39;ILPS&#39;) 27,28. Questi approcci di imaging sono state ulteriormente espansa insieme alla creazione di protocolli di sfruttare funzione endoteliale APC per sviluppare i primi metodi per un&#39;alta risoluzione spazio-temporale della cellula endoteliale sinapsi immunologica T come riportato 19,20 e ulteriormente descrivere qui. Un risultato centrale derivato da questo romanzo planare cellulare modello APC è che ILPS cellule T funzionano sia nel promuovere il riconoscimento iniziale Ag e nel sostenere la successiva segnalazione. In effetti, gli array di più ILPS (che sono stati stabilizzati e maturati in risposta alla prima flusso di calcio) spettacolo di arricchimento in TCR e molecole suggestivi della segnalazione attiva tale PKC-Q, ZAP-70, phosphotyrosine e HS1. Pertanto, ILPS sembrano rappresentare un equivalente fisiologica tridimensionale al micro TCR segnalazionecluster visto in modelli doppio strato planari. Questo approccio, quindi, sensibilmente rivela / report dinamica molecolare e architettonici (e implicite biomeccanica) non altrimenti rilevabile. Il metodo qui descritto dovrebbe essere utile per colmare il divario tra APC professionali e modelli substrato artificiale APC, al fine di migliorare la nostra capacità di interrogare meccanismi di base della risposta immunitaria adattativa. Mentre qui l&#39;attenzione è sull&#39;attivazione di CD4 + di tipo Th1 effettore / cella di memoria, questo approccio di base può essere facilmente modificato per studiare una vasta gamma di tipi di cellule T e Ags, come discusso di seguito.

<table><tbody><tr><td>BD Vacutainer stretch latex free tourniquet BD</td><td>Biosciences</td><td>367203</td><td></td></tr><tr><td>tamponi imbevuti di alcol BD</td><td>Biosciences</td><td>326895</td><td></td></tr><tr><td>BD Vacutainer Safety-Lok</td><td>BD Biosciences</td><td>367861</td><td>K2 EDTA</td></tr><tr><td>BD Vacutainer Set per la raccolta del sangue a pulsante</td><td>BD Biosciences</td><td>367335</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758-1L</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE17-1440-02</td><td>Portare a RT prima dell'uso</td></tr><tr><td>FCS-Optima</td><td>Atlanta Biologics</td><td>s12450</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td> inattivata a caldo <td>Sigma-Aldrich</td><td>P4458-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154-20ML</td><td></td></tr><tr><td>stafilococco enterotossina B</td><td>Tossina Tecnologia</td><td>BT202RED</td><td>Soluzione madre 1 mg/ml nella</td></tr><tr><td>tossina 1</td><td>della tossina della sindrome</td> da shock tossico <td>PBS TT606RED</td><td>Soluzione madre 1 mg/ml in</td></tr><tr><td>PBS IL-15 R</td><td>& D Systems</td><td>247-IL-025</td><td>Soluzione madre 50ug/ml in PBS</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010-049</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>Life Technologies</td><td>33016-015</td><td>Soluzione madre 1mg/ml in H20</td></tr><tr><td>HMVEC-d Ad-Dermal MV Endo Cells</td><td>Lonza</td><td>CC-2543</td><td>Possono essere utilizzate altre EC microvascolari umane, ad esempio HLMVECs</td></tr><tr><td>EGM-2 MV bullet kit</td><td>Lonza</td><td>CC-3202</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-4174</td><td>Soluzione madre 10x, diluito in PBS</td></tr><tr><td>amaxa-HMVEC-L Kit nucleofector</td><td>Lonza</td><td>vpb1003</td><td>Kit richiesto per la fase 4</td></tr><tr><td>IFN-g</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I3265</td><td>Soluzione madre 1mg/ml in H20</td></tr><tr><td>TNF-alfa 10ug, Human</td><td>Life Technologies</td><td>PHC3015</td><td>Soluzione madre 1mg/ml in fenolo H20</td></tr><tr><td>HBSS senza rosso</td><td>Life Technologies</td><td>14175-103</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP299-100</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016-100G</td><td>Soluzione madre 1M in H20</td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208337</td><td>Soluzione madre 1M in H20</td></tr><tr><td>Siero umano albumina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6909-10ml</td><td></td></tr><tr><td>Immersol 518 F olio da immersione senza fluorescenza</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-624-66A</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 AM 20x50ug</td><td>Life Technologies</td><td>F1221</td><td>Soluzione madre 1mM in DMSO</td></tr><tr><td>pEYFP-Mem (Mem-YFP)</td><td>Clontech</td><td>6917-1</td><td></td></tr><tr><td>pDsRed-Monomero (DsRed citoplasmatico solubile)</td><td>Clontech</td><td>632466</td><td></td></tr><tr><td>pDsRed-Monomer Membrane (Mem-DsRed)</td><td>Clontech</td><td>632512</td><td></td></tr><tr><td>pEGFP-Actin</td><td>Clontech</td><td>6116-1</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>Life Technologies</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di formaldeide 37%</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP531-500</td><td>Tossico, utilizzare la cappa di aspirazione</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-5ML</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Provette da centrifuga coniche Falcon 15mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-70C</td><td></td></tr><tr><td>Provette da centrifuga coniche Falcon 50mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fiasche trattate con coltura tissutale Falcon T25</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-126-9</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Fiasche trattate con coltura tissutale Falcon T75</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; 13-680-65</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Coltura cellulare Corning trattata T175</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-126-61&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-85&nbsp;</td><td>Diametro 12 mm</td></tr><tr><td>&nbsp; Piastre per colture tissutali Falcon a 24 pozzetti</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1</td><td></td></tr><tr><td>Piastre Delta-T</td><td>Bioptechs</td><td>04200415B</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Pasteur monouso Wheaton</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-8D</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml provetta Eppendorf</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-402-25</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; ICAM1 topo anti-umano</td><td>BD Biosciences</td><td>555509</td><td></td></tr><tr><td>HS1 topo anti-umano</td><td>BD Biosciences</td><td>610541</td><td></td></tr><tr><td>Anti-umano CD11a (LFA-1alfa) Purificato</td><td>ebioscience</td><td>BMS102</td><td></td></tr><tr><td>Anti-umano CD3 Alexa Fluor&reg; 488</td><td>ebioscience</td><td>53-0037-41</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-MHC di classe II&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab55152</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Talin 1</td><td>Abcam</td><td>ab71333</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-PKC theta&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab109481</td><td></td></tr><tr><td>fosfotirosina (4G10 platino)</td><td>Millipore</td><td>50-171-463</td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector II</td><td>Amaxa Biosystems</td><td></td><td>Elettroporatore richiesto per la fase 4</td></tr><tr><td>Zeiss Axiovert</td><td>Carl Zeiss MicroImaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM510&nbsp;</td><td>Carl Zeiss MicroImaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Software Axiovison</td><td>Carl Zeiss MicroImaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NU-425 (Serie 60) Cabina di sicurezza biologica</td><td>NuAIRE</td><td>Nu-425-600</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Forma STRCYCLE 37 &deg; C, Incubatore per colture cellulari al 5% di CO2</td><td>Fisher Scientific</td><td>202370</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga 5810</td><td>Eppendorf</td><td>EW-02570-02</td><td></td></tr><tr><td>Emocitometro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; Z359629</td><td>Emocitometro Bright-Line</td></tr><tr><td>Isotemp Bagnomaria modello 202</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-462-2</td><td></td></tr></tbody></table>

un modello cellule endoteliali planar for imaging immunologiche synapse dynamics

An Endothelial Planar Cell Model for Imaging Immunological Synapse Dynamics

Immunità adattativa è regolata da interazioni dinamiche tra cellule T e cellule presentanti l&#39;antigene (&#39;APC&#39;) denominati «sinapsi immunologica. All&#39;interno di queste interfacce cellula-cellula intime discrete sub-cellulari cluster di MHC / Ag-TCR, F-actina, adesione e molecole di segnalazione si formano e rimodellano rapidamente. Queste dinamiche si pensa siano fattori determinanti sia per l&#39;efficienza e la qualità delle risposte immunitarie che sviluppano e quindi di protezione contro l&#39;immunità patologica. Attuale comprensione delle sinapsi immunologiche con fisiologica APC è limitata dalla inadeguatezza della risoluzione delle immagini ottenibili. Anche se i modelli substrato artificiale (ad esempio, doppi strati lipidici planari) offrono un&#39;eccellente risoluzione e sono stati strumenti estremamente utili, essi sono intrinsecamente non-fisiologica e semplicistica. Cellule endoteliali vascolari e linfatiche sono emersi come un importante tessuto periferico (o stromale) Vano di &#39;semi-professionaleAl APC &#39;. Questi APC (che esprimono la maggior parte del macchinario molecolare di professionisti APC) hanno la caratteristica unica di formare superficie cellulare praticamente piana e sono immediatamente transfectable (ad esempio, con i giornalisti proteina fluorescente). Qui un approccio di base per l&#39;attuazione cellule endoteliali come un romanzo e fisiologica &#39;planare modello APC cellulare&#39; per migliorare l&#39;imaging e l&#39;interrogazione dei processi di segnalazione antigeniche fondamentali sarà descritto.

Un nuovo approccio di imaging utilizzando cellule endoteliali e combinando i vantaggi risoluzione della planare bistrati lipidici modello con la complessità fisiologica e deformabilità professionale APC stato sviluppato (Figura 1). La Figura 2 fornisce esempi di migrazione tipica, flusso di calcio e dinamiche topologici osservato con questo approccio. In assenza di SAG in endotelio, SAG-specifici linfociti CD4 + Th1 rapidament...

L'immunità adattativa è controllata da 'sinapsi immunologiche' dinamiche formate tra le cellule T e le cellule presentanti l'antigene. Questo protocollo descrive i metodi per studiare le cellule endoteliali sia come APC fisiologiche poco studiate sia come un nuovo tipo di "modello di APC cellulare planare".

Un modello cellule endoteliali Planar for Imaging immunologiche Synapse Dynamics

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological ...

L'obiettivo generale di questa tecnica è utilizzare le cellule endoteliali come un nuovo modello di cellula presentatrice di antigene planare per studiare i processi fondamentali di segnalazione antigenica. Questo metodo può aiutarci ad affrontare domande chiave nel campo dell'immunità adattativa, ad esempio come i processi di rimodellamento subcellulare e molecolare siano coordinati spazialmente e temporalmente all'interno della sinapsi immunologica. Il principale vantaggio di questa tecnica è che l'endotelio forma una superficie di cellula presentatrice praticamente planare.Questo consente di ottenere immagini con una risoluzione spaziotemporale ottimale nel contesto di una superficie cellulare fisiologicamente complessa e modellabile. Sebbene questo metodo si concentri sull'attivazione delle cellule T effettrici di memoria CD4 positive, può essere applicato anche allo studio di diversi tipi di cellule T, antigeni e processi di segnalazione. Oggi, Chris e io vi mostreremo come eseguire il secondo passaggio: iniziare codificando la trascrizione di cellule endoteliali microvascolari primarie umane polmonari o dermiche con YFP membranaria e DS rosso solubile tramite affezione nucleare NU e piastrare le cellule trasfettate su piastre per colture cellulari viventi destinate all'acquisizione di immagini.Il giorno successivo, sostituire il mezzo di coltura cellulare con mezzo fresco integrato con interferone gamma per indurre l'espressione di MHC di classe II sulle cellule endoteliali, seguito dalla stimolazione delle cellule con 20 nanogrammi per millilitro di TNF-alfa 24 ore dopo, al giorno tre, per un periodo di 30-60 minuti. Prima di iniziare l'esperimento, incubare l'endotelio con un microgrammo per millilitro, ciascuno, dei superantigeni batterici enterotossina B stafilococcica e tossina da sindrome da shock tossico-1 a 37 gradi Celsius. Durante l'incubazione, contare il numero di cellule vitali dalla coltura di linfociti di interesse e trasferire due volte 10 alla sesta di queste cellule in un tubo conico da 15 millilitri.Successivamente, centrifugare le cellule e risospendere il pellet in due millilitri di tampone A appena preparato, in modo che non rimangano aggregati cellulari. Quindi aggiungere due micromoli di RA due al campione di linfociti T, chiudere il tubo e capovolgerlo immediatamente per distribuire in modo omogeneo il colorante in tutta la sospensione cellulare.Dopo un'incubazione di 30 minuti a 37 gradi Celsius, centrifugare i linfociti marcati e risospendere delicatamente ma accuratamente le cellule in 20-40 microlitri di buffer A fresco per l'acquisizione delle immagini. Accendere il microscopio e aprire il software appropriato per la cattura delle immagini. Impostare i parametri corretti per l'acquisizione automatica di immagini multicanale in time-lapse, nonché l'intervallo di acquisizione compreso tra 10 e 30 secondi e una durata totale di circa 20-60 minuti. Successivamente, aggiungere olio fresco all'obiettivo.Montare una piastra microscopica contenente 0,5 millilitri di tampone A sull'adattatore del palco riscaldante e accendere immediatamente l'adattatore precedentemente impostato a 37 gradi Celsius. Dopo due o tre minuti di equilibrazione, utilizzare una pipetta da 20 microlitri per aggiungere i linfociti in riposo caricati con RA2 nella camera della piastra microscopica montata e attivare l'immagine in campo chiaro. Selezionare il percorso della luce verso gli oculari e utilizzare la manopola di messa a fuoco grossolana per portare l'obiettivo a contatto con il fondo della piastra microscopica.Quindi utilizzare l'oculare e la manopola della messa a fuoco fine per individuare le cellule T depositate sul fondo della piastra e usare i comandi dello stage XY per selezionare un campo contenente almeno 10 cellule, una volta localizzate le cellule appropriate. Passare dalla sorgente luminosa a campo chiaro a quella fluorescente e dall'imaging IP alla fotocamera CCD. Ottimizzare i parametri di acquisizione e quindi acquisire le immagini di riposo di Fira 2 3 40 e FIRA 2 3 80.Uno dei passaggi chiave per ottenere risultati soddisfacenti è l'accurata ottimizzazione dei parametri di acquisizione della fluorescenza, assicurando che venga raccolto un segnale sufficiente e, nel caso della fira due, che il rapporto di base 3 43 80 sia prossimo a uno. Una volta impostati i tempi di esposizione della fira due, sostituire la piastra delle cellule T con una piastra microscopica contenente cellule endoteliali; utilizzando una pipetta monouso, rimuovere rapidamente il mezzo e lavare le cellule una volta con un millilitro di tampone A preriscaldato, quindi sostituire il lavaggio con 0,5 millilitri di tampone A fresco. Utilizzando l'obiettivo, identificare i campi in cui le cellule endoteliali fortemente fluorescenti appaiono sane. Successivamente, regolare i parametri di acquisizione per la YFP della membrana e per la DS RED come appena dimostrato per la fira two.Assicurarsi che l'intensità media del segnale fluorescente in ogni canale rientri tra il 25 e il 75% della gamma dinamica del rilevatore. Prima di eseguire l'esperimento di imaging su cellule vive, acquisire diversi intervalli di immagini delle cellule endoteliali da sole per stabilire una linea di base mediante il software automatico. Successivamente, inserire la punta di un piccolo volume nel mezzo, vicino al centro dell'obiettivo.Rilasciare lentamente cinque microlitri di fira concentrato, contenente due linfociti carichi, al centro del campo di imaging della piastra per microscopia. Mentre i linfociti si depositano, effettuare regolazioni fini del fuoco per assicurare che le interfacce tra linfociti T e cellule endoteliali siano mantenute nel piano focale. Con obiettivi da 40x e 63x, da 10 a 20 cellule per campo risultano ottimali.Dopo l'intervallo di osservazione desiderato, continuare l'acquisizione delle immagini e pipettare immediatamente il CIN direttamente nella piastra del microscopio fino a una concentrazione finale di due micromoli per litro per indurre un flusso massimale di calcio nella sfera. Due segnale. Quando si applicano trattamenti alle cellule, prestare attenzione a mantenere un fuoco nitido sulla superficie apicale dell'endotelio marcata con YFP, al fine di garantire una risoluzione ottimale del rimodellamento della sinapsi immunitaria.In assenza di superantigene, i linfociti T helper di tipo 1 CD4 positivi specifici per il superantigene endoteliale si diffondono rapidamente, polarizzano e migrano lateralmente sulle cellule endoteliali. Durante questo processo, i linfociti estendono protrusioni di breve durata o ILP all'interno della superficie endoteliale, che si manifestano come anelli di fluorescenza YFP della membrana analoghi a impronte; in presenza di superantigene, i contatti ravvicinati tra cellula e cellula, guidati dagli ILP, sono associati all'avvio di un flusso di calcio che porta all'accumulo di ILP stabilizzati all'interno della sinapsi immunologica. Tali raggruppamenti di ILP sono associati a un segnale di calcio sostenuto.Gli anelli di fluorescenza della membrana che si formano durante le interazioni tra cellule T e cellule endoteliali corrispondono alle protrusioni delle cellule T che determinano punti discreti di invaginazione nelle cellule endoteliali, come confermato dalla dimostrazione che questi anelli si sovrappongono spazialmente e cineticamente alle zone di citoplasma spostato ed escluso. Entro pochi minuti dalla co-incubazione delle cellule endoteliali e delle cellule T in presenza di superantigene, molecole di adesione e di segnalazione associate al riconoscimento antigenico risultano co-enricchite all'interno delle impronte pota e delle PLI (punte invaginanti) della sinapsi immunologica. Effettivamente, la sinapsi immunologica tra cellula T e cellula endoteliale presenta un'architettura tridimensionale distinta, caratterizzata da PLI delle cellule T che si estendono nella superficie della cellula presentatrice di antigene, all'interno delle quali è arricchito il complesso molecolare responsabile del riconoscimento dell'antigene.Con questo approccio, è possibile superare gli ostacoli principali presenti nei modelli di a PC esistenti, consentendo l'osservazione di architetture subcellulari tridimensionali altrimenti non rilevabili e il rapido rimodellamento delle interfacce fisiologiche tra linfociti T e a PC. Questo offre la possibilità di raggiungere nuovi livelli di comprensione dei processi di segnalazione antigenica.

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Supportati doppi strati planari sono strumenti potenti che possono essere utilizzati per modellare le interazioni molecolari in una sinapsi immunologica. Qui vi mostriamo i metodi per l'ancoraggio delle proteine ​​di adesione cellulare conosciuto per modulare la formazione di sinapsi il foglio superiore della bilyer lipidi e visualizzare formazione di sinapsi usando la microscopia TIRF.

Supportato bilayers Planar per la formazione degli Studi di sinapsi immunologica e Kinapse

Questo articolo descrive un metodo per visualizzare la formazione di una sinapsi HIV-1 busta-indotta virologici vetro bistrati planari supportate da fluorescenza riflessione interna totale (TIRF) microscopia. Il metodo può anche essere combinato con immunofluorescenza per rilevare l'attivazione e ridistribuzione di molecole di segnalazione che si verificano durante HIV-1 busta indotta la formazione di sinapsi virologica.

Imaging di HIV-1 Envelope indotta Synapse virologica e segnalazione sui doppi strati lipidici sintetici

Questo video dimostra una tecnica in vitro per studiare la formazione di sinapsi immunitarie tra le cellule T umane primarie e i doppi strati lipidici supportati (SLB). Le proteine della superficie delle cellule T interagiscono con i rispettivi ligandi immobilizzati su SLB per formare una sinapsi immunitaria, seguita dal movimento dei granuli litici verso la sinapsi, che viene visualizzato utilizzando la microscopia a fluorescenza.

Una tecnica in vitro per studiare l'interazione delle cellule T con i doppi strati lipidici planari supportati

Questo video mostra l'imaging di cellule vive della topologia immunologica delle sinapsi, studiando le interazioni tra i linfociti T e le cellule epiteliali che trasportano antigeni fluorescenti. La microscopia a fluorescenza rivela lo spostamento del citoplasma rosso e gli anelli gialli della membrana nelle cellule endoteliali, indicando la formazione di sinapsi immunologiche.

Valutazione della topologia immunologica delle sinapsi attraverso l'imaging di cellule vive

Fonte: Ing-Esteves, S. &amp; Lefebvre, J. L. Time-Lapse Imaging of Neuronal Arborization using Sparse Adeno-Associated Virus Labeling of Genetically Targeted Powder Cell Populations. J. Vis. Exp. (2021)Questo video dimostra l'uso della microscopia confocale per visualizzare le dinamiche dendritiche negli espianti retinici di topi vivi. Delinea i passaggi per stabilizzare la retina sotto un microscopio confocale, eseguire l'imaging in epifluorescenza per visualizzare gli interneuroni amacrini...

Imaging confocale time-lapse della dinamica dendritica neuronale negli espianti di retina di topo

Qui illustriamo il protocollo per l'imaging a due colori STED nanoscopia il citotossica sinapsi immunitaria delle cellule NK ricapitolato su vetro. Usando questo metodo si ottiene nm risoluzione sub-100 di proteine ​​sinaptiche e il citoscheletro.

Visualizzazione della immunologica Synapse da Dual Color Time-gated emissione stimolata Depletion (STED) Nanoscopia

I leucociti attraversano il monostrato endoteliale utilizzando il paracellulare o il percorso transcellulare. Abbiamo sviluppato un test semplice per seguire la distribuzione di giunzionale endogena VE-caderina e PECAM-1 durante la migrazione dei leucociti transendoteliale sotto flusso fisiologico di discriminare tra le due vie di trasmigrazione.

In tempo reale Imaging del endoteliali giunzioni cellula-cellula Durante neutrofili Trasmigrazione Sotto fisiologico flusso

Descriviamo qui una combinazione della tecnica del doppio strato lipidico supportato da vetro per formare sinapsi immunologiche con la tecnica di imaging a super-risoluzione della microscopia STED (Stimulated Emission Depletion). L'obiettivo di questo protocollo è fornire agli utenti le istruzioni necessarie per eseguire con successo queste due tecniche.

Super-Resolution Imaging di cellule Natural Killer immunologica Sinapsi su un vetro supportato Planar doppio strato lipidico

Qui, descriviamo un completo flusso di lavoro per l'analisi qualitativa e quantitativa del sistema immunitarie sinapsi tra cellule T umane primarie e cellule presentanti l'antigene. Il metodo si basa su imaging citometria a flusso, che permette l'acquisizione e la valutazione di diverse immagini di migliaia di cellule all'interno di un periodo di tempo relativamente breve.

Analisi qualitativa e quantitativa della sinapsi Immune nel sistema umano utilizzando Imaging citometria a flusso

Questo protocollo immagini sia la formazione di sinapsi immunologica che il successivo traffico secretoria polarizzato verso la sinapsi immunologica. I coniugati cellulari si formarono tra una cellula Raji dal polso superantigeno (che fungeva da cellula che presenta l'antigene) e un clone di Jurkat (che fungeva da aiutante echeggiatore del linfocito T).

Immaginare la sinapsi immunologica umana

Questo rapporto fornisce protocolli per l'assemblaggio, la coltura cellulare e i saggi sulla piattaforma μSiM per la costruzione di modelli di barriera emato-encefalica.

Utilizzo della piattaforma tissutale barriera MicroSiM (μSiM) per la modellazione della barriera emato-encefalica

Scopri un modello cellulare planare con cellule endoteliali per studiare la dinamica delle sinapsi immunologiche e l'attivazione dei linfociti T. Questa tecnica consente imaging ad alta risoluzione dei processi di segnalazione antigenica.

Un modello cellule endoteliali Planar for Imaging immunologiche Synapse Dynamics

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