Name: High Throughput Danio Rerio Energia spese Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-27T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Scopri un saggio fluorometrico ad alto rendimento per misurare la produzione di NADH2 e il tasso metabolico in larve di Danio rerio. Questo metodo consente lo screening di farmaci e geni per studi sull'omeostasi energetica.

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Gli autori desiderano ringraziare i dottori Roger Cone e Chao Zhang per i loro contributi alla convalida dell'applicazione di questo test come precedentemente pubblicato. Questo lavoro è stato supportato da NIH 1F32DK082167-01 (BJR).

Nota: Questo protocollo segue le linee guida della University of Arizona Ufficio per una gestione responsabile della Ricerca ed è stato approvato dalla cura degli animali e del Comitato Usa Istituzionale 1. Allevamento Zebrafish e Embryo manutenzione <ol><li> Preparare E3 embrione media 8. Fare 60x soluzione madre, sciogliere 34,8 g di NaCl, 1,6 g KCl, 5.8g CaCl 2 ● 2H 2 O, e 9,78 g MgCl 2 ● 6H 2 O a 1,95 L ddiH 2 O. Regolare il pH a 7,2 con NaOH e HCl Regolare il volume a 2 L utilizzando ddiH 2 O. </li><li> Per preparare 1x E3 medio embrione, diluire 16,5 ml 60x magazzino in 1 L ddiH20. Aggiungere 100 ml 1% di blu di metilene. </li><li> Allevamento <ol><li> Casa Maschio e femmina nidiata magazzino (7 - 18 mesi di età) separatamente per massimizzare la fecondità. </li><li> Spegnere le luci 1-2 ore prima del giorno precedente uova sono desiderati. Impostare l&#39;accoppiamento (1 maschio e 1 - 2 femmine) in cgabbie Rossing come precedentemente descritto 9. Gabbie Crossing consentono per le uova di sfuggire predazione che passano attraverso la base forata dell&#39;inserto vasca in cui i pesci adulti sono detenuti. </li><li> Optional:. Per la riproduzione temporizzata, (come sarebbe necessario per gli studi che coinvolgono morfolino iniezione), separare il maschio e pesce femmina da un chiaro divisorio in plastica, Rimuovi questa mattina di provocare temporizzato deposizione delle uova e la fecondazione. Per morpholino studi, eseguire calcoli di potenza per valutare il numero di pesci embrionale necessaria per il trattamento. Senza una stima della dimensione dell&#39;effetto o variazione, una prova preliminare può essere eseguito con un n = 8. </li></ol></li><li> Versare le uova da gabbia traversata in una capsula di Petri (100 - 150 embrioni / 10 centimetri di Petri). Lasciare le uova di depositarsi sul fondo del piatto e versare l&#39;acqua. Rimuovere eventuale acqua residua con una punta fine trasferimento monouso pipetta. Aggiungere indietro medio E3 embrione fatto in fase 1.1. </li><li> Fai afzoppo pipetta monouso lucido per il futuro di uova e il trasferimento del pesce. Utilizzando le forbici, tagliare una pipetta di trasferimento monouso diplomato al diploma 0,25 ml. Per rimuovere i bordi irregolari, polacco fiamma la punta taglio sopra un becco Bunsen. </li><li> Mantenere pesce embrionale a 4 giorni dopo la fecondazione (DPF) di 10 cm capsule di Petri in zebrafish media E3 embrione a 28,5 ○ C. Due volte al giorno, utilizzare fiamme lucido laureato monouso pipetta di trasferimento per rimuovere eventuali uova non fecondate o embrioni morti (aspetto bianco opaco). Una volta al giorno, sostituire E3 medio embrione. Eliminare E3 medio embrione, rimuovere il liquido restante con una punta fine trasferimento monouso pipetta e aggiungere di nuovo pre-riscaldato (28,5 ○ C) E3 medio embrione. </li></ol> 2. Preparare Assay Solution <ol><li> Preparare la soluzione test secondo la Tabella 1. Soluzione saggio Filtro sterile utilizzando un filtro da 0,22 micron. Prima del dosaggio iniziazione, scaldare la soluzione test sterile in una 28,5 ○ Cbagnomaria. </li></ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Ingrediente </td><td> % Del totale </td><td> Volume (ml / 10 ml) </td></tr><tr><td> 60x E3 Embrione Media </td><td> 1.667 </td><td> 166,7 </td></tr><tr><td> Doppia deionizzata (DDI) H 2 0 </td><td> 96,233 </td><td> 9.623,3 </td></tr><tr><td> Alamar blu </td><td> 1 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> NaOH 400 mm </td><td> 1 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> 0.1 </td><td> 10 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Assay Media 3. Eseguire Assay <ol><li> Sciacquare embrioni di zebrafish 3 volte con sterile filtrata medio embrione E3. Unire tutti gli embrioni vitali zebrafish dalla frizione in un bicchiere. Filtro sterile da 75 ml E3 medio embrione. Utilizzando una punta fine trasferimento monouso pipetta, rispostare tanto del mezzo embrione E3 dagli embrioni zebrafish possibile. Aggiungere 20 ml di nuovo sterile filtrata medio embrione E3. Rimuovere e sostituire E3 medio embrione 3 volte. </li><li> Tavola 1 pesce in ciascuno dei 93 pozzetti di una nera 96 ​​pozzetti lati chiara piatto fondo. Trasferire il pesce embrionale alla piastra catturando individualmente un embrione all&#39;interno di una fiamma lucido laureato plastica pipetta usa e getta (punto 1.5) e l&#39;espulsione delicatamente nel pozzo. Trasferire E3 embrione medio tratto dal bicchiere contenente pesce risciacquati nei 3 pozzetti del bianco. Questo assicura che i pozzi vuoti sono stati esposti per la stessa acqua dei pozzi che contengono pesci. Entrambi i pozzetti che contengono pesce e pozzetti vuoti devono essere almeno a metà (200 microlitri) al termine di questa fase. </li><li> Sostituire E3 medio embrione con la soluzione di test in tutti i 96 pozzi, tra cui pozzetti del bianco. Questa operazione deve essere eseguita 1 colonna alla volta per ciascuna delle 12 colonne in una piastra da 96 pozzetti. Utilizzando una punta fine e getta transfer pipetta, rimuovere E3 medio embrione da ciascun pozzetto in una colonna della piastra (8 pozzetti). Fare attenzione a non toccare l&#39;embrione zebrafish. Aggiungere 300 ml di soluzione di dosaggio per ciascun pozzetto da cui l&#39;acqua è stata rimossa. Ripetere la rimozione di E3 medio embrione e sostituzione con la soluzione test per tutte le colonne 12 della piastra. </li><li> Opzionale: Per testare il cambiamento di tasso metabolico in risposta ad un composto, fare una soluzione che è 100 volte (100x) la concentrazione trattamento desiderato. Di nota, assicurarsi che la soluzione 100x non supera il 10% DMSO a limitare la concentrazione finale di DMSO a non più di 0,1%. Aggiungere 3 ml di soluzione 100x a ciascuno dei pozzetti di trattamento. NOTA: eseguire calcoli di potenza per valutare il numero di pozzi di trattamento. Tuttavia, senza una stima della entità della risposta o variazione, una prova preliminare può essere eseguito in 8 compound trattata e 8 veicoli trattati pozzetti di controllo contenenti pesci. <ol><li> Aggiungere 3 ml di controllo del veicolo al controllo (senza drug trattamento) pozzi che contengono pesci. Per assicurare che la risposta fluorescente composto è un risultato di azioni ai pesci, applicare trattamenti farmacologici e veicoli a 3 pozzetti di bianco in una piastra da 96 pozzetti. </li></ol></li><li> Leggi pesce piatto pieno su lettore fluorescente piatto con lunghezza d&#39;onda di eccitazione a 530 nm e lunghezza d&#39;onda di emissione a 590 nm. </li><li> Posizionare la piastra in incubatore umidificato impostata a 28,5 ○ C (mantenere piastra al buio per tutta test per evitare photobleaching di soluzione test). Il saggio può essere eseguito per periodi di tempo che vanno da 1 ora a 24 ore. La durata del saggio dipende dallo scopo dello studio. Per testare la risposta ad una breve composto non stabile recitazione breve durata può essere più adatto. Tuttavia, per le prove di composti stabili o test di effetti genetici, massimizzando durata saggio è preferibile sfruttare i vantaggi connessi con il segnale cumulativo. </li><li> In un punto tempo predeterminato (vedere la fase 3.6 per aiutare a determinare i tempi)leggere la fluorescenza di piatto di pesce pieno di nuovo con le stesse impostazioni di passo 3.5. </li></ol> 4. Valutare la variazione relativa a fluorescenza associata al trattamento con <ol><li> Calcolare variazione di fluorescenza di ciascun pozzetto sottraendo la fluorescenza al tempo 0 dal fluorescenza al termine dello studio. Wells senza pesce (spazi) devono avere valori prossimi a 0, ben al di sotto dei valori da pozzi che contengono pesci. Cambia in Fluorescenza = Fluorescenza a conclusione - Fluorescenza al tempo 0 </li><li> Per accertare la variazione relativa di fluorescenza, calcolare la variazione media della fluorescenza per pozzetti di controllo poi dividono la variazione di fluorescenza di ciascun bene dal variazione media di fluorescenza dei pozzetti di controllo. Da segnalare, i controlli potrebbero essere sia comandi del veicolo o controlli genetici. <img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/53297/53297eq1.jpg" /></li></ol>

<ol><li>Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+multiplex+biallelic+zebrafish+genome+editing+using+a+CRISPR+nuclease+system%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system.</a> PNAS. 110, 13904-13909 (2013).</li>
<li>Kimura, Y., Hisano, Y., Kawahara, A., Higashijima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+knock-in+transgenic+zebrafish+carrying+reporter%2Fdriver+genes+by+CRISPR%2FCas9-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of knock-in transgenic zebrafish carrying reporter/driver genes by CRISPR/Cas9-mediated genome engineering.</a> Sci. Rep. 4, 6545(2014).</li>
<li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+human+disease%3A+zebrafish+swim+into+view%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).</li>
<li>Brand, M. D., Couture, P., Else, P. L., Withers, K. W., Hulbert, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+energy+metabolism.+Proton+permeability+of+the+inner+membrane+of+liver+mitochondria+is+greater+in+a+mammal+than+in+a+reptile%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Evolution of energy metabolism. Proton permeability of the inner membrane of liver mitochondria is greater in a mammal than in a reptile.</a> Biochem. J. 275 (Pt 1), 81-86 (1991).</li>
<li>Renquist, B. J., Zhang, C., Williams, S. Y., Cone, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+assay+for+high-throughput+energy+expenditure+monitoring+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Development of an assay for high-throughput energy expenditure monitoring in the zebrafish.</a> Zebrafish. 10, 343-352 (2013).</li>
<li>Livingston, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+volumetric+respirometer+for+long-term+studies+of+small+aquatic+animals%5BTitle%5D)+AND+%22J.Mar.+Biol.+Assoc.+U.K%22%5BJournal%5D)">A volumetric respirometer for long-term studies of small aquatic animals.</a> J.Mar. Biol. Assoc. U.K. 48, 485-497 (1968).</li>
<li>Makky, K., Duvnjak, P., Pramanik, K., Ramchandran, R., Mayer, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+whole-animal+microplate+assay+for+metabolic+rate+using+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">A whole-animal microplate assay for metabolic rate using zebrafish.</a> J. Biomol. Screen. 13, 960-967 (2008).</li>
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<li>Maddison, L. A., Joest, K. E., Kammeyer, R. M., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+insulin+resistance+in+zebrafish+induces+alterations+in+beta-cell+number+and+glucose+tolerance+in+an+age+and+diet+dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+physiol.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle insulin resistance in zebrafish induces alterations in beta-cell number and glucose tolerance in an age and diet dependent manner.</a> Am. J. physiol. Endocrinol. , (2015).</li>
<li>Flynn, E. J. 3rd, Trent , C. M., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+and+nutritional+control+of+adipogenesis+in+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+lipid+res%22%5BJournal%5D)">Ontogeny and nutritional control of adipogenesis in zebrafish (Danio rerio).</a> J. lipid res. 50, 1641-1652 (2009).</li>
<li>Shimada, Y., Hirano, M., Nishimura, Y., Tanaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+fluorescence-based+assay+system+for+appetite-regulating+gene+and+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">A high-throughput fluorescence-based assay system for appetite-regulating gene and drug screening.</a> PloS one. 7, e52549(2012).</li>
<li>Tingaud-Sequeira, A., Ouadah, N., Babin, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+obesogenic+test%3A+a+tool+for+screening+molecules+that+target+adiposity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+lipid+res%22%5BJournal%5D)">Zebrafish obesogenic test: a tool for screening molecules that target adiposity.</a> J. lipid res. 52, 1765-1772 (2011).</li>
</ol>

Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti da rivelare.

La contaminazione con batteri o funghi limiterà notevolmente l&#39;applicazione di questo test. Il blu di metilene in mezzo embrione E3 limita la possibilità di contaminazione fungina. Nel corso embrione rialzando è fondamentale che la cura è presa per eliminare l&#39;embrione è morto due volte al giorno. Inoltre, è essenziale risciacquare abbondantemente gli embrioni con E3 sterile medio embrione del giorno di dosaggio iniziazione. Questi 2 passaggi limitano il potenziale di contaminazione batterica degli embrioni. L&#...

Il mouse è attualmente il modello predominante per la ricerca di obesità. L&#39;intervallo breve generazione e strumenti genetiche disponibili nel topo sono stati fino ad oggi senza pari. Tuttavia, il pesce zebra ha anche un intervallo di generazione breve (3 - 4 mesi) e supera anche il mouse in facilità di manipolazione genetica 1,2. Il pesce zebra mantiene quasi il 90% dei geni dei mammiferi, mentre di gran lunga superiore il mouse in numero di figli e il potenziale per l&#39;uso in schermi genetici e droga 3. Per sfruttare il potenziale del modello di zebrafish per gli studi in obesità, le analisi devono essere sviluppati per indagare i fattori che influenzano il corpo regolazione del peso, comprese le spese di energia. Come metaboliti vengono elaborati tramite β-ossidazione e l&#39;ossigeno ciclo degli acidi tricarbossilici viene consumato e NADH 2 viene prodotto. Così, NADH 2 è un indicatore diretto del flusso di metaboliti attraverso vie metaboliche (metabolita ossidazione). In poikilotherms, H + perdite attraverso la membrana mitocondriale interna, che disaccoppia NADH 2 ossidazione dalla sintesi di ATP, è 4 - 5 volte inferiore negli esseri omeotermi 4. Di conseguenza, in NADH zebrafish 2 è molto strettamente legata alla produzione di ATP attraverso la fosforilazione ossidativa. Qui, descriviamo un metodo che misura NADH 2 produzione nel zebrafish larvale come proxy per dispendio energetico 5. Il consumo di ossigeno è il gold standard per la misurazione della spesa energetica. Tuttavia, per sfruttare al meglio l&#39;elevato potenziale rendimento del zebrafish, saggi di dispendio energetico devono essere suscettibili di high-throughput. Sistemi di consumo di ossigeno che dipendono da una camera chiusa sistema di circolazione sono limitati nella velocità per il numero di camere disponibili 6. Open air consumo di O 2 / CO 2 test di produzione è stato applicato anche nel zebrafish 5,7. Questi all&#39;aperto 96 pozzetti piastra di basesistemi d sono suscettibili di throughput elevato. Sfortunatamente, lo scambio di gas con l&#39;ambiente limita sensibilità di questi test. Abbiamo recentemente pubblicato l&#39;applicazione di un metodo che monitora NADH 2 utilizzando l&#39;indicatore redox alamarBlue 5. Questo saggio supera i limiti di produttività e sensibilità comune per analisi di consumo di ossigeno in zebrafish. Il pesce zebra sta diventando un modello sempre più importante per gli studi di tutto omeostasi energia del corpo. In parte, perché zebrafish sono suscettibili di utilizzare schermi genetici avanti e schermi di droga. Inoltre, mirata manipolazione genetica, tra cui knockdown e knock-in, può essere applicato rapidamente. Abbiamo precedentemente dimostrato che questo test può essere combinato con l&#39;applicazione di droga bagno e atterramento genetica o knockout per identificare i composti e geni che alterano il tasso metabolico 5. Inoltre, questo test è stato progettato per sfruttare i vantaggi di throughput elevati inerenti il ​​pesce zebra. </p&gt;

<table><tbody><tr><td>AlamarBlue</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-230-103</td><td>Prodotto da Thermo Scientific</td></tr><tr><td>Pipetta di trasferimento monouso con punta fine</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-26</td><td>Prodotto da Thermo Scientific</td></tr><tr><td>Fisherbrand Pipetta di trasferimento monouso graduata</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-771-9AM</td><td>Prodotto da Thermo Scientific</td></tr><tr><td>Piastre a 96 pozzetti con fondo trasparente con lati neri</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-320-785</td><td>Prodotto da E& K Prodotti Scientifici Inc.</td></tr></tbody></table>

high throughput<em&gt; danio rerio</em&gt; energia spese assay

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish sono un importante organismo modello con vantaggi inerenti che hanno il potenziale per fare zebrafish un modello ampiamente utilizzato per lo studio della omeostasi energetica e obesità. Le piccole dimensioni di zebrafish permette di saggi sugli embrioni da condurre in un formato piatto 96- o 384 pozzetti, tecnologie Morpholino e CRISPR basate promuovere la facilità di manipolazione genetica, e il trattamento farmacologico per applicazione bagno è praticabile. Inoltre, zebrafish sono ideali per schermi genetici a termine che consentono di scoperta del gene romanzo. Data la relativa novità di zebrafish come modello per l&#39;obesità, è necessario sviluppare strumenti che sfruttino appieno questi benefici. Qui, si descrive un metodo per misurare il dispendio energetico in migliaia di zebrafish embrioni contemporaneamente. Abbiamo sviluppato una piattaforma completamente microplacca animale in cui usiamo piastre a 96 pozzetti per isolare singoli pesci e noi valutare cumulativo NADH 2 produzione utilizzando il disponibile in commercio coltura cellulare vitalità reagente alamarBlue. Nel poichilotermi il rapporto tra NADH 2 produzione e la spesa energetica è strettamente legata. Questo test dispendio energetico crea il potenziale per lo screening rapido manipolazioni farmacologiche o genetiche che alterano direttamente la spesa energetica o alterano la risposta ad un farmaco applicato (ad esempio sensibilizzatori dell&#39;insulina).

Soluzione Assay non aumenta la fluorescenza in assenza di pesci embrionali (Figura 1). Tuttavia, l&#39;analisi è molto sensibile a piccole variazioni del tasso metabolico nel pozzo. Un singolo pesce entro un ben crea un segnale significativamente diverso da pozzetti bianchi entro 1 ora (p &lt;0,0001). La Figura 2 fornisce una rappresentazione visiva dei segnali generati dai pesci embrionale dopo 24 ore di incubazione. Ai fini di questa immagine sono stati utilizzati chi...

I pesci zebra sono un importante organismo modello per lo studio dell'omeostasi energetica. Utilizzando un indicatore redox sensibile al NADH2, alamar Blue, abbiamo sviluppato un test che misura il tasso metabolico delle larve di zebrafish in un formato di piastra a 96 pozzetti e può essere applicato alla scoperta di farmaci o geni.

High Throughput<em&gt; Danio Rerio</em&gt; Energia spese Assay

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of ...

L'obiettivo generale di questo saggio fluorometrico ad alto rendimento basato sul resazurin è monitorare l'effetto di manipolazioni genetiche o farmacologiche sulla produzione di NADH2, un parametro indicativo della velocità metabolica. Questo metodo può aiutarci a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'obesità, come l'effetto di un determinato farmaco o gene sulla velocità metabolica. Inoltre, questo saggio può essere impiegato per individuare possibili interazioni tra farmaco-farmaco o farmaco-gene in un sistema animale completo.Il vantaggio principale di questo saggio, rispetto ai saggi di consumo di ossigeno, è l'elevata produttività e l'accumulo del segnale nel tempo, che consente all'utente di rilevare piccole differenze nel tasso metabolico. A dimostrare questa procedura sarà Caroline Foy, studentessa laureata nel mio laboratorio. Dopo aver preparato una soluzione madre di mezzo E3 60X seguendo il protocollo indicato nel testo, preparare il mezzo E3 1X diluendo 16,5 millilitri di soluzione madre con un litro di acqua doppio distillata.Quindi aggiungere 100 microlitri di blu di metilene al 1%. Per preparare una pipetta monouso con punta lucidata alla fiamma per il trasferimento di uova e pesci, utilizzare delle forbici per tagliare una pipetta graduata monouso al segno di 0,25 millilitri. Successivamente, per rimuovere i bordi irregolari, utilizzare un becco Bunsen per lucidare alla fiamma la punta tagliata.Dopo aver allestito gli incroci di zebrafish e raccolto le uova, lasciare che le uova si depositino sul fondo della piastra e versare via l'acqua. Utilizzare una pipetta di trasferimento monouso con punta fine per rimuovere l'acqua rimanente. Quindi aggiungere nuovamente il mezzo E3.Incubare i pesci embrionali a 28,5 gradi Celsius fino a quattro giorni dopo la fecondazione, o DPF. Due volte al giorno utilizzare una pipetta monouso graduata flame-polished per rimuovere le uova non fecondate o gli embrioni morti. Quindi, una volta al giorno, versare via il mezzo E3.Utilizzare una pipetta di trasferimento a punta fine per rimuovere il mezzo residuo e sostituirlo con E3 fresco preriscaldato a 28,5 gradi Celsius. Per eseguire il saggio del dispendio energetico, preparare la soluzione di saggio seguendo questa tabella. Filtrare e sterilizzare la soluzione attraverso un filtro da 0,22 micrometri e riscaldarla a 28,5 gradi Celsius in un bagno termico per il saggio.In una piastra di Petri, unire tutti gli embrioni vitali di pesce zebra del covata. Dopo aver sterilizzato mediante filtro 75 millilitri di mezzo E3, utilizzare una pipetta monouso a punta fine per rimuovere dalla piastra di Petri la maggior quantità possibile di mezzo E3. Aggiungere nuovamente 20 millilitri di E3 sterile. Quindi rimuovere e sostituire il mezzo E3 sterile altre due volte.Successivamente, utilizzando una pipetta monouso in plastica graduata con estremit&agrave; levigata alla fiamma, trasferire singoli pesci embrionali nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti. Lavorando una colonna della piastra alla volta, rimuovere il mezzo E3 dagli otto pozzetti della prima colonna, avendo cura di non toccare gli embrioni con la pipetta di trasferimento. Quindi aggiungere 300 microlitri di soluzione per il saggio in ciascun pozzetto.Ripetere con tutte e 12 le colonne della piastra. Per includere un trattamento farmacologico, dopo aver preparato una soluzione 100X del composto desiderato, aggiungere tre microlitri in ciascun pozzetto del trattamento. Quindi aggiungere tre microlitri di controllo del veicolo nei pozzetti di controllo dei pesci.Per assicurarsi che la risposta fluorescente al composto sia il risultato di un'attività all'interno del pesce, preparare trattamenti con il farmaco e con il veicolo in tre pozzetti vuoti ciascuno su una piastra a 96 pozzetti. Ora, utilizzando un lettore di fluorescenza per piastre, con lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione rispettivamente di 530 nanometri e 590 nanometri, leggere i pozzetti della piastra contenente i pesci. Posizionare la piastra in un incubatore umidificato a 28,5 gradi Celsius.In base al saggio e alla stabilità del composto in esame, rileggere la fluorescenza in un punto temporale predeterminato. Per valutare la variazione relativa della fluorescenza, calcolare la variazione media della fluorescenza nei pozzetti di controllo. Successivamente, dividere la variazione di fluorescenza di ciascun pozzetto per la variazione media di fluorescenza dei pozzetti di controllo.Di seguito è riportato un esempio di utilizzo di due colonne di una piastra a 96 pozzetti. I pozzetti della colonna A contengono zebrafish trattati con veicolo (controllo), mentre i pozzetti della colonna B contengono zebrafish trattati con insulina. Nella tabella A sono riportati i valori di fluorescenza misurati al tempo zero.La tabella B contiene la fluorescenza misurata 24 ore dopo. Nella tabella C, la fluorescenza al tempo zero è stata sottratta dalla fluorescenza a 24 ore per valutare la variazione della fluorescenza. Successivamente, calcolare la variazione media della fluorescenza nei pozzetti di controllo.La Tabella D mostra la variazione della fluorescenza di ciascun pozzetto singolo, divisa per la variazione media nei pozzetti di controllo. Si può osservare che il trattamento con insulina a 10 micromolar ha provocato un aumento di 2,77 volte del segnale generato dai pesci zebra nel corso di 24 ore, con un valore P inferiore a 0,0001. Come mostrato qui, la soluzione del saggio non cambia colore né i livelli assoluti di fluorescenza in assenza di embrioni.Tuttavia, il saggio è altamente sensibile a piccole variazioni del tasso metabolico all'interno della pozzetta. Questa figura rappresenta i segnali generati da tilapie embrionali dopo un'incubazione di 24 ore. Le pozzette rosa indicano pesci con un elevato tasso metabolico.I pozzetti viola contengono pesci con tassi metabolici moderati, mentre i pozzetti blu rappresentano un basso tasso metabolico. Questo mostra anche la versatilità di questo saggio e della sua applicazione tra specie di teleostei. Poiché la riduzione dell'alamar blue indotta da NADH2 è irreversibile, il segnale si accumula nel tempo, consentendo l'amplificazione di piccole variazioni.Qui viene mostrata la variazione relativa della fluorescenza indotta da uno a cinque pesci a un'ora, due ore e quattro ore. Con ogni aumento del numero di pesci, la variazione relativa della fluorescenza aumenta significativamente nel tempo, e maggiore è il numero di pesci, maggiore è l'entità della variazione della fluorescenza nel tempo. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita su fino a 5.000 pesci embrionali al giorno.Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di prestare attenzione per evitare di danneggiare i pesci embrionali. Dopo aver eseguito questo saggio, è possibile effettuare altre procedure, come la misurazione con rosso Nilo dei lipidi neutri o la valutazione della spinta fagica mediante l'assunzione di paramici etichettati con fluorassay. Ciò ci consente di confrontare la relazione tra la velocità metabolica e il metabolismo dei lipidi, oppure tra la velocità metabolica e la spinta fagica.Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo del metabolismo energetico e delle malattie metaboliche per studiare il dispendio energetico nel pesce zebra senza limitazioni nella capacità di analisi. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come utilizzare il reagente fluorometrico resazurina per misurare la produzione di NADH2 nel pesce zebra.

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