High Throughput Danio Rerio Energia spese Assay

L'obiettivo generale di questo test fluorimetrico basato sulla resazurina ad alto rendimento è quello di monitorare l'effetto di manipolazioni genetiche o farmacologiche sulla produzione di NADH2, che è una misura del tasso metabolico. Questo metodo può aiutarci a rispondere a domande chiave nel campo dell'obesità, come l'effetto di un determinato farmaco o gene sul tasso metabolico. Inoltre, questo test può essere applicato per lo screening di potenziali interazioni farmaco-farmaco o farmaco-gene in un intero sistema animale.

Il vantaggio principale di questo test, rispetto ai saggi sul consumo di ossigeno, è l'elevata produttività e l'accumulo di segnale nel tempo, che consente all'utente di rilevare piccole differenze nel tasso metabolico. A dimostrare questa procedura sarà Caroline Foy, una studentessa laureata nel mio laboratorio. Dopo aver preparato una soluzione madre 60X di terreno E3 secondo il protocollo di testo, preparare 1X terreno E3 diluendo 16,5 millilitri di brodo e un litro di acqua doppia distillata.

Quindi aggiungere 100 microlitri di blu di metilene all'1%. Per realizzare una pipetta monouso lucidante a fiamma per il trasferimento di uova e pesci, utilizzare le forbici per tagliare una pipetta di trasferimento monouso graduata alla graduazione di 0,25 millilitri. Quindi, per rimuovere i bordi ruvidi, utilizzare un bruciatore Bunsen per lucidare a fiamma la punta tagliata.

Dopo aver allestito gli incroci con il pesce zebra e raccolto le uova, lascia che le uova si depositino sul fondo del piatto e versa l'acqua. Utilizzare una pipetta di trasferimento monouso a punta fine per rimuovere l'acqua residua. Quindi aggiungere nuovamente l'E3 medio.

Incubare il pesce embrionale a 28,5 gradi Celsius a quattro giorni dopo la fecondazione, o DPF. Due volte al giorno utilizzare una pipetta di trasferimento monouso graduata lucidata a fiamma per rimuovere eventuali ovuli non fecondati o embrioni morti. Quindi, una volta al giorno, versare il mezzo E3.

Utilizzare una pipetta di trasferimento a punta fine per rimuovere il terreno rimanente e sostituirla con E3 fresco preriscaldato a 28,5 gradi Celsius. Per eseguire il saggio del dispendio energetico, preparare la soluzione del saggio, seguendo questa tabella. Utilizzare un filtro da 0,22 micrometri per filtrare, sterilizzare la soluzione e scaldare a 28,5 gradi Celsius in un bagno d'acqua per il saggio.

In una capsula di Petri, unire tutti gli embrioni vitali di pesce zebra dalla covata. Dopo aver sterilizzato con filtro 75 millilitri di terreno E3, utilizzare una pipetta di trasferimento monouso a punta fine per rimuovere la maggior quantità possibile di terreno E3 dalla capsula di Petri. Aggiungere 20 millilitri di E3 sterile. Quindi rimuovere e sostituire l'E3 sterile altre due volte.

Successivamente, utilizzando una pipetta di trasferimento monouso in plastica graduata lucidata a fiamma, trasferire i singoli pesci embrionali nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti. Lavorando con una colonna della piastra alla volta, rimuovere il terreno E3 dagli otto pozzetti della prima colonna, facendo attenzione a non toccare gli embrioni con la pipetta di trasferimento. Quindi aggiungere 300 microlitri di soluzione di analisi a ciascun pozzetto.

Ripetere con tutte le 12 colonne del piatto. Per includere un trattamento farmacologico, dopo aver preparato una soluzione 100X del composto desiderato, aggiungere tre microlitri a ciascuno dei pozzetti di trattamento. Quindi aggiungere tre microlitri di controllo del veicolo ai pozzetti di controllo dei pesci.

Per garantire che la risposta di fluorescenza al composto sia il risultato dell'attività all'interno dei pesci, impostare trattamenti farmacologici e con veicoli su tre pozzetti vuoti ciascuno in una piastra da 96 pozzetti. Ora, utilizzando un lettore di piastre a fluorescenza, con lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione rispettivamente di 530 nanometri e 590 nanometri, leggere i pozzetti della piastra di pesce. Mettere la piastra in un'incubatrice umidificata a 28,5 gradi Celsius.

A seconda del test e della stabilità del composto da testare, leggere nuovamente la fluorescenza in un momento predeterminato. Per valutare la variazione relativa della fluorescenza, calcolare la variazione media della fluorescenza per i pozzetti di controllo. Quindi dividere la variazione della fluorescenza di ciascun pozzetto per la variazione media della fluorescenza dei pozzetti di controllo.

Ecco un esempio di utilizzo di due colonne di una piastra a 96 pozzetti. I pozzetti della colonna A includono zebrafish di controllo trattati con veicolo, mentre i pozzetti della colonna B includono zebrafish trattati con insulina. Nella tabella A è mostrata la fluorescenza misurata al tempo zero.

La tabella B contiene la fluorescenza misurata 24 ore dopo. Nella tabella C, la fluorescenza al tempo zero è stata sottratta dalla fluorescenza a 24 ore per valutare la variazione della fluorescenza. Successivamente, calcola la variazione media della fluorescenza nei pozzetti di controllo.

La tabella D è la variazione della fluorescenza di ogni singolo pozzetto, divisa per la variazione media dei pozzetti di controllo. Si può vedere qui che il trattamento insulinico a 10 micromolari ha causato un aumento di 2,77 volte del segnale generato dal pesce zebra nell'arco di 24 ore con un valore P inferiore a 0,0001. Come si vede qui, la soluzione del saggio non cambia il colore o i livelli di fluorescenza assoluti in assenza di embrioni.

Tuttavia, il test è altamente sensibile a piccole variazioni del tasso metabolico all'interno del pozzo. Questa cifra rappresenta i segnali generati dalla tilapia embrionale dopo un'incubazione di 24 ore. I pozzi rosa sono indicativi di pesci con un alto tasso metabolico.

I pozzi viola contengono pesci con tassi metabolici moderati e i pozzi blu rappresentano un basso tasso metabolico. Ciò dimostra anche la versatilità di questo test e l'applicazione in tutte le specie di teleostei. Poiché la riduzione indotta dal NADH2 del blu di alamar non è reversibile, il segnale si accumula con il tempo, il che consente di amplificare piccoli cambiamenti.

Qui è mostrato il cambiamento relativo della fluorescenza indotta da uno a cinque pesci a una, due e quattro ore. Con ogni aumento del numero di pesci, la variazione relativa della fluorescenza aumenta significativamente con il tempo, e maggiore è il numero di pesci, maggiore è l'entità della variazione di fluorescenza nel tempo. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita su un massimo di 5.000 pesci embrionali al giorno.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di fare attenzione per evitare di ferire il pesce embrionale. Dopo aver eseguito questo test, è possibile eseguire altre procedure come la misurazione del rosso Nilo dei lipidi neutri o la misurazione dell'impulso fagico attraverso l'assunzione di paramecio marcato con fluorassay. Questo ci permette di confrontare la relazione tra tasso metabolico e metabolismo lipidico, o tasso metabolico e pulsione fagica.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo del metabolismo energetico e delle malattie metaboliche per studiare il dispendio energetico nel pesce zebra senza limitazioni nella produttività. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare il reagente fluorimetrico resazurina per misurare la produzione di NADH2 nel pesce zebra.