Name: High Throughput Danio Rerio Energia spese Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-27T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Scopri un saggio fluorometrico ad alto rendimento per misurare la produzione di NADH2 e il tasso metabolico in larve di Danio rerio. Questo metodo consente lo screening di farmaci e geni per studi sull'omeostasi energetica.

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Gli autori desiderano ringraziare i dottori Roger Cone e Chao Zhang per i loro contributi alla convalida dell'applicazione di questo test come precedentemente pubblicato. Questo lavoro è stato supportato da NIH 1F32DK082167-01 (BJR).

Nota: Questo protocollo segue le linee guida della University of Arizona Ufficio per una gestione responsabile della Ricerca ed è stato approvato dalla cura degli animali e del Comitato Usa Istituzionale 1. Allevamento Zebrafish e Embryo manutenzione <ol><li> Preparare E3 embrione media 8. Fare 60x soluzione madre, sciogliere 34,8 g di NaCl, 1,6 g KCl, 5.8g CaCl 2 ● 2H 2 O, e 9,78 g MgCl 2 ● 6H 2 O a 1,95 L ddiH 2 O. Regolare il pH a 7,2 con NaOH e HCl Regolare il volume a 2 L utilizzando ddiH 2 O. </li><li> Per preparare 1x E3 medio embrione, diluire 16,5 ml 60x magazzino in 1 L ddiH20. Aggiungere 100 ml 1% di blu di metilene. </li><li> Allevamento <ol><li> Casa Maschio e femmina nidiata magazzino (7 - 18 mesi di età) separatamente per massimizzare la fecondità. </li><li> Spegnere le luci 1-2 ore prima del giorno precedente uova sono desiderati. Impostare l&#39;accoppiamento (1 maschio e 1 - 2 femmine) in cgabbie Rossing come precedentemente descritto 9. Gabbie Crossing consentono per le uova di sfuggire predazione che passano attraverso la base forata dell&#39;inserto vasca in cui i pesci adulti sono detenuti. </li><li> Optional:. Per la riproduzione temporizzata, (come sarebbe necessario per gli studi che coinvolgono morfolino iniezione), separare il maschio e pesce femmina da un chiaro divisorio in plastica, Rimuovi questa mattina di provocare temporizzato deposizione delle uova e la fecondazione. Per morpholino studi, eseguire calcoli di potenza per valutare il numero di pesci embrionale necessaria per il trattamento. Senza una stima della dimensione dell&#39;effetto o variazione, una prova preliminare può essere eseguito con un n = 8. </li></ol></li><li> Versare le uova da gabbia traversata in una capsula di Petri (100 - 150 embrioni / 10 centimetri di Petri). Lasciare le uova di depositarsi sul fondo del piatto e versare l&#39;acqua. Rimuovere eventuale acqua residua con una punta fine trasferimento monouso pipetta. Aggiungere indietro medio E3 embrione fatto in fase 1.1. </li><li> Fai afzoppo pipetta monouso lucido per il futuro di uova e il trasferimento del pesce. Utilizzando le forbici, tagliare una pipetta di trasferimento monouso diplomato al diploma 0,25 ml. Per rimuovere i bordi irregolari, polacco fiamma la punta taglio sopra un becco Bunsen. </li><li> Mantenere pesce embrionale a 4 giorni dopo la fecondazione (DPF) di 10 cm capsule di Petri in zebrafish media E3 embrione a 28,5 ○ C. Due volte al giorno, utilizzare fiamme lucido laureato monouso pipetta di trasferimento per rimuovere eventuali uova non fecondate o embrioni morti (aspetto bianco opaco). Una volta al giorno, sostituire E3 medio embrione. Eliminare E3 medio embrione, rimuovere il liquido restante con una punta fine trasferimento monouso pipetta e aggiungere di nuovo pre-riscaldato (28,5 ○ C) E3 medio embrione. </li></ol> 2. Preparare Assay Solution <ol><li> Preparare la soluzione test secondo la Tabella 1. Soluzione saggio Filtro sterile utilizzando un filtro da 0,22 micron. Prima del dosaggio iniziazione, scaldare la soluzione test sterile in una 28,5 ○ Cbagnomaria. </li></ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Ingrediente </td><td> % Del totale </td><td> Volume (ml / 10 ml) </td></tr><tr><td> 60x E3 Embrione Media </td><td> 1.667 </td><td> 166,7 </td></tr><tr><td> Doppia deionizzata (DDI) H 2 0 </td><td> 96,233 </td><td> 9.623,3 </td></tr><tr><td> Alamar blu </td><td> 1 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> NaOH 400 mm </td><td> 1 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> 0.1 </td><td> 10 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Assay Media 3. Eseguire Assay <ol><li> Sciacquare embrioni di zebrafish 3 volte con sterile filtrata medio embrione E3. Unire tutti gli embrioni vitali zebrafish dalla frizione in un bicchiere. Filtro sterile da 75 ml E3 medio embrione. Utilizzando una punta fine trasferimento monouso pipetta, rispostare tanto del mezzo embrione E3 dagli embrioni zebrafish possibile. Aggiungere 20 ml di nuovo sterile filtrata medio embrione E3. Rimuovere e sostituire E3 medio embrione 3 volte. </li><li> Tavola 1 pesce in ciascuno dei 93 pozzetti di una nera 96 ​​pozzetti lati chiara piatto fondo. Trasferire il pesce embrionale alla piastra catturando individualmente un embrione all&#39;interno di una fiamma lucido laureato plastica pipetta usa e getta (punto 1.5) e l&#39;espulsione delicatamente nel pozzo. Trasferire E3 embrione medio tratto dal bicchiere contenente pesce risciacquati nei 3 pozzetti del bianco. Questo assicura che i pozzi vuoti sono stati esposti per la stessa acqua dei pozzi che contengono pesci. Entrambi i pozzetti che contengono pesce e pozzetti vuoti devono essere almeno a metà (200 microlitri) al termine di questa fase. </li><li> Sostituire E3 medio embrione con la soluzione di test in tutti i 96 pozzi, tra cui pozzetti del bianco. Questa operazione deve essere eseguita 1 colonna alla volta per ciascuna delle 12 colonne in una piastra da 96 pozzetti. Utilizzando una punta fine e getta transfer pipetta, rimuovere E3 medio embrione da ciascun pozzetto in una colonna della piastra (8 pozzetti). Fare attenzione a non toccare l&#39;embrione zebrafish. Aggiungere 300 ml di soluzione di dosaggio per ciascun pozzetto da cui l&#39;acqua è stata rimossa. Ripetere la rimozione di E3 medio embrione e sostituzione con la soluzione test per tutte le colonne 12 della piastra. </li><li> Opzionale: Per testare il cambiamento di tasso metabolico in risposta ad un composto, fare una soluzione che è 100 volte (100x) la concentrazione trattamento desiderato. Di nota, assicurarsi che la soluzione 100x non supera il 10% DMSO a limitare la concentrazione finale di DMSO a non più di 0,1%. Aggiungere 3 ml di soluzione 100x a ciascuno dei pozzetti di trattamento. NOTA: eseguire calcoli di potenza per valutare il numero di pozzi di trattamento. Tuttavia, senza una stima della entità della risposta o variazione, una prova preliminare può essere eseguito in 8 compound trattata e 8 veicoli trattati pozzetti di controllo contenenti pesci. <ol><li> Aggiungere 3 ml di controllo del veicolo al controllo (senza drug trattamento) pozzi che contengono pesci. Per assicurare che la risposta fluorescente composto è un risultato di azioni ai pesci, applicare trattamenti farmacologici e veicoli a 3 pozzetti di bianco in una piastra da 96 pozzetti. </li></ol></li><li> Leggi pesce piatto pieno su lettore fluorescente piatto con lunghezza d&#39;onda di eccitazione a 530 nm e lunghezza d&#39;onda di emissione a 590 nm. </li><li> Posizionare la piastra in incubatore umidificato impostata a 28,5 ○ C (mantenere piastra al buio per tutta test per evitare photobleaching di soluzione test). Il saggio può essere eseguito per periodi di tempo che vanno da 1 ora a 24 ore. La durata del saggio dipende dallo scopo dello studio. Per testare la risposta ad una breve composto non stabile recitazione breve durata può essere più adatto. Tuttavia, per le prove di composti stabili o test di effetti genetici, massimizzando durata saggio è preferibile sfruttare i vantaggi connessi con il segnale cumulativo. </li><li> In un punto tempo predeterminato (vedere la fase 3.6 per aiutare a determinare i tempi)leggere la fluorescenza di piatto di pesce pieno di nuovo con le stesse impostazioni di passo 3.5. </li></ol> 4. Valutare la variazione relativa a fluorescenza associata al trattamento con <ol><li> Calcolare variazione di fluorescenza di ciascun pozzetto sottraendo la fluorescenza al tempo 0 dal fluorescenza al termine dello studio. Wells senza pesce (spazi) devono avere valori prossimi a 0, ben al di sotto dei valori da pozzi che contengono pesci. Cambia in Fluorescenza = Fluorescenza a conclusione - Fluorescenza al tempo 0 </li><li> Per accertare la variazione relativa di fluorescenza, calcolare la variazione media della fluorescenza per pozzetti di controllo poi dividono la variazione di fluorescenza di ciascun bene dal variazione media di fluorescenza dei pozzetti di controllo. Da segnalare, i controlli potrebbero essere sia comandi del veicolo o controlli genetici. <img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/53297/53297eq1.jpg" /></li></ol>

<ol><li>Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+multiplex+biallelic+zebrafish+genome+editing+using+a+CRISPR+nuclease+system%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system.</a> PNAS. 110, 13904-13909 (2013).</li>
<li>Kimura, Y., Hisano, Y., Kawahara, A., Higashijima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+knock-in+transgenic+zebrafish+carrying+reporter%2Fdriver+genes+by+CRISPR%2FCas9-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of knock-in transgenic zebrafish carrying reporter/driver genes by CRISPR/Cas9-mediated genome engineering.</a> Sci. Rep. 4, 6545(2014).</li>
<li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+human+disease%3A+zebrafish+swim+into+view%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).</li>
<li>Brand, M. D., Couture, P., Else, P. L., Withers, K. W., Hulbert, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+energy+metabolism.+Proton+permeability+of+the+inner+membrane+of+liver+mitochondria+is+greater+in+a+mammal+than+in+a+reptile%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Evolution of energy metabolism. Proton permeability of the inner membrane of liver mitochondria is greater in a mammal than in a reptile.</a> Biochem. J. 275 (Pt 1), 81-86 (1991).</li>
<li>Renquist, B. J., Zhang, C., Williams, S. Y., Cone, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+assay+for+high-throughput+energy+expenditure+monitoring+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Development of an assay for high-throughput energy expenditure monitoring in the zebrafish.</a> Zebrafish. 10, 343-352 (2013).</li>
<li>Livingston, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+volumetric+respirometer+for+long-term+studies+of+small+aquatic+animals%5BTitle%5D)+AND+%22J.Mar.+Biol.+Assoc.+U.K%22%5BJournal%5D)">A volumetric respirometer for long-term studies of small aquatic animals.</a> J.Mar. Biol. Assoc. U.K. 48, 485-497 (1968).</li>
<li>Makky, K., Duvnjak, P., Pramanik, K., Ramchandran, R., Mayer, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+whole-animal+microplate+assay+for+metabolic+rate+using+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">A whole-animal microplate assay for metabolic rate using zebrafish.</a> J. Biomol. Screen. 13, 960-967 (2008).</li>
<li>E3 medium (for zebrafish embryos) Cold Spring Harb. Protoc. , <a target="_blank" href="http://cshprotocols.cshlp.org/citmgr?gca=protocols%3B2011%2F10%2Fpdb.rec66449">http://cshprotocols.cshlp.org/citmgr?gca=protocols%3B2011%2F10%2Fpdb.rec66449</a> (2011).</li>
<li>Nasiadka, A., Clark, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+breeding+in+the+laboratory+environment%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Zebrafish breeding in the laboratory environment.</a> ILAR J. 53, 161-168 (2012).</li>
<li>Brand, M., Granato, M., Nusslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrand%2C+M+%22Zebrafish%2C+A+practical+approach%22">Zebrafish, A practical approach</a>. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. , Oxford University Press. (2002).</li>
<li>Fry, F. E. J., Hart, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cruising+speed+of+goldfish+in+relation+to+water+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Fish.+Res.+Board+Can%22%5BJournal%5D)">Cruising speed of goldfish in relation to water temperature.</a> J. Fish. Res. Board Can. 7, 169-175 (1948).</li>
<li>Oka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diet-induced+obesity+in+zebrafish+shares+common+pathophysiological+pathways+with+mammalian+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+physiol%22%5BJournal%5D)">Diet-induced obesity in zebrafish shares common pathophysiological pathways with mammalian obesity.</a> BMC physiol. 10 (21), (2010).</li>
<li>Song, Y., Cone, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+a+genetic+model+of+obesity+in+a+teleost%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Creation of a genetic model of obesity in a teleost.</a> FASEB J. 21, 2042-2049 (2007).</li>
<li>Maddison, L. A., Joest, K. E., Kammeyer, R. M., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+insulin+resistance+in+zebrafish+induces+alterations+in+beta-cell+number+and+glucose+tolerance+in+an+age+and+diet+dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+physiol.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle insulin resistance in zebrafish induces alterations in beta-cell number and glucose tolerance in an age and diet dependent manner.</a> Am. J. physiol. Endocrinol. , (2015).</li>
<li>Flynn, E. J. 3rd, Trent , C. M., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+and+nutritional+control+of+adipogenesis+in+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+lipid+res%22%5BJournal%5D)">Ontogeny and nutritional control of adipogenesis in zebrafish (Danio rerio).</a> J. lipid res. 50, 1641-1652 (2009).</li>
<li>Shimada, Y., Hirano, M., Nishimura, Y., Tanaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+fluorescence-based+assay+system+for+appetite-regulating+gene+and+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">A high-throughput fluorescence-based assay system for appetite-regulating gene and drug screening.</a> PloS one. 7, e52549(2012).</li>
<li>Tingaud-Sequeira, A., Ouadah, N., Babin, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+obesogenic+test%3A+a+tool+for+screening+molecules+that+target+adiposity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+lipid+res%22%5BJournal%5D)">Zebrafish obesogenic test: a tool for screening molecules that target adiposity.</a> J. lipid res. 52, 1765-1772 (2011).</li>
</ol>

Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti da rivelare.

La contaminazione con batteri o funghi limiterà notevolmente l&#39;applicazione di questo test. Il blu di metilene in mezzo embrione E3 limita la possibilità di contaminazione fungina. Nel corso embrione rialzando è fondamentale che la cura è presa per eliminare l&#39;embrione è morto due volte al giorno. Inoltre, è essenziale risciacquare abbondantemente gli embrioni con E3 sterile medio embrione del giorno di dosaggio iniziazione. Questi 2 passaggi limitano il potenziale di contaminazione batterica degli embrioni. L&#...

Il mouse è attualmente il modello predominante per la ricerca di obesità. L&#39;intervallo breve generazione e strumenti genetiche disponibili nel topo sono stati fino ad oggi senza pari. Tuttavia, il pesce zebra ha anche un intervallo di generazione breve (3 - 4 mesi) e supera anche il mouse in facilità di manipolazione genetica 1,2. Il pesce zebra mantiene quasi il 90% dei geni dei mammiferi, mentre di gran lunga superiore il mouse in numero di figli e il potenziale per l&#39;uso in schermi genetici e droga 3. Per sfruttare il potenziale del modello di zebrafish per gli studi in obesità, le analisi devono essere sviluppati per indagare i fattori che influenzano il corpo regolazione del peso, comprese le spese di energia. Come metaboliti vengono elaborati tramite β-ossidazione e l&#39;ossigeno ciclo degli acidi tricarbossilici viene consumato e NADH 2 viene prodotto. Così, NADH 2 è un indicatore diretto del flusso di metaboliti attraverso vie metaboliche (metabolita ossidazione). In poikilotherms, H + perdite attraverso la membrana mitocondriale interna, che disaccoppia NADH 2 ossidazione dalla sintesi di ATP, è 4 - 5 volte inferiore negli esseri omeotermi 4. Di conseguenza, in NADH zebrafish 2 è molto strettamente legata alla produzione di ATP attraverso la fosforilazione ossidativa. Qui, descriviamo un metodo che misura NADH 2 produzione nel zebrafish larvale come proxy per dispendio energetico 5. Il consumo di ossigeno è il gold standard per la misurazione della spesa energetica. Tuttavia, per sfruttare al meglio l&#39;elevato potenziale rendimento del zebrafish, saggi di dispendio energetico devono essere suscettibili di high-throughput. Sistemi di consumo di ossigeno che dipendono da una camera chiusa sistema di circolazione sono limitati nella velocità per il numero di camere disponibili 6. Open air consumo di O 2 / CO 2 test di produzione è stato applicato anche nel zebrafish 5,7. Questi all&#39;aperto 96 pozzetti piastra di basesistemi d sono suscettibili di throughput elevato. Sfortunatamente, lo scambio di gas con l&#39;ambiente limita sensibilità di questi test. Abbiamo recentemente pubblicato l&#39;applicazione di un metodo che monitora NADH 2 utilizzando l&#39;indicatore redox alamarBlue 5. Questo saggio supera i limiti di produttività e sensibilità comune per analisi di consumo di ossigeno in zebrafish. Il pesce zebra sta diventando un modello sempre più importante per gli studi di tutto omeostasi energia del corpo. In parte, perché zebrafish sono suscettibili di utilizzare schermi genetici avanti e schermi di droga. Inoltre, mirata manipolazione genetica, tra cui knockdown e knock-in, può essere applicato rapidamente. Abbiamo precedentemente dimostrato che questo test può essere combinato con l&#39;applicazione di droga bagno e atterramento genetica o knockout per identificare i composti e geni che alterano il tasso metabolico 5. Inoltre, questo test è stato progettato per sfruttare i vantaggi di throughput elevati inerenti il ​​pesce zebra. </p&gt;

<table><tbody><tr><td>AlamarBlue</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-230-103</td><td>Prodotto da Thermo Scientific</td></tr><tr><td>Pipetta di trasferimento monouso con punta fine</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-26</td><td>Prodotto da Thermo Scientific</td></tr><tr><td>Fisherbrand Pipetta di trasferimento monouso graduata</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-771-9AM</td><td>Prodotto da Thermo Scientific</td></tr><tr><td>Piastre a 96 pozzetti con fondo trasparente con lati neri</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-320-785</td><td>Prodotto da E& K Prodotti Scientifici Inc.</td></tr></tbody></table>

high throughput<em&gt; danio rerio</em&gt; energia spese assay

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish sono un importante organismo modello con vantaggi inerenti che hanno il potenziale per fare zebrafish un modello ampiamente utilizzato per lo studio della omeostasi energetica e obesità. Le piccole dimensioni di zebrafish permette di saggi sugli embrioni da condurre in un formato piatto 96- o 384 pozzetti, tecnologie Morpholino e CRISPR basate promuovere la facilità di manipolazione genetica, e il trattamento farmacologico per applicazione bagno è praticabile. Inoltre, zebrafish sono ideali per schermi genetici a termine che consentono di scoperta del gene romanzo. Data la relativa novità di zebrafish come modello per l&#39;obesità, è necessario sviluppare strumenti che sfruttino appieno questi benefici. Qui, si descrive un metodo per misurare il dispendio energetico in migliaia di zebrafish embrioni contemporaneamente. Abbiamo sviluppato una piattaforma completamente microplacca animale in cui usiamo piastre a 96 pozzetti per isolare singoli pesci e noi valutare cumulativo NADH 2 produzione utilizzando il disponibile in commercio coltura cellulare vitalità reagente alamarBlue. Nel poichilotermi il rapporto tra NADH 2 produzione e la spesa energetica è strettamente legata. Questo test dispendio energetico crea il potenziale per lo screening rapido manipolazioni farmacologiche o genetiche che alterano direttamente la spesa energetica o alterano la risposta ad un farmaco applicato (ad esempio sensibilizzatori dell&#39;insulina).

Soluzione Assay non aumenta la fluorescenza in assenza di pesci embrionali (Figura 1). Tuttavia, l&#39;analisi è molto sensibile a piccole variazioni del tasso metabolico nel pozzo. Un singolo pesce entro un ben crea un segnale significativamente diverso da pozzetti bianchi entro 1 ora (p &lt;0,0001). La Figura 2 fornisce una rappresentazione visiva dei segnali generati dai pesci embrionale dopo 24 ore di incubazione. Ai fini di questa immagine sono stati utilizzati chi...

I pesci zebra sono un importante organismo modello per lo studio dell'omeostasi energetica. Utilizzando un indicatore redox sensibile al NADH2, alamar Blue, abbiamo sviluppato un test che misura il tasso metabolico delle larve di zebrafish in un formato di piastra a 96 pozzetti e può essere applicato alla scoperta di farmaci o geni.

High Throughput<em&gt; Danio Rerio</em&gt; Energia spese Assay

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of ...

L'obiettivo generale di questo saggio fluorometrico ad alto rendimento basato sul resazurin è monitorare l'effetto di manipolazioni genetiche o farmacologiche sulla produzione di NADH2, un parametro indicativo della velocità metabolica. Questo metodo può aiutarci a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'obesità, come l'effetto di un determinato farmaco o gene sulla velocità metabolica. Inoltre, questo saggio può essere impiegato per individuare possibili interazioni tra farmaco-farmaco o farmaco-gene in un sistema animale completo.Il vantaggio principale di questo saggio, rispetto ai saggi di consumo di ossigeno, è l'elevata produttività e l'accumulo del segnale nel tempo, che consente all'utente di rilevare piccole differenze nel tasso metabolico. A dimostrare questa procedura sarà Caroline Foy, studentessa laureata nel mio laboratorio. Dopo aver preparato una soluzione madre di mezzo E3 60X seguendo il protocollo indicato nel testo, preparare il mezzo E3 1X diluendo 16,5 millilitri di soluzione madre con un litro di acqua doppio distillata.Quindi aggiungere 100 microlitri di blu di metilene al 1%. Per preparare una pipetta monouso con punta lucidata alla fiamma per il t

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Zebrafish rappresenta un potente modello vertebrato che è stato sotto-utilizzato per studi metabolici. Qui si descrive un metodo rapido per misurare...

Analisi Profilo metabolico di embrioni di zebrafish

Viene descritto un protocollo per il rilevamento in vivo degli effetti degli inibitori mitocondriali nell'organismo modello Caenorhabditis elegans e per l'identificazione di potenziali composti potenzianti. Questo protocollo può essere utilizzato per lo screening di librerie di farmaci alla ricerca di composti che modulano la funzione mitocondriale.

Un Screenable<em&gt; In Vivo</em&gt; Saggio per mitocondriale modulatori Uso Transgenic Bioluminescent<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Si tratta di una dieta grassa alta alimentazione protocollo per indurre l'obesità in Drosophila, un modello per la comprensione dei meccanismi molecolari fondamentali implicati in lipotoxicity. Fornisce inoltre un'analisi di triacylglyceride throughput elevato per misurare l'accumulo di grasso in Drosophila e potenzialmente altri modelli (insetti) in varie condizioni dietetiche, ambientali, genetiche o fisiologiche.

Dieta grassa alta alimentazione e Throughput elevato dosaggio di Triacylglyceride in Drosophila Melanogaster

Vi presentiamo un protocollo per misurare il consumo di ossigeno e l'acidificazione extracellulare nei cervelli di larve e adulti di Drosophila melanogaster . Un analizzatore metabolico è utilizzato con un protocollo adattato e ottimizzato. Vincoli di micro-tessuto sono una componente fondamentale del presente protocollo e progettate e create appositamente per il loro uso in questa analisi.

Analisi metabolica di Drosophila melanogaster Larval e cervello adulto

Questa tecnica viene descritto la registrazione in tempo reale del consumo di ossigeno e tassi di acidificazione extracellulare nei tessuti retinici explanted del mouse utilizzando un analizzatore di flusso extracellulare.

Misurazione del metabolismo energetico in tessuto retinico Explanted usando l'analisi di flusso extracellulare

La respirazione mitocondriale è fondamentale per la sopravvivenza organismal; Pertanto, il tasso di consumo di ossigeno è un eccellente indicatore della salute mitocondriale. In questo protocollo, descriviamo l'uso di un respirometro commercialmente disponibile per misurare basale e tassi di consumo di ossigeno massimo nel vivere, intatta e liberamente-motile Caenorhabditis elegans.

Misurazione dei tassi di consumo di ossigeno in intatto Caenorhabditis elegans

Qui, caratterizziamo le risposte di stress proteotossico cellulare nel nematode C. elegans misurando l'attivazione di reporter trascrizionali fluorescenti e analizzando la sensibilità allo stress fisiologico.

Misurazioni delle risposte allo stress fisiologico in C. Elegans

Questo studio presenta protocolli per due approcci di analisi dell'attività locomotoria semi-automatizzati nei vermi del gas-1della malattia di C. elegans complesso I(fc21),vale a dire ZebraLab (un saggio a medio rendimento) e WormScan (un saggio ad alto rendimento) e fornisce analisi comparative tra una vasta gamma di metodi di ricerca per quantificare il comportamento dei nematodi e la funzione neuromuscolare integrata.

Analisi comparativa di metodi sperimentali per quantificare l'attività animale in modelli di caenorhabditis elegans della malattia mitocondriale

Il test dell'alimentatore di micropiasche offre un metodo economico e ad alta produttività per quantificare il consumo di alimenti liquidi in Drosophila. Un dispositivo stampato in 3D collega una micropiastra a 96 pozzette in cui le mosche sono alloggiate a una micropiastra da 1536 pozzene da cui le mosche consumano una soluzione di alimentazione con un colorante tracciante. Il declino del volume della soluzione viene misurato spettrofotometricamente.

Un test di alimentazione a micropiasche ad alta produttività per la quantificazione del consumo in Drosophila

I microbi intestinali possono avere un impatto positivo o negativo sulla salute del loro ospite attraverso meccanismi specifici o conservati. Caenorhabditis elegans è una comoda piattaforma per lo screening di tali microbi. Il presente protocollo descrive lo screening ad alto rendimento di 48 isolati batterici per l'impatto sulla resistenza allo stress dei nematodi, utilizzati come proxy per la salute dei vermi.

Screening ad alta produttività di isolati microbici con impatto sulla salute di Caenorhabditis elegans

Questo protocollo descrive un test per quantificare la velocità di alimentazione di Caenorhabditis elegans basato sulla misurazione della clearance dei batteri in coltura liquida.

Quantificazione dell'assunzione di cibo in Caenorhabditis elegans misurando la clearance batterica

Scopri un saggio fluorometrico ad alto rendimento per misurare la produzione di NADH2 e il tasso metabolico in larve di Danio rerio. Questo metodo consente lo screening di farmaci e geni per studi sull'omeostasi energetica.

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