Ibridazione in sito whole mount
L'ibridazione in situ a montaggio intero è una tecnica potente che consente agli scienziati di comprendere le basi molecolari dello sviluppo embrionale. "Whole-mount" indica che verrà utilizzato l'intero embrione, non solo una fetta di tessuto. "In situ" è una frase latina che significa "in posizione". E infine, "ibridazione" si riferisce al legame complementare di una molecola di RNA prodotta sinteticamente a un trascritto di mRNA all'interno della cellula di un organismo.
Questo video mostrerà la procedura, i risultati attesi e le applicazioni selezionate di questa tecnica che possono consentire una migliore comprensione dei disturbi dello sviluppo.
I geni alla base della morfogenesi dell'organismo sono espressi in modelli temporalmente e spazialmente limitati durante il corso dello sviluppo embrionale.
Le sonde di RNA prodotte sinteticamente, chiamate ribosonde, vengono utilizzate per rilevare gli mRNA mediante legame complementare. I ribosonde sono etichettati con nucleotidi speciali contenenti "apteni", come dinitrofenolo, biotina o digossigenina. Gli apteni sono molecole che possono suscitare una risposta immunitaria quando sono attaccate a molecole più grandi e sono quindi bersagli per il legame degli anticorpi. Questi anticorpi di rilevamento sono coniugati a enzimi, come la perossidasi di rafano o la fosfatasi alcalina, che catalizzano reazioni chimiche in cui può essere depositato un colorante fluorescente o colorato.
Le tradizionali tecniche di ibridazione in situ richiedono la preparazione di sezioni tissutali di un embrione per facilitare la rilevazione delle strutture interne. Di conseguenza, una valutazione completa dell'espressione genica in tutto l'organismo dovrà essere ricostruita dalle fette di tessuto da 5-6 μm con l'aiuto di un software per computer. Tuttavia, con lo sviluppo di tecniche a monte intero, è possibile ottenere l'analisi dell'espressione genica su distanze maggiori all'interno dell'intero embrione.
Dopo aver esaminato i principi alla base dell'ibridazione in situ a montaggio intero, esaminiamo il protocollo sperimentale passo dopo passo.
Il primo passo di questa procedura prevede l'identificazione della sequenza bersaglio nell'organismo modello da studiare. La sequenza di DNA bersaglio viene quindi amplificata mediante PCR utilizzando primer contenenti sequenze di inizio della RNA polimerasi. Il modello di DNA amplificato è ora trascritto in vitro con nucleotidi etichettati con hapten. Questa ribosprobe etichettata hapten è ora pronta per la fase di ibridazione.
Gli embrioni sono preparati per l'ibridazione tramite fissazione con formaldeide, un reagente reticolante che stabilizza le proteine e protegge dalle RNasi. Dopo la fissazione, la formaldeide viene rimossa lavando l'embrione più volte con soluzione salina tamponata con fosfato contenente una piccola quantità di detergente, come Tween. Per rimuovere i lipidi cellulari e facilitare la penetrazione della sonda nei tessuti, gli embrioni vengono disidratati in una serie graduata di lavaggi a metanolo, ad esempio: 25%, 50%, 75%, 100% metanolo. Gli embrioni possono essere conservati al 100% in metanolo per un massimo di un mese (o più) a -20°C.
Per preparare gli embrioni all'ibridazione, devono essere reidratati da una serie graduata di lavaggi di metanolo con progressivamente meno metanolo per lavaggio. Gli embrioni vengono quindi digeriti con una proteasi per facilitare la diffusione della ribosonda nei tessuti. La ribosprola etichettata viene aggiunta all'embrione e viene effettuata l'ibridazione.
I lavaggi post-ibridazione vengono eseguiti per rimuovere le ibridazioni non specifiche. Le RNasi A e T1 vengono aggiunte per rimuovere le sonde ibridate in modo incompleto digerendo l'RNA a singolo filamento. Le sonde ibridate vengono rilevate con un coniugato anticorpo-enzima che lega le ribosonde marcate con hapten. Come accennato in precedenza, enzimi come la fosfatasi alcalina sono coniugati ad anticorpi specifici di hapten e vengono rilevati aggiungendo substrati enzimatici per suscitare un cambiamento di colore. Il prodotto di reazione forma un precipitato viola scuro che segna la posizione dell'mRNA espresso, come si vede in questo esempio.
Ora che sai come fare l'ibridazione in situ a montaggio intero, diamo un'occhiata ad alcune applicazioni della tecnica.
L'ibridazione in situ a monte intero è stata utilizzata per aiutare gli scienziati ad affrontare malattie mortali trasmesse dalle zanzare, come la malaria, la febbre dengue e la malattia del Nilo occidentale. Caratterizzando i geni coinvolti nella riproduzione e nello sviluppo delle zanzare, nuovi insetticidi biologici o chimici possono essere progettati per indirizzare meglio le zanzare portatrici di malattie.
Un'altra applicazione di questa tecnica prevede la caratterizzazione dei cambiamenti del modello di espressione genica associati all'esposizione a teratogeni o agenti che interferiscono con lo sviluppo fetale.
Qui, l'ibridazione in situ a monte intero è stata utilizzata in un modello zebrafish di sindrome alcolica fetale per identificare i geni i cui modelli di espressione vengono modificati dopo l'esposizione all'alcol. Questo può aiutare nello sviluppo di terapie per mitigare le conseguenze dell'esposizione all'alcol in utero.
L'ibridazione in situ a montaggio intero può anche essere utilizzata per convalidare i cambiamenti fenotipici associati alle malattie congenite. Le mutazioni associate alla sindrome di Bardet-Biedl sono state introdotte negli embrioni di zebrafish attraverso mRNA mutanti prodotti sinteticamente. Dopo un periodo di tempo definito, gli embrioni sono stati divisi in gruppi in base alla gravità dei difetti. La visualizzazione dell'espressione dei geni a valle del gene mutato è stata utilizzata per convalidare i cambiamenti fenotipici. Pertanto, l'ibridazione in situ a monte intero in combinazione con il punteggio fenotipico può facilitare una migliore comprensione dei ruoli di specifiche mutazioni alla base dei difetti dello sviluppo.
Hai appena visto il video di JoVE sull'ibridazione in situ a montaggio intero. Questa tecnica è un potente strumento che consente una precisa caratterizzazione temporale e spaziale dell'espressione genica all'interno di un organismo. L'ibridazione in situ a monte intero viene attualmente utilizzata per generare un atlante di modelli di espressione genica durante lo sviluppo in una moltitudine di organismi modello. Questi studi possono facilitare lo sviluppo di nuove terapie per il trattamento di malattie umane, tra cui il cancro. Grazie per l'attenzione!
L'ibridazione in situ a montaggio intero (WMISH) è una tecnica comune utilizzata per visualizzare la posizione degli RNA espressi negli embrioni. In q…
L'ibridazione in situ a montaggio intero è una tecnica potente che consente agli scienziati di comprendere le basi molecolari dello sviluppo embrionale. "Whole-mount" indica che verrà utilizzato l'intero embrione, non solo una fetta di tessuto. "In situ" è una frase latina che significa "in posizione". E infine, "ibridazione" si riferisce al legame complementare di una molecola di RNA prodotta sinteticamente a un trascritto di mRNA all'interno della cellula di un organismo.
Questo video mostrerà la procedura, i risultati attesi e le applicazioni selezionate di questa tecnica che possono consentire una migliore comprensione dei disturbi dello sviluppo.
I geni alla base della morfogenesi dell'organismo sono espressi in modelli temporalmente e spazialmente limitati durante il corso dello sviluppo embrionale.
Le sonde di RNA prodotte sinteticamente, chiamate ribosonde, vengono utilizzate per rilevare gli mRNA mediante legame complementare. I ribosonde sono etichettati con nucleotidi speciali contenenti "apteni", come dinitrofenolo, biotina o digossigenina. Gli apteni sono molecole che possono suscitare una risposta immunitaria quando sono attaccate a molecole più grandi e sono quindi bersagli per il legame degli anticorpi. Questi anticorpi di rilevamento sono coniugati a enzimi, come la perossidasi di rafano o la fosfatasi alcalina, che catalizzano reazioni chimiche in cui può essere depositato un colorante fluorescente o colorato.
Le tradizionali tecniche di ibridazione in situ richiedono la preparazione di sezioni tissutali di un embrione per facilitare la rilevazione delle strutture interne. Di conseguenza, una valutazione completa dell'espressione genica in tutto l'organismo dovrà essere ricostruita dalle fette di tessuto da 5-6 μm con l'aiuto di un software per computer. Tuttavia, con lo sviluppo di tecniche a monte intero, è possibile ottenere l'analisi dell'espressione genica su distanze maggiori all'interno dell'intero embrione.
Dopo aver esaminato i principi alla base dell'ibridazione in situ a montaggio intero, esaminiamo il protocollo sperimentale passo dopo passo.
Il primo passo di questa procedura prevede l'identificazione della sequenza bersaglio nell'organismo modello da studiare. La sequenza di DNA bersaglio viene quindi amplificata mediante PCR utilizzando primer contenenti sequenze di inizio della RNA polimerasi. Il modello di DNA amplificato è ora trascritto in vitro con nucleotidi etichettati con hapten. Questa ribosprobe etichettata hapten è ora pronta per la fase di ibridazione.
Gli embrioni sono preparati per l'ibridazione tramite fissazione con formaldeide, un reagente reticolante che stabilizza le proteine e protegge dalle RNasi. Dopo la fissazione, la formaldeide viene rimossa lavando l'embrione più volte con soluzione salina tamponata con fosfato contenente una piccola quantità di detergente, come Tween. Per rimuovere i lipidi cellulari e facilitare la penetrazione della sonda nei tessuti, gli embrioni vengono disidratati in una serie graduata di lavaggi a metanolo, ad esempio: 25%, 50%, 75%, 100% metanolo. Gli embrioni possono essere conservati al 100% in metanolo per un massimo di un mese (o più) a -20°C.
Per preparare gli embrioni all'ibridazione, devono essere reidratati da una serie graduata di lavaggi di metanolo con progressivamente meno metanolo per lavaggio. Gli embrioni vengono quindi digeriti con una proteasi per facilitare la diffusione della ribosonda nei tessuti. La ribosprola etichettata viene aggiunta all'embrione e viene effettuata l'ibridazione.
I lavaggi post-ibridazione vengono eseguiti per rimuovere le ibridazioni non specifiche. Le RNasi A e T1 vengono aggiunte per rimuovere le sonde ibridate in modo incompleto digerendo l'RNA a singolo filamento. Le sonde ibridate vengono rilevate con un coniugato anticorpo-enzima che lega le ribosonde marcate con hapten. Come accennato in precedenza, enzimi come la fosfatasi alcalina sono coniugati ad anticorpi specifici di hapten e vengono rilevati aggiungendo substrati enzimatici per suscitare un cambiamento di colore. Il prodotto di reazione forma un precipitato viola scuro che segna la posizione dell'mRNA espresso, come si vede in questo esempio.
Ora che sai come fare l'ibridazione in situ a montaggio intero, diamo un'occhiata ad alcune applicazioni della tecnica.
L'ibridazione in situ a monte intero è stata utilizzata per aiutare gli scienziati ad affrontare malattie mortali trasmesse dalle zanzare, come la malaria, la febbre dengue e la malattia del Nilo occidentale. Caratterizzando i geni coinvolti nella riproduzione e nello sviluppo delle zanzare, nuovi insetticidi biologici o chimici possono essere progettati per indirizzare meglio le zanzare portatrici di malattie.
Un'altra applicazione di questa tecnica prevede la caratterizzazione dei cambiamenti del modello di espressione genica associati all'esposizione a teratogeni o agenti che interferiscono con lo sviluppo fetale.
Qui, l'ibridazione in situ a monte intero è stata utilizzata in un modello zebrafish di sindrome alcolica fetale per identificare i geni i cui modelli di espressione vengono modificati dopo l'esposizione all'alcol. Questo può aiutare nello sviluppo di terapie per mitigare le conseguenze dell'esposizione all'alcol in utero.
L'ibridazione in situ a montaggio intero può anche essere utilizzata per convalidare i cambiamenti fenotipici associati alle malattie congenite. Le mutazioni associate alla sindrome di Bardet-Biedl sono state introdotte negli embrioni di zebrafish attraverso mRNA mutanti prodotti sinteticamente. Dopo un periodo di tempo definito, gli embrioni sono stati divisi in gruppi in base alla gravità dei difetti. La visualizzazione dell'espressione dei geni a valle del gene mutato è stata utilizzata per convalidare i cambiamenti fenotipici. Pertanto, l'ibridazione in situ a monte intero in combinazione con il punteggio fenotipico può facilitare una migliore comprensione dei ruoli di specifiche mutazioni alla base dei difetti dello sviluppo.
Hai appena visto il video di JoVE sull'ibridazione in situ a montaggio intero. Questa tecnica è un potente strumento che consente una precisa caratterizzazione temporale e spaziale dell'espressione genica all'interno di un organismo. L'ibridazione in situ a monte intero viene attualmente utilizzata per generare un atlante di modelli di espressione genica durante lo sviluppo in una moltitudine di organismi modello. Questi studi possono facilitare lo sviluppo di nuove terapie per il trattamento di malattie umane, tra cui il cancro. Grazie per l'attenzione!
L'ibridazione in situ a montaggio intero è una tecnica potente che consente agli scienziati di comprendere le basi molecolari dello sviluppo embrionale. "Whole-mount" indica che verrà utilizzato l'intero embrione, non solo una fetta di tessuto. "In situ" è una frase latina che significa "in posizione". E infine, "ibridazione" si riferisce al legame complementare di una molecola di RNA prodotta sinteticamente a un trascritto di mRNA all'interno della cellula di un organismo.
Questo video mostrerà la procedura, i risultati attesi e le applicazioni selezionate di questa tecnica che possono consentire una migliore comprensione dei disturbi dello sviluppo.
I geni alla base della morfogenesi dell'organismo sono espressi in modelli temporalmente e spazialmente limitati durante il corso dello sviluppo embrionale.
Le sonde di RNA prodotte sinteticamente, chiamate ribosonde, vengono utilizzate per rilevare gli mRNA mediante legame complementare. I ribosonde sono etichettati con nucleotidi speciali contenenti "apteni", come dinitrofenolo, biotina o digossigenina. Gli apteni sono molecole che possono suscitare una risposta immunitaria quando sono attaccate a molecole più grandi e sono quindi bersagli per il legame degli anticorpi. Questi anticorpi di rilevamento sono coniugati a enzimi, come la perossidasi di rafano o la fosfatasi alcalina, che catalizzano reazioni chimiche in cui può essere depositato un colorante fluorescente o colorato.
Le tradizionali tecniche di ibridazione in situ richiedono la preparazione di sezioni tissutali di un embrione per facilitare la rilevazione delle strutture interne. Di conseguenza, una valutazione completa dell'espressione genica in tutto l'organismo dovrà essere ricostruita dalle fette di tessuto da 5-6 μm con l'aiuto di un software per computer. Tuttavia, con lo sviluppo di tecniche a monte intero, è possibile ottenere l'analisi dell'espressione genica su distanze maggiori all'interno dell'intero embrione.
Dopo aver esaminato i principi alla base dell'ibridazione in situ a montaggio intero, esaminiamo il protocollo sperimentale passo dopo passo.
Il primo passo di questa procedura prevede l'identificazione della sequenza bersaglio nell'organismo modello da studiare. La sequenza di DNA bersaglio viene quindi amplificata mediante PCR utilizzando primer contenenti sequenze di inizio della RNA polimerasi. Il modello di DNA amplificato è ora trascritto in vitro con nucleotidi etichettati con hapten. Questa ribosprobe etichettata hapten è ora pronta per la fase di ibridazione.
Gli embrioni sono preparati per l'ibridazione tramite fissazione con formaldeide, un reagente reticolante che stabilizza le proteine e protegge dalle RNasi. Dopo la fissazione, la formaldeide viene rimossa lavando l'embrione più volte con soluzione salina tamponata con fosfato contenente una piccola quantità di detergente, come Tween. Per rimuovere i lipidi cellulari e facilitare la penetrazione della sonda nei tessuti, gli embrioni vengono disidratati in una serie graduata di lavaggi a metanolo, ad esempio: 25%, 50%, 75%, 100% metanolo. Gli embrioni possono essere conservati al 100% in metanolo per un massimo di un mese (o più) a -20°C.
Per preparare gli embrioni all'ibridazione, devono essere reidratati da una serie graduata di lavaggi di metanolo con progressivamente meno metanolo per lavaggio. Gli embrioni vengono quindi digeriti con una proteasi per facilitare la diffusione della ribosonda nei tessuti. La ribosprola etichettata viene aggiunta all'embrione e viene effettuata l'ibridazione.
I lavaggi post-ibridazione vengono eseguiti per rimuovere le ibridazioni non specifiche. Le RNasi A e T1 vengono aggiunte per rimuovere le sonde ibridate in modo incompleto digerendo l'RNA a singolo filamento. Le sonde ibridate vengono rilevate con un coniugato anticorpo-enzima che lega le ribosonde marcate con hapten. Come accennato in precedenza, enzimi come la fosfatasi alcalina sono coniugati ad anticorpi specifici di hapten e vengono rilevati aggiungendo substrati enzimatici per suscitare un cambiamento di colore. Il prodotto di reazione forma un precipitato viola scuro che segna la posizione dell'mRNA espresso, come si vede in questo esempio.
Ora che sai come fare l'ibridazione in situ a montaggio intero, diamo un'occhiata ad alcune applicazioni della tecnica.
L'ibridazione in situ a monte intero è stata utilizzata per aiutare gli scienziati ad affrontare malattie mortali trasmesse dalle zanzare, come la malaria, la febbre dengue e la malattia del Nilo occidentale. Caratterizzando i geni coinvolti nella riproduzione e nello sviluppo delle zanzare, nuovi insetticidi biologici o chimici possono essere progettati per indirizzare meglio le zanzare portatrici di malattie.
Un'altra applicazione di questa tecnica prevede la caratterizzazione dei cambiamenti del modello di espressione genica associati all'esposizione a teratogeni o agenti che interferiscono con lo sviluppo fetale.
Qui, l'ibridazione in situ a monte intero è stata utilizzata in un modello zebrafish di sindrome alcolica fetale per identificare i geni i cui modelli di espressione vengono modificati dopo l'esposizione all'alcol. Questo può aiutare nello sviluppo di terapie per mitigare le conseguenze dell'esposizione all'alcol in utero.
L'ibridazione in situ a montaggio intero può anche essere utilizzata per convalidare i cambiamenti fenotipici associati alle malattie congenite. Le mutazioni associate alla sindrome di Bardet-Biedl sono state introdotte negli embrioni di zebrafish attraverso mRNA mutanti prodotti sinteticamente. Dopo un periodo di tempo definito, gli embrioni sono stati divisi in gruppi in base alla gravità dei difetti. La visualizzazione dell'espressione dei geni a valle del gene mutato è stata utilizzata per convalidare i cambiamenti fenotipici. Pertanto, l'ibridazione in situ a monte intero in combinazione con il punteggio fenotipico può facilitare una migliore comprensione dei ruoli di specifiche mutazioni alla base dei difetti dello sviluppo.
Hai appena visto il video di JoVE sull'ibridazione in situ a montaggio intero. Questa tecnica è un potente strumento che consente una precisa caratterizzazione temporale e spaziale dell'espressione genica all'interno di un organismo. L'ibridazione in situ a monte intero viene attualmente utilizzata per generare un atlante di modelli di espressione genica durante lo sviluppo in una moltitudine di organismi modello. Questi studi possono facilitare lo sviluppo di nuove terapie per il trattamento di malattie umane, tra cui il cancro. Grazie per l'attenzione!
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Q1: What does whole-mount in situ hybridization allow scientists to visualize?
Whole-mount in situ hybridization enables visualization of expressed RNA locations throughout an entire embryo. Synthetically produced RNA probes, called riboprobes, bind complementarily to target mRNA transcripts. This reveals spatial and temporal patterns of gene expression across the whole organism, providing insights into developmental genetics techniques and applications.
Q2: How are riboprobes labeled for detection in whole-mount in situ hybridization?
Riboprobes are labeled with special nucleotides containing haptens, such as dinitrophenol, biotin, or digoxygenin. Haptens are molecules that elicit immune responses when attached to larger molecules, making them targets for antibody binding. Detection antibodies conjugated to enzymes like horseradish peroxidase or alkaline phosphatase then catalyze reactions that deposit fluorescent or colored dyes.
Q3: Why is embryo fixation with formaldehyde important before hybridization?
Formaldehyde fixation stabilizes proteins and protects embryos against RNases, which would otherwise degrade RNA. After fixation, embryos are washed with phosphate buffered saline containing detergent to remove formaldehyde. This preparation step ensures the embryo is ready for subsequent dehydration and probe penetration.
Q4: What is the advantage of whole-mount techniques over traditional tissue section methods?
Traditional in situ hybridization requires reconstructing gene expression from 5-6 micrometer tissue slices using computer software. Whole-mount techniques eliminate this limitation by allowing gene expression analysis over larger distances within the entire embryo. This provides a complete assessment of spatial and temporal gene expression patterns without computational reconstruction.
Q5: How are riboprobes generated for whole-mount in situ hybridization?
Target DNA sequences are first identified and amplified by PCR using primers containing RNA polymerase initiation sequences. The amplified DNA template is then transcribed in vitro with hapten-labeled nucleotides to produce labeled riboprobes. These probes are now ready for the hybridization step with embryonic tissues.
Q6: What role do post-hybridization washes play in the technique?
Post-hybridization washes remove nonspecific hybridizations and incompletely bound probes. RNases A and T1 are added to digest single-stranded RNA that did not properly hybridize. This ensures that only specifically hybridized probes remain, improving signal accuracy and reducing background noise in the final detection.
Q7: How is whole-mount in situ hybridization being applied to understand developmental disorders?
Researchers use whole-mount in situ hybridization to characterize gene expression changes associated with teratogens and congenital diseases. In zebrafish models of fetal alcohol syndrome, the technique identified genes with altered expression after alcohol exposure. Combined with phenotypic scoring, it validates how specific mutations underlying developmental defects affect gene expression downstream.
Capitoli in questo video
0:00
Overview
0:56
Concepts Behind In Situ Hybridization
2:27
Target Identification and Probe Development
5:15
Applications
7:17
Summary