Descrivendo un regolamento Dipendente Fattore di trascrizione del MicroRNA trascrittoma

L'obiettivo generale di questa metodologia è descrivere in che modo un fattore di trascrizione di interesse regola il trascrittoma di microRNA. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali riguardo al coinvolgimento dei fattori di trascrizione che modulano la trascrizione di geni codificanti proteine anche nella trascrizione dei microRNA. Il vantaggio principale di questa metodologia è che integra data mining, dati di laboratorio e analisi bioinformatica per fornire una descrizione completa della trascrizione dei geni di microRNA dipendente dall'attività del fattore di trascrizione di interesse.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'interazione tra la trascrizione del gene microRNA e l'attività dello stato del fattore di trascrizione, è importante ricordare che si tratta di un metodo descrittivo e che la conferma di tale associazione dovrebbe essere effettuata utilizzando saggi aggiuntivi. Per iniziare, aprire un browser genomico, come il browser genomico dell'Università della California di Santa Cruz, al fine di estrarre i dati di sequenziamento da immunoprecipitazione della cromatina. Una volta sul sito, andare nel menu superiore, selezionare Strumenti e aprire il Browser delle tabelle.

Inserire le specifiche, come mostrato qui, nei rispettivi campi, quindi selezionare Ottieni output per estrarre la tabella. Salvare l'output come file di testo. Successivamente, importare il file in un foglio di calcolo.

Una volta nel programma di foglio elettronico, ordinare la colonna dei nomi e filtrare i risultati per un fattore di trascrizione di interesse, come STAT2. Successivamente, copiare l'elenco dei promotori di microRNA in base alla loro firma epigenetica H3K4me3 e incollare l'elenco in un file di testo. Quindi, utilizzare il codice supplementare scritto in SQL e fornito nei file di dati supplementari per mappare i dati raccolti e determinare l'affinità mediana di legame.

Prima di tutto, aggiungere 1,5 milioni di cellule HEK293 in una piastra da 10 centimetri e aggiungere DMEM integrato con FBS al 10%. Coltivare le cellule per 24 ore fino a quando raggiungono una confluenza di circa il 50%. Successivamente, sostituire il mezzo di coltura.

Quindi, aggiungere un agente di trasfezione insieme a cinque microgrammi di un lentivirus della proteina fluorescente verde contenente l'shRNA mirato e cinque microgrammi di vettori di impacchettamento seguendo le istruzioni del produttore. Come controllo, trasfettare una piastra identica di cellule utilizzando uno shRNA randomizzato e i vettori di impacchettamento. Incubare la miscela di trasfezione sulle cellule per 16 ore, quindi sostituire il mezzo con 10 millilitri di mezzo DMEM fresco integrato con FBS al 10%.

48 ore dopo la transvezione, rimuovere il mezzo dalle cellule. Quindi, centrifugare per cinque minuti al fine di raccogliere il sopranatante infettivo. Filtrare il sopranatante attraverso un filtro per siringa da 0,45 micron per rimuovere eventuali cellule in sospensione.

Successivamente, aggiungere il mezzo in un dispositivo filtrante per ultracentrifuga con una soglia di 100 chilodalton. Centrifugare il mezzo per concentrare il lentivirus fino a quando il volume è inferiore a 250 microlitri. Trasferire il liquido rimanente in una provetta criogenica e conservare il virus concentrato a meno 80 gradi Celsius fino al momento dell'utilizzo.

Quando si è pronti per proseguire, rimuovere il Lentivirus congelato dal congelatore a meno 80 e portare la provetta a temperatura ambiente. Trasferire 100 microlitri di supernatante virale in una nuova provetta microcentrifuga da 1,5 millilitri e aggiungere 900 microlitri di mezzo senza siero. Successivamente, aggiungere 10 nanogrammi per millilitro di bromuro di esadimetrina alla sospensione virale di un millilitro.

Mescolare delicatamente il tubo e lasciare riposare la miscela per cinque minuti. Raccogliere cinque milioni di cellule per ogni trasduzione prevista, quindi risospendere delicatamente il pellet cellulare in 0,5 millilitri di mezzo contenente il virus. Trasferire le cellule in una piastra a 12 pozzetti e incubarle per quattro-24 ore.

Quindi, aggiungere ulteriori 0,5 millilitri di mezzo contenente FBS al 20%. A 48-72 ore dal transduzione, raccogliere le cellule e colorarle con ioduro di propidio seguendo le istruzioni del produttore. Dopo la colorazione, proteggere le cellule dalla luce e utilizzare un citofluorimetro per stimare l'efficienza di transfezione misurando la percentuale di cellule GFP positive e negative per l'ioduro di propidio.

Quindi, raccogliere la popolazione di cellule positive per GFP estrarre le loro proteine. Infine, utilizzare il western blotting per determinare i livelli del fattore di trascrizione bersaglio prima e dopo l'infezione delle cellule con lo shRNA designato. Dopo la trasfezione delle cellule CLL con STAT3 shRNA, i livelli di mRNA di STAT3 e della proteina STAT3 sono entrambi notevolmente diminuiti.

Inoltre, un'analisi con microarray di microRNA delle cellule di LLC ha evidenziato 23 microRNA la cui espressione differiva in modo significativo tra le cellule di LLC trasfettate con shRNA per STAT3 e quelle trasfettate con un vettore vuoto. I risultati dell'analisi con microarray di microRNA sono stati convalidati per sette dei geni, mostrati qui, mediante RT-PCR quantitativa. Dopo questa procedura, altri metodi come l'immunoprecipitazione della cromatina, il saggio di spostamento elettroforetico e un saggio differenziale possono essere eseguiti per verificare che questo fattore di trascrizione si leghi e attivi il promotore di un particolare gene mirror.

Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come integrare l'analisi di bioinformatica, i dati disponibili pubblicamente e il silenziamento di un fattore di trascrizione mediante l'approccio con shRNA per determinare in che modo questo fattore di trascrizione regola l'espressione dei geni di microRNA.