Name: Descrivendo un regolamento Dipendente Fattore di trascrizione del MicroRNA trascrittoma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Scopri come i fattori di trascrizione regolano il trascrittoma dei microRNA attraverso data mining, analisi bioinformatica e silenziamento con shRNA. Questo metodo integrato offre una descrizione completa della dinamica trascrizionale.

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Questo studio è stato sostenuto da una sovvenzione della Fondazione Global Research LLC. L&#39;Università del Texas MD Anderson Cancer Center è supportato in parte dal National Institutes of Health attraverso un Cancer Center Support Grant (P30CA16672).

1. Identificare fattore di trascrizione siti di legame nel promotore di geni microRNA Utilizzando Approach Data Mining <ol><li> Utilizzare il browser genoma Università della California a Santa Cruz (UCSC) per estrarre cromatina immunoprecipitazione dati (chip) di sequenziamento generati come parte della Encyclopedia of DNA elemento del progetto (ENCODE). <ol><li> Aprire il browser tavolo nel browser genoma UCSC. </li><li> Utilizzare le seguenti specifiche per estrarre la tabella: Clade: (mammiferi), genoma: (umano), Montaggio: (Feb2009 (GRch37 / hg18)), gruppo: (regolamento), brano (TxnFactorChIP), tabella: (weEncoderesTFbsCo7steredv3), regione : (Genoma), il formato di output (tutti i geni da tabella selezionata). </li><li> Salvare l&#39;output da 1.1.2 come un file .txt e in un foglio elettronico. </li><li> Ordinamento e filtro per il fattore di trascrizione di interesse (ad esempio, STAT2). </li></ol></li><li> Utilizzare l&#39;elenco dei promotori microRNA basate su H3K4me3 epigenetica firma disponibile presso Baeer et al. 9 </sup&gt;. Copia questo elenco in un file .txt. </li><li> Per abbinare secondo coordinate sul genoma umano, mappare i dati da 1.1 e 1.2 (ad esempio, vincolante STAT3 su promotori microRNA putativi) e determinare il legame mediana affinità con il codice scritto in C diesis come indicato nel supplementare di file 1 codifica. </li></ol> 2. Utilizzare shRNA di down-regolare l&#39;espressione di un fattore di trascrizione di interesse <ol><li> Piastra 1,5 x 10 6 cellule provenienti da 293 linea di cellule renali di embrioni umani a 10 cm piastra a circa il 50% di confluenza (DMEM con 10% FBS). </li><li> cellule trasfezione da 293 linea di cellule renali embrionali umane con 5 mg di verde lentivirus proteina fluorescente (GFP) contenente shRNA diretti al fattore di trascrizione di interesse e con 5 mg di vettori di confezionamento con il reagente di trasfezione per cellule aderenti secondo il protocollo del produttore. </li><li> Come controllo, trasfezione le cellule a partire da 293 linea di cellule renali embrionali umane constrapazzate shRNA ei vettori imballaggio secondo il protocollo del produttore. </li><li> Mantenere mix trasfezione su cellule per 16 ore (a 37 ° C, CO 2 incubatore), poi cambiare supporto a 10 ml fresca 10% DMEM media con 10% FBS. </li><li> Attendere 48 ore dopo la trasfezione, centrifugare la coltura cellulare (300 xg, 5 min) e raccogliere il surnatante infettive. Filtrare il surnatante con un filtro a siringa da 0,45 micron (25-mm tensioattivo libero di cellulosa membrana in acetato) per rimuovere eventuali cellule galleggianti. </li><li> Concentrare il surnatante e raccogliere il lentivirus utilizzando un dispositivo di filtro ultracentrifugo con soglia di 100 kDa. Spin a 950 xg per 30 - 60 min fino a quando il volume è stato concentrato a meno di 250 microlitri. Conservare il virus concentrato a -80 ° C. </li><li> Trasfezione delle cellule con il lentivirus. Rimuovere lentivirus congelate da -80 ° C freezer e scongelare a temperatura ambiente. Trasferire 100 ml di surnatante virale per un fresco 1,5 ml provetta da microcentrifuga. <ol><li> Bring il volume nel tubo di 1 ml con ridotta mezzo siero. Aggiungere hexadimethrine bromuro di 1 ml di sospensione di virus per la concentrazione finale di 10 ng / ml, mescolare delicatamente e lasciare riposare l&#39;impasto per 5 min. </li></ol></li><li> Centrifugare 5 x 10 6 cellule per la trasduzione e delicatamente risospendere il pellet cellulare in 0,5 ml di supporti contenenti virus. Lasciare le cellule rimangono nell&#39;incubatrice: 4 - 24 ore, quindi aggiungere 0,5 ml di terreno con 20% FBS ad una concentrazione finale del 10% FBS. </li><li> Attendere 48 a 72 ore e macchiare le cellule con ioduro di propidio (PI) e la proteina fluorescente verde (GFP) in base alle istruzioni del produttore. Proteggere le cellule dalla luce e usare un sorter FACS per misurare i tassi di GFP + / PI - cellule. Dal momento che le macchie PI solo cellule morte, questo tasso è una stima di efficienza di trasfezione nelle cellule viventi. </li><li> Ordina la popolazione di cellule positive per l&#39;espressione della GFP (GFP +) da FACS sorter come descritto in precedenza 10. </li><li> Usa Western blotting immunitario come precedentemente descritto 10 per determinare i livelli di un fattore di trascrizione di interesse prima e dopo infettare le cellule di interesse (per esempio, cellule CLL) con designato shRNA. </li></ol> 3. Determinare il livello di espressione dei microRNA trascrittoma in cellule trasfettate con Fattore di trascrizione-shRNA <ol><li> Isolare RNA utilizzando un kit commerciale secondo il protocollo del produttore. </li><li> Etichettare il RNA e ibridare al microRNA microarray 11. </li><li> Determinare il microRNA differenzialmente espressi in cellule trasfettate con fattore di trascrizione-shRNA o con comandi vuoto vettore 5. </li><li> Convalidare i risultati di microarray per i microRNA più differenzialmente espressi nel formato Real-time PCR 5. </li></ol> 4. Determinare la sovrapposizione tra la bioinformatica e l&#39;approccio shRNA nel descrivere il trascrittoma Dependent fattore di trascrizione <ol><li> per detErmellino i rapporti attesi e osservati di geni microRNA che ospitano fattore di trascrizione siti nel loro promotori vincolanti e sono stati inibiti nella trascrizione fattore-shRNA cellule trasfettate, effettuare le seguenti operazioni: <ol><li> Ottenere il rapporto di geni che ospitano il fattore di trascrizione di interesse per il loro promoter / microRNA totale dalla lista generata in 1.3. Questo elenco è il rapporto atteso (ad esempio, i geni microRNA con siti di legame STAT3 / totale geni microRNA testati = 0.25). </li><li> Determinare il numero di geni che sono stati diminuito l&#39;in cellule trasfettate fattore di trascrizione-shRNA dalla lista generata in 3.3 ed è fattore di trascrizione del legame di interesse siti dalla lista generata in 1.3. Questo / Numero totale di geni ha diminuito l&#39;numero è il rapporto osservato (ad esempio, i geni microRNA con STAT3 siti di legame / numero totale dei microRNA ha diminuito l&#39;= 0.6). </li></ol></li&gt; <li> Utilizzare χ2 statistiche per confrontare i rapporti osservati e attesi che sono stati generati al di sopra e determinare se l&#39;elenco dei geni che sono stati downregulated in cellule trasfettate fattore di trascrizione-shRNA sono arricchiti con siti di legame fattore di trascrizione nel loro promotore. </li></ol>

<ol><li>Bentwich, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+hundreds+of+conserved+and+nonconserved+human+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Identification of hundreds of conserved and nonconserved human microRNAs.</a> Nat Genet. 37, 766-770 (2005).</li>
<li>Hata, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+of+microRNAs+in+cardiovascular+biology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Functions of microRNAs in cardiovascular biology and disease.</a> Annu Rev Physiol. 75, 69-93 (2013).</li>
<li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+target+recognition+and+regulatory+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: target recognition and regulatory functions.</a> Cell. 136, 215-233 (2009).</li>
<li>Piriyapongsa, J., Jordan, I. K., Conley, A. B., Ronan, T., Smalheiser, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+binding+sites+are+highly+enriched+within+microRNA+precursor+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Direct%22%5BJournal%5D)">Transcription factor binding sites are highly enriched within microRNA precursor sequences.</a> Biol Direct. 6, 61(2011).</li>
<li>Rozovski, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transducer+and+activator+of+transcription+%28STAT%29-3+regulates+microRNA+gene+expression+in+chronic+lymphocytic+leukemia+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer%22%5BJournal%5D)">Signal transducer and activator of transcription (STAT)-3 regulates microRNA gene expression in chronic lymphocytic leukemia cells.</a> Mol Cancer. 12, 50(2013).</li>
<li>Turner, M. J., Slack, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+control+of+microRNA+expression+in+C.+elegans%3A+promoting+better+understanding%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional control of microRNA expression in C. elegans: promoting better understanding.</a> RNA Biol. 6, 49-53 (2009).</li>
<li>Cui, Q., Yu, Z., Pan, Y., Purisima, E. O., Wang, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+preferentially+target+the+genes+with+high+transcriptional+regulation+complexity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs preferentially target the genes with high transcriptional regulation complexity.</a> Biochem Biophys Res Commun. 352, 733-738 (2007).</li>
<li>Yamakuchi, M., Lowenstein, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiR-34%2C+SIRT1+and+p53%3A+the+feedback+loop%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">MiR-34, SIRT1 and p53: the feedback loop.</a> Cell Cycle. 8, 712-715 (2009).</li>
<li>Baer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+promoter+DNA+hypermethylation+and+hypomethylation+is+associated+with+aberrant+microRNA+expression+in+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Extensive promoter DNA hypermethylation and hypomethylation is associated with aberrant microRNA expression in chronic lymphocytic leukemia.</a> Cancer Res. 72, 3775-3785 (2012).</li>
<li>Hazan-Halevy, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT3+is+constitutively+phosphorylated+on+serine+727+residues%2C+binds+DNA%2C+and+activates+transcription+in+CLL+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">STAT3 is constitutively phosphorylated on serine 727 residues, binds DNA, and activates transcription in CLL cells.</a> Blood. 115, 2852-2863 (2010).</li>
<li>Melo, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+TARBP2+mutation+in+human+cancer+impairs+microRNA+processing+and+DICER1+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">A TARBP2 mutation in human cancer impairs microRNA processing and DICER1 function.</a> Nat Genet. 41, 365-370 (2009).</li>
<li>Akira, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+roles+of+STAT+family+proteins%3A+lessons+from+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Functional roles of STAT family proteins: lessons from knockout mice.</a> Stem Cells. 17, 138-146 (1999).</li>
<li>Frank, D. A., Mahajan, S., Ritz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+lymphocytes+from+patients+with+chronic+lymphocytic+leukemia+contain+signal+transducer+and+activator+of+transcription+%28STAT%29+1+and+STAT3+constitutively+phosphorylated+on+serine+residues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">B lymphocytes from patients with chronic lymphocytic leukemia contain signal transducer and activator of transcription (STAT) 1 and STAT3 constitutively phosphorylated on serine residues.</a> J Clin Invest. 100, 3140-3148 (1997).</li>
<li>Calin, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+profiling+reveals+distinct+signatures+in+B+cell+chronic+lymphocytic+leukemias%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">MicroRNA profiling reveals distinct signatures in B cell chronic lymphocytic leukemias.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 11755-11760 (2004).</li>
<li>Consortium, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+user%27s+guide+to+the+encyclopedia+of+DNA+elements+%28ENCODE%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">A user's guide to the encyclopedia of DNA elements (ENCODE).</a> PLoS biology. 9, e1001046(2011).</li>
<li>Miranda, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pattern-based+method+for+the+identification+of+MicroRNA+binding+sites+and+their+corresponding+heteroduplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A pattern-based method for the identification of MicroRNA binding sites and their corresponding heteroduplexes.</a> Cell. 126, 1203-1217 (2006).</li>
<li>Consortium, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489, 57-74 (2012).</li>
<li>Lau, J. C., Hanel, M. L., Wevrick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+and+imprinted+epigenetic+modifications+of+the+human+NDN+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific and imprinted epigenetic modifications of the human NDN gene.</a> Nucl Acids Res. 32, 3376-3382 (2004).</li>
<li>Corcoran, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+of+mammalian+microRNA+promoters+emerge+from+polymerase+II+chromatin+immunoprecipitation+data%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Features of mammalian microRNA promoters emerge from polymerase II chromatin immunoprecipitation data.</a> PLoS One. 4, e5279(2009).</li>
<li>Bhattacharyya, M., Feuerbach, L., Bhadra, T., Lengauer, T., Bandyopadhyay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+transcription+start+site+prediction+with+multi-objective+feature+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Stat+Appl+Genet+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA transcription start site prediction with multi-objective feature selection.</a> Stat Appl Genet Mol Biol. 11, Article 6 (2012).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Il meccanismo alla base della RNA polimerasi II trascrizione dipendente dei geni codificanti proteine ​​è stata ampiamente studiata. Mentre questi elementi costituiscono solo l&#39;1% - 2% del genoma umano, la prova del progetto ENCODE suggeriscono che oltre l&#39;80% del genoma umano può subire trascrizione 17 e quello che regola la trascrizione degli elementi di DNA non codificanti rimane in gran parte sconosciuta 6 . Diversi studi, che ha indicato che Pol II è anche ...

I microRNA sono endogeni piccoli RNA non codificanti normativi che di solito funzionano come regolatori negativi di espressione dell&#39;mRNA a livello post-trascrizionale. Circa 1000 non codificante 20 a 25 nucleotidi lunghe microRNA si trovano nel genoma umano 1,2. I microRNA regolano l&#39;espressione genica attraverso l&#39;accoppiamento di base canonica tra la sequenza seme del microRNA e il suo complementare sequenza partita seme, che è comunemente trova in regione 3 &#39;non tradotta (UTR) del mRNA bersaglio. Collettivamente, microRNA regolano oltre il 30% dei geni codificanti proteine ​​3, ma solo poco si sa circa la trascrizione dal DNA dei microRNA. È stato suggerito che la regolazione dei microRNA trascrizione è simile a quella di mRNA 4,5. In particolare, simile alla sua attività di promozione trascrizione dei geni codificanti proteine, fattori di trascrizione sono pensati per attivare la trascrizione dei microRNA 6. Fattore di trascrizione-microRNA gioco è stato segnalato come un fattore di modulazione dell&#39;espressione genica 7, e può anche formare feed-back e feed-forward loop. Ad esempio, Yamakuchi et al. Riportato un anello di retroazione in cui p53 induce l&#39;espressione di microRNA34a, che a sua volta inibisce traduzione della SIRT p53 repressore e aumentando così l&#39;attività p53 8. Considerando che sono stati riportati esempi specifici di fattore di trascrizione espressione dei microRNA dipendente, un metodo accettato che fornisce informazioni su come un fattore di trascrizione di interesse regola l&#39;espressione del microRNA-trascrittoma è carente. Lo scopo del protocollo suggerito qui è quello di fornire una descrizione approfondita della trascrizione Regolazione fattore-dipendente del microRNA-transcriptome. Combinando i dati pubblicamente disponibili, strumenti di bioinformatica e utilizzando la tecnologia microarray, i ricercatori che seguono questo algoritmo sarebbe in grado di catturare su scala genomica come qualsiasifattore di trascrizione in qualsiasi tipo di cellula di interesse regola l&#39;espressione del microRNA-trascrittoma e per esplorare un contributo putativo del fattore di trascrizione-mRNA nella regolazione dell&#39;espressione di microRNA.

<table><tbody><tr><td>Lipofectamin 2000</td><td>Life Technologies</td><td>11668027</td><td></td></tr><tr><td>0,45 &; m filtro per siringa</td><td>Thermo Scientific (Nalgene)</td><td>190-2545</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo filtrante ultracentrifugo Amicon con soglia di 100&nbsp; kDa</td><td>Merck Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Merck Millipore</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>Reagente TRIzol</td><td>Life Tachnologies (Invitrogen)</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>293 Linea cellulare umana</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85120602</td><td></td></tr></tbody></table>

descrivendo un regolamento dipendente fattore di trascrizione del microrna trascrittoma

Describing a Transcription Factor Dependent Regulation of the MicroRNA Transcriptome

Mentre la regolazione della trascrizione dei geni codificanti proteine ​​è stato ampiamente studiato, poco si sa su come fattori di trascrizione sono coinvolti nella trascrizione di RNA non codificanti, in particolare dei microRNA. Qui, proponiamo una strategia per studiare il ruolo potenziale del fattore di trascrizione nella regolazione della trascrizione dei microRNA utilizzando i dati pubblicamente disponibili, risorse di calcolo e di dati ad alta produttività. Usiamo il H3K4me3 firma epigenetica per identificare i promotori di microRNA e immunoprecipitazione della cromatina (chip) di dati -sequencing dal progetto ENCODE per identificare i promotori microRNA che si arricchiscono con siti di legame fattore di trascrizione. Transfettando cellule di interesse con shRNA mira un fattore di trascrizione di interesse e sottoporre le cellule a matrice microRNA, si studia l&#39;effetto di questo fattore di trascrizione sul trascrittoma microRNA. A titolo di esempio illustrativo usiamo il nostro studio sull&#39;effetto di STAT3 sul trascrittoma microRNA di mente croniciLeucemia mphocytic (CLL) cellule.

STAT3 è un fattore di trascrizione che induce tipicamente la trascrizione di geni che sono anti apoptotico ed effetti proliferativi 12. Sia STAT3 riguardano anche la non codificante RNA trascrittoma è attualmente sconosciuto. In tutte le cellule CLL STAT3 è costitutivamente fosforilata in serina 707 residui 10,13. Fosfoserina STAT3 navette per il nucleo, si lega al DNA, e attiva i geni noti per essere attivato da tirosina pSTAT3 in altri tipi di cellule 10.</su...

Qui proponiamo una strategia per studiare l'effetto di un fattore di trascrizione di interesse sul trascrittoma del microRNA utilizzando dati pubblicamente disponibili, risorse computazionali e dati ad alto rendimento da array di microRNA dopo aver trasfettato cellule con una piccola forcina (sh)RNA mirata a un fattore di trascrizione di interesse.

Descrivendo un regolamento Dipendente Fattore di trascrizione del MicroRNA trascrittoma

While the transcription regulation of protein coding genes was extensively studied, little is known on how transcription factors are involved in ...

L'obiettivo generale di questa metodologia è descrivere in che modo un fattore di trascrizione di interesse regola il trascrittoma di microRNA. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali riguardo al coinvolgimento dei fattori di trascrizione che modulano la trascrizione di geni codificanti proteine anche nella trascrizione dei microRNA. Il vantaggio principale di questa metodologia è che integra data mining, dati di laboratorio e analisi bioinformatica per fornire una descrizione completa della trascrizione dei geni di microRNA dipendente dall'attività del fattore di trascrizione di interesse.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'interazione tra la trascrizione del gene microRNA e l'attività dello stato del fattore di trascrizione, è importante ricordare che si tratta di un metodo descrittivo e che la conferma di tale associazione dovrebbe essere effettuata utilizzando saggi aggiuntivi. Per iniziare, aprire un browser genomico, come il browser genomico dell'Università della California di Santa Cruz, al fine di estrarre i dati di sequenziamento da immunoprecipitazione della cromatina. Una volta sul sito, andare nel menu superiore, selezionare Strumenti e aprire il Browser delle tabelle.Inserire le specifiche, come mostrato qui, nei rispettivi campi, quindi selezionare Ottieni output per estrarre la tabella. Salvare l'output come file di testo. Successivamente, importare il file in un foglio di calcolo.Una volta nel programma di foglio elettronico, ordinare la colonna dei nomi e filtrare i risultati per un fattore di trascrizione di interesse, come STAT2. Successivamente, copiare l'elenco dei promotori di microRNA in base alla loro firma epigenetica H3K4me3 e incollare l'elenco in un file di testo. Quindi, utilizzare il codice supplementare scritto in SQL e fornito nei file di dati supplementari per mappare i dati raccolti e determinare l'affinità mediana di legame.Prima di tutto, aggiungere 1,5 milioni di cellule HEK293 in una piastra da 10 centimetri e aggiungere DMEM integrato con FBS al 10%. Coltivare le cellule per 24 ore fino a quando raggiungono una confluenza di circa il 50%. Successivamente, sostituire il mezzo di coltura.Quindi, aggiungere un agente di trasfezione insieme a cinque microgrammi di un lentivirus della proteina fluorescente verde contenente l'shRNA mirato e cinque microgrammi di vettori di impacchettamento seguendo le istruzioni del produttore. Come controllo, trasfettare una piastra identica di cellule utilizzando uno shRNA randomizzato e i vettori di impacchettamento. Incubare la miscela di trasfezione sulle cellule per 16 ore, quindi sostituire il mezzo con 10 millilitri di mezzo DMEM fresco integrato con FBS al 10%.48 ore dopo la transvezione, rimuovere il mezzo dalle cellule. Quindi, centrifugare per cinque minuti al fine di raccogliere il sopranatante infettivo. Filtrare il sopranatante attraverso un filtro per siringa da 0,45 micron per rimuovere eventuali cellule in sospensione.Successivamente, aggiungere il mezzo in un dispositivo filtrante per ultracentrifuga con una soglia di 100 chilodalton. Centrifugare il mezzo per concentrare il lentivirus fino a quando il volume è inferiore a 250 microlitri. Trasferire il liquido rimanente in una provetta criogenica e conservare il virus concentrato a meno 80 gradi Celsius fino al momento dell'utilizzo.Quando si è pronti per proseguire, rimuovere il Lentivirus congelato dal congelatore a meno 80 e portare la provetta a temperatura ambiente. Trasferire 100 microlitri di supernatante virale in una nuova provetta microcentrifuga da 1,5 millilitri e aggiungere 900 microlitri di mezzo senza siero. Successivamente, aggiungere 10 nanogrammi per millilitro di bromuro di esadimetrina alla sospensione virale di un millilitro.Mescolare delicatamente il tubo e lasciare riposare la miscela per cinque minuti. Raccogliere cinque milioni di cellule per ogni trasduzione prevista, quindi risospendere delicatamente il pellet cellulare in 0,5 millilitri di mezzo contenente il virus. Trasferire le cellule in una piastra a 12 pozzetti e incubarle per quattro-24 ore.Quindi, aggiungere ulteriori 0,5 millilitri di mezzo contenente FBS al 20%. A 48-72 ore dal transduzione, raccogliere le cellule e colorarle con ioduro di propidio seguendo le istruzioni del produttore. Dopo la colorazione, proteggere le cellule dalla luce e utilizzare un citofluorimetro per stimare l'efficienza di transfezione misurando la percentuale di cellule GFP positive e negative per l'ioduro di propidio.Quindi, raccogliere la popolazione di cellule positive per GFP estrarre le loro proteine. Infine, utilizzare il western blotting per determinare i livelli del fattore di trascrizione bersaglio prima e dopo l'infezione delle cellule con lo shRNA designato. Dopo la trasfezione delle cellule CLL con STAT3 shRNA, i livelli di mRNA di STAT3 e della proteina STAT3 sono entrambi notevolmente diminuiti.Inoltre, un'analisi con microarray di microRNA delle cellule di LLC ha evidenziato 23 microRNA la cui espressione differiva in modo significativo tra le cellule di LLC trasfettate con shRNA per STAT3 e quelle trasfettate con un vettore vuoto. I risultati dell'analisi con microarray di microRNA sono stati convalidati per sette dei geni, mostrati qui, mediante RT-PCR quantitativa. Dopo questa procedura, altri metodi come l'immunoprecipitazione della cromatina, il saggio di spostamento elettroforetico e un saggio differenziale possono essere eseguiti per verificare che questo fattore di trascrizione si leghi e attivi il promotore di un particolare gene mirror.Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come integrare l'analisi di bioinformatica, i dati disponibili pubblicamente e il silenziamento di un fattore di trascrizione mediante l'approccio con shRNA per determinare in che modo questo fattore di trascrizione regola l'espressione dei geni di microRNA.

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Questo rapporto descrive un metodo veloce e affidabile per la convalida di mRNA bersaglio di Mirna cellulari. Il metodo utilizza biotinilati sintetici basati su Locked Nucleic Acid LNA miRNA imita per catturare destinazione mRNA. Successivamente, biglie magnetiche rivestite con streptavidina sono impiegati per pulldown il bersaglio mRNA per quantificazione da reazione a catena della polimerasi qPCR.

Biotina-based Pulldown Assay Validate mRNA Mirna obiettivi del cellulare

Abbiamo sviluppato un saggio reporter di biogenesi di microRNA intronico da utilizzare in cellule in vitro con quattro plasmidi: uno con miRNA intronico, uno con il bersaglio, uno per sovraesprimere una proteina regolatrice e uno per Renilla luciferasi. Il miRNA è stato elaborato e potrebbe controllare l'espressione della luciferasi legandosi alla sequenza bersaglio.

Un saggio reporter per analizzare la maturazione dei microRNA intronici in cellule di mammifero

Qui descrivere un ottimizzato trascrittasi inversa multiplex PCR quantitativa (QRT-PCR) protocollo in combinazione con una piattaforma microfluidica come un efficace costi e tempi high-throughput screening per microRNA (miRNA) livelli di espressione, soprattutto quando si lavora con quantità limitate di campione.

Alta MicroRNA profiling Throughput: Multiplex Ottimizzato qRT-PCR a scala nanoliter sul Fluidigm dinamica IFCS ArrayTM

Non distruttivo di visualizzazione volume può essere raggiunto solo con tecniche tomografiche, di cui il più efficiente è la tomografia a raggi X micro computerizzata (TAC).

Ad alta risoluzione di immagini 3D Ex-Vivo I campioni biologici da Micro CT

Si descrivono l'uso di un stopped-flow strumento per studiare sia riduttive e ossidativo semireazioni...

Monitoraggio dei riduttivo e ossidativa semireazioni di Flavin-Dependent monoossigenasi con Stopped-Flow Spettrofotometria

Vi presentiamo una combinazione di crio-microscopia elettronica, lipidi nanotecnologie, e analisi della struttura applicata per risolvere la struttura di membrana delle due forme di FVIII altamente omologhi: umane e suine. La metodologia sviluppata nel nostro laboratorio per organizzare elicoidale le due forme contenenti Fattore VIII ricombinante funzionali su nanotubi di lipidi carichi negativamente (LNT) è descritto.

Elicoidale Organization of Blood fattore VIII della coagulazione su Lipid nanotubi

Qui descriviamo semplici metodi per la preparazione di vescicole, l'incapsulamento di trascrizione e traduzione macchinari, e il monitoraggio della produzione di proteine. La risultante sistemi cell-free possono essere utilizzati come punto di partenza da cui costruire imita cellulari sempre più complessi.

L&#39;incapsulamento di trascrizione privo di cellule e macchinari traduzione in vescicole per la costruzione di Mimics cellulari

Scopri come i fattori di trascrizione regolano il trascrittoma dei microRNA attraverso data mining, analisi bioinformatica e silenziamento con shRNA. Questo metodo integrato offre una descrizione completa della dinamica trascrizionale.

Descrivendo un regolamento Dipendente Fattore di trascrizione del MicroRNA trascrittoma

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