Name: In vitro misurare phosphatidylethanolamine metiltransferasi attività (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-05T13:00:01.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Impara a misurare l'attività della fosfatidiletanolamina metiltransferasi (PEMT) negli estratti cellulari di Leishmania. Questo metodo radioattivo quantifica la sintesi di fosfatidilcolina senza richiedere la purificazione enzimatica.

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Questo lavoro è stato supportato dalle sovvenzioni NIH ARRA RO3 AI078145 e 1SC3GM113743 a RZ.

1. cella estratto Preparazione <ol><li> Crescere le cellule Leishmania in una bottiglia di plastica sterile, sigillato con tappo a tenuta d&#39;aria a 26 ° C in un mezzo fatto di 1x M199 supplementato con 20 mM HEPES pH7.4, 100 U / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina, 5 mg / ml eme , 0,35 g / L Naco 2 H, adenina mM 0.1, e 2 mg / ml biopterina senza agitare. Raccogliere le cellule per centrifugazione a 1.500 g per 5 minuti a 4 ° C quando raggiungono una densità cellulare di 1-2 x 10 7 / ml. </li><li> Eliminare il surnatante con una pipetta e lavare le cellule risospendendo il pellet cellulare con una pipetta sierologica a metà del volume del cultura del fosfato salino freddo tamponata (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, Na 10 mm 2 HPO 4, 1.8 KH mM 2 PO 4, pH7.4). Smaltire surnatanti cellulari secondo le linee guida di sicurezza BL2. </li><li> Centrifugare le cellule di nuovo a 1.500 g per 5 minuti a 4 ° C. Eliminare il surnatante con una pipetta. Procedere to il prossimo passo elastico, congelare il pellet di cellule in azoto liquido per la conservazione a lungo termine a -80 ° C (fino a tre mesi). </li><li> Preparare 2x tampone di lisi (0,5 M di saccarosio, 0,1 M TrisHCl, pH7.5, 2 mM EDTA, e inibitore della proteasi 2x cocktail) e tenerlo a 4 ° C su ghiaccio. </li><li> Risospendere il pellet cellulare (fresco o congelato) in volume uguale di tampone di lisi 2x. Aggiungere il volume 1x di perline di vetro. Vortex vigorosamente a 4 ° C per 10 min. </li><li> Aggiungere 2 volumi di tampone di lisi 1x e mescolare. Estratti cellulari centrifugare a 1500 xg a 4 ° C per 10 minuti a pellet cellule intatte e nuclei. </li><li> Trasferire il surnatante con una pipetta in una provetta da centrifuga fresca aperta e mantenerlo estratti cellulari in ghiaccio fino al completamento dell&#39;esperimento. </li></ol> 2. Determinare la concentrazione della proteina del estratto cellulare utilizzando proteine ​​Stima Kit Come bicinconinico Acid Assay <ol><li> Preparare la soluzione di acido bicinconinico (BCA) (1 ml / tubo) mescolando il BCA e rame (II) sulfate in un rapporto di 49: 1 (v / v). </li><li> Preparare gli standard proteici di 0, 10, 20, 30, 40, 50, e 60 ug / ml diluendo un / ml albumina di siero bovino (BSA) soluzione madre 10 mg in 1 ml aliquote della soluzione BCA. </li><li> Aggiungere 2 ml di cellule estratti in 1 ml di soluzione di BCA in duplicato. Incubare standard e campioni di proteine ​​per 10 minuti in un bagno d&#39;acqua a 60 ° C pre-riscaldato. </li><li> Campioni di trasferimento di ghiaccio per 3 min. Misurare l&#39;assorbanza degli standard e dei campioni di proteine ​​con uno spettrofotometro ad una lunghezza d&#39;onda di 562 nm. </li><li> Calcolare la concentrazione proteica degli estratti cellulari utilizzando lo standard BSA come riferimento, come descritto nel protocollo del produttore. Diluire estratti cellulari ad una concentrazione proteica di 10 mg / ml con tampone di lisi 1x. </li></ol> 3. enzimatica Assay in 200 pl per Tubo NOTA: Eseguire le seguenti operazioni in una cappa chimica. <ol><li> Testare ciascun campione in duplicato in 15 mltubo conico. Preparare 20 ml 1 M TrisHCl pH 7,5 per tubo e tenerlo in ghiaccio. Preparare 2 ml di cloroformio / metanolo (1: 1 (v / v); soluzione di stop) a temperatura ambiente per ogni provetta. </li><li> Pipettare 20 ml di 1 M pH 7,5 TrisHCl in ciascun tubo da 15 ml su ghiaccio. </li><li> Seguire le linee guida di sicurezza di radiazioni da qui in poi. Aggiungere l&#39;equivalente di 0,06 mM (0,2 pCi) S - [Methyl- 3 H] adenosil-L-metionina e 50 mM freddo SAM per provetta per un totale di 50,06 mM di SAM. Aggiungi x ml di acqua fredda dove x = 200- (20 (per il buffer) + 20 (per estratti cellulari) + volume di freddo e radioattivi SAM) per provetta. </li><li> Trasferire ogni tubo conico a 30 ° C bagno di acqua preriscaldata. Aggiungere a ciascuna provetta 20 l di estratti cellulari (pari a 200 mg di proteine) per attivare la reazione. Incubare per il tempo desiderato (da 0 a 45 min). </li><li> Arrestare la reazione aggiungendo 2 ml di cloroformio / metanolo (1: 1; v / v; soluzione di arresto) ad ogni provetta. Trasferire il tubo conico di RT (20-256; C). </li></ol> 4. lipidi Estrazione NOTA: Eseguire le seguenti operazioni in una cappa chimica. <ol><li> Aggiungere 700 ml di acqua a ciascuna provetta contenente il campione reazione enzimatica. Vortex energicamente per 30 sec. Centrifugare a 1500 xg per 5 minuti a RT per separare il organica dalla fase acquosa. </li><li> Trasferire la fase organica inferiore in un nuovo tubo da 15 ml con una pipetta. Aggiungere 1 ml di acqua per ogni &quot;fase inferiore&quot; contenente provetta e agitare vigorosamente per 30 secondi. Centrifugare nuovamente a 1.500 xg per 5 min per separare il organica dalla fase acquosa. </li><li> Trasferire la fase organica inferiore in un tubo scintillazione con una pipetta. Campioni secco sotto flusso di N 2. Smaltire le fasi d&#39;acqua contenenti la SAM radioattivo non incorporato e tubi coniche radioattive come da linee guida di radiazione. </li><li> Aggiungere 2 ml / tubo di scintillazione liquida. Misurare la radioattività incorporata con un paio di scintillazionenter secondo il protocollo dei costruttori e l&#39;uso dello strumento. </li><li> Calcolare l&#39;attività enzimatica in nmol / mg proteina usando la seguente equazione generale: valore cpm x 10 x 3 [totale (radioattivi e freddo) concentrazione di SAM (mM)] x 5 attività specifica di SAM radioattivi (Ci / mmol) x [concentrazione di SAM radioattivi (mM)] NOTA: il protocollo di cui sopra può essere modificato per una concentrazione SAM dipendente o una proteina dipendente test PEMT. Per concentrazione SAM saggio enzimatico dipendente, il tempo viene mantenuta costante (15 min, che è nel range lineare) e varie quantità di freddo SAM vengono aggiunti al dosaggio mentre per proteina dipendente dosaggio PEMT, concentrazione SAM (abbiamo scelto 0,05 mM) e tempo sono mantenuto costante (15 min). Anche il pH del tampone può essere cambiata come necessario se alcuni enzimi PEMT hanno un diverso valore ottimale del pH. </li></ol>

<ol><li>Keogh, M. R., Courtney, P. D., Kinney, A. J., Dewey, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+phospholipid+N-.methyltransferases+from+Arabidopsis+and+soybean%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of phospholipid N-.methyltransferases from Arabidopsis and soybean.</a> J Biol Chem. 284 (23), 15439-15447 (2009).</li>
<li>Geiger, O., Lopez-Lara, I. M., Sohlenkamp, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylcholine+biosynthesis+and+function+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylcholine biosynthesis and function in bacteria.</a> Biochim Biophys Acta. 1831 (3), 503-513 (2013).</li>
<li>Gao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+lipogenesis+in+white+adipose+tissue+contributes+to+the+resistance+to+high+fat+diet-induced+obesity+in+phosphatidylethanolamine+N-.methyltransferase-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Decreased lipogenesis in white adipose tissue contributes to the resistance to high fat diet-induced obesity in phosphatidylethanolamine N-.methyltransferase-deficient mice.</a> Biochim Biophys Acta. 1851 (2), 152-162 (2015).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+phosphatidylethanolamine+N-.methyltransferase+alters+plasma+VLDL+phospholipids+and+attenuates+atherosclerosis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Lack of phosphatidylethanolamine N-.methyltransferase alters plasma VLDL phospholipids and attenuates atherosclerosis in mice.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29 (9), 1349-1355 (2009).</li>
<li>Vance, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+methylation+in+mammals%3A+from+biochemistry+to+physiological+function%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Phospholipid methylation in mammals: from biochemistry to physiological function.</a> Biochim Biophys Acta. 1838 (6), 1477-1487 (2014).</li>
<li>Nishimaki-Mogami, T., Suzuki, K., Takahashi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+phosphatidylethanolamine+methylation+in+the+secretion+of+very+low+density+lipoproteins+by+cultured+rat+hepatocytes%3A+rapid+inhibition+of+phosphatidylethanolamine+methylation+by+bezafibrate+increases+the+density+of+apolipoprotein+B48-containing+lipoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">The role of phosphatidylethanolamine methylation in the secretion of very low density lipoproteins by cultured rat hepatocytes: rapid inhibition of phosphatidylethanolamine methylation by bezafibrate increases the density of apolipoprotein B48-containing lipoproteins.</a> Biochim Biophys Acta. 1304 (1), 21-31 (1996).</li>
<li>Noga, A. A., Zhao, Y., Vance, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+unexpected+requirement+for+phosphatidylethanolamine+N-.methyltransferase+in+the+secretion+of+very+low+density+lipoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">An unexpected requirement for phosphatidylethanolamine N-.methyltransferase in the secretion of very low density lipoproteins.</a> J Biol Chem. 277 (44), 42358-42365 (2002).</li>
<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+repression+of+phosphatidylethanolamine+N-.methyltransferase+%28PEMT%29+in+BRCA1-mutated+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Epigenetic repression of phosphatidylethanolamine N-.methyltransferase (PEMT) in BRCA1-mutated breast cancer.</a> Oncotarget. 5 (5), 1315-1325 (2014).</li>
<li>Cui, Z., Houweling, M., Vance, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+rat+hepatoma+cell+growth+by+expression+of+phosphatidylethanolamine+N-.methyltransferase-2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Suppression of rat hepatoma cell growth by expression of phosphatidylethanolamine N-.methyltransferase-2.</a> J Biol Chem. 269 (40), 24531-24533 (1994).</li>
<li>Cui, Z., Shen, Y. J., Vance, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inverse+correlation+between+expression+of+phosphatidylethanolamine.N-.methyltransferase-2+and+growth+rate+of+perinatal+rat+livers%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Inverse correlation between expression of phosphatidylethanolamine.N-.methyltransferase-2 and growth rate of perinatal rat livers.</a> Biochim Biophys Acta. 1346 (1), 10-16 (1997).</li>
<li>Minder, A. C., de Rudder, K. E., Narberhaus, F., Fischer, H. M., Hennecke, H., Geiger, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylcholine+levels+in.Bradyrhizobium+japonicum.+membranes+are+critical+for+an+efficient+symbiosis+with+the+soybean+host+plant%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylcholine levels in.Bradyrhizobium japonicum. membranes are critical for an efficient symbiosis with the soybean host plant.</a> Mol Microbiol. 39 (5), 1186-1198 (2001).</li>
<li>Kodaki, T., Yamashita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+phosphatidylethanolamine+methylation+pathway.+Cloning+and+characterization+of+two+distinct+methyltransferase+genes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Yeast phosphatidylethanolamine methylation pathway. Cloning and characterization of two distinct methyltransferase genes.</a> J Biol Chem. 262 (32), 15428-15435 (1987).</li>
<li>Tanaka, Y., Amano, F., Maeda, M., Nishijima, M., Akamatsu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+properties+of+phosphatidyl-N-.monomethylethanolamine+N-.methyltransferase%2C+the+enzyme+catalyzing+the+second+and+the+third+steps+in+the+phosphatidylethanolamine+N-.methyltransferase+system%2C+from+mouse+liver+microsomes%5BTitle%5D)+AND+%22Jpn+J+Med+Sci+Biol%22%5BJournal%5D)">Purification and properties of phosphatidyl-N-.monomethylethanolamine N-.methyltransferase, the enzyme catalyzing the second and the third steps in the phosphatidylethanolamine N-.methyltransferase system, from mouse liver microsomes.</a> Jpn J Med Sci Biol. 43 (3), 59-73 (1990).</li>
<li>Bibis, S. S., Dahlstrom, K., Zhu, T., Zufferey, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Leishmania+major+phosphatidylethanolamine+methyltransferases+LmjPEM1+and+LmjPEM2+and+their+inhibition+by+choline+analogs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Characterization of Leishmania major phosphatidylethanolamine methyltransferases LmjPEM1 and LmjPEM2 and their inhibition by choline analogs.</a> Mol Biochem Parasitol. 196 (2), 90-99 (2014).</li>
<li>deRudder, K. E., Thomas-Oates, J. E., Geiger, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhizobium+meliloti.+mutants+deficient+in+phospholipid+N-.methyltransferase+still+contain+phosphatidylcholine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Rhizobium meliloti. mutants deficient in phospholipid N-.methyltransferase still contain phosphatidylcholine.</a> J Bacteriol. 179 (22), 6921-6928 (1997).</li>
<li>Aktas, M., Narberhaus, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+characterization+of+the+enzyme+properties+of+the+phospholipid+N-.methyltransferase+PmtA+from+Agrobacterium+tumefaciens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">In vitro characterization of the enzyme properties of the phospholipid N-.methyltransferase PmtA from Agrobacterium tumefaciens.</a> J Bacteriol. 191 (7), 2033-2041 (2009).</li>
<li>Ridgway, N. D., Vance, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylethanolamine+N-.methyltransferase+from+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylethanolamine N-.methyltransferase from rat liver.</a> Methods Enzymol. 209, 366-374 (1992).</li>
<li>Gaynor, P. M., Carman, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylethanolamine+methyltransferase+and+phospholipid+methyltransferase+activities+from+Saccharomyces+cerevisiae.+Enzymological+and+kinetic+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylethanolamine methyltransferase and phospholipid methyltransferase activities from Saccharomyces cerevisiae. Enzymological and kinetic properties.</a> Biochim Biophys Acta. 1045 (2), 156-163 (1990).</li>
<li>Arondel, V., Benning, C., Somerville, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+functional+expression+in+Escherichia+coli.+of+a+gene+encoding+phosphatidylethanolamine+methyltransferase+%28EC+2.1.1.17%29+from+Rhodobacter+sphaeroides%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Isolation and functional expression in Escherichia coli. of a gene encoding phosphatidylethanolamine methyltransferase (EC 2.1.1.17) from Rhodobacter sphaeroides.</a> J Biol Chem. 268 (21), 16002-16008 (1993).</li>
<li>Wessel, M., Klusener, S., Godeke, J., Fritz, C., Hacker, S., Narberhaus, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+of+Agrobacterium+tumefaciens.+requires+phosphatidylcholine+in+the+bacterial+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Virulence of Agrobacterium tumefaciens. requires phosphatidylcholine in the bacterial membrane.</a> Mol Microbiol. 62 (3), 906-915 (2006).</li>
<li>Klusener, S., Aktas, M., Thormann, K. M., Wessel, M., Narberhaus, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+physiological+relevance+of+Agrobacterium+tumefaciens.+phosphatidylcholine+biosynthesis+genes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Expression and physiological relevance of Agrobacterium tumefaciens. phosphatidylcholine biosynthesis genes.</a> J Bacteriol. 191 (1), 365-374 (2009).</li>
<li>Henderson, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+the+gene+encoding+Leishmania+donovani.S.-adenosylhomocysteine+hydrolase%2C+a+potential+target+for+antiparasitic+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Cloning of the gene encoding Leishmania donovani.S.-adenosylhomocysteine hydrolase, a potential target for antiparasitic chemotherapy.</a> Mol Biochem Parasitol. 53 (1-2), 169-183 (1992).</li>
<li>Koszalka, G. W., Krenitsky, T. A. 5'-Methylthioadenosine (MTA) phosphorylase from promastigote of Leishmania donovani. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKoszalka%2C+GW+%22Purine+and+Pyrimidine+Metabolism+in+Man+V%2C+Adv+Exp+Med+Biol%22">Purine and Pyrimidine Metabolism in Man V, Adv Exp Med Biol</a>. Nyhan, W. L., Thompson, L. F., Watts, R. W. E. 131, Springer US. 559-563 (1986).</li>
<li>Biastoff, S., Teuber, M., Zhou, Z. S., Dräger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric+activity+measurement+of+a+recombinant+putrescine+N.-methyltransferase+from+Datura+stramonium%5BTitle%5D)+AND+%22Planta+Med%22%5BJournal%5D)">Colorimetric activity measurement of a recombinant putrescine N.-methyltransferase from Datura stramonium.</a> Planta Med. 72 (12), 1136-1141 (2006).</li>
<li>Hendricks, C. L., Ross, J. R., Pichersky, E., Noel, J. P., Zhou, Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enzyme-coupled+colorimetric+assay+for+S.-adenosylmethionine-dependent+methyltransferases%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">An enzyme-coupled colorimetric assay for S.-adenosylmethionine-dependent methyltransferases.</a> Anal Biochem. 326 (1), 100-105 (2004).</li>
<li>Cannon, L. M., Butler, F. N., Wan, W., Zhou, Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stereospecific+colorimetric+assay+for+%28S.%2CS.%29-adenosylmethionine+quantification+based+on+thiopurine+methyltransferase-catalyzed+thiol+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A stereospecific colorimetric assay for (S.,S.)-adenosylmethionine quantification based on thiopurine methyltransferase-catalyzed thiol methylation.</a> Anal Biochem. 308 (2), 358-363 (2002).</li>
<li>Hoffman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatographic+analysis+of+the+chiral+and+covalent+instability+of+S.-adenosyl-L-methionine%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Chromatographic analysis of the chiral and covalent instability of S.-adenosyl-L-methionine.</a> Biochemistry. 25 (15), 4444-4449 (1986).</li>
<li>Wu, S. E., Huskey, W. P., Borchardt, R. T., Schowen, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chiral+instability+at+sulfur+of+S.-adenosylmethionine%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Chiral instability at sulfur of S.-adenosylmethionine.</a> Biochemistry. 22 (12), 2828-2832 (1983).</li>
<li>Dorgan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enzyme-coupled+continuous+spectrophotometric+assay+for+S.-adenosylmethionine-dependent+methyltransferases%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">An enzyme-coupled continuous spectrophotometric assay for S.-adenosylmethionine-dependent methyltransferases.</a> Anal Biochem. 350 (2), 249-255 (2006).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati

Questa semplice, rapido test PEMT consente la quantificazione di forme metilate di PE che deriva dal trasferimento di gruppi metilici radioattive da SAM su PE utilizzando estratto cellulare tutto come fonte proteica. È veloce, sensibile, riproducibile e adatto anche per enzimi purificati 17. Monomethyl- o dimetil-PE possono essere aggiunti al test se il metiltransferasi di interesse specifico per questi substrati anziché PE 12,13,18,19. Se viene utilizzato purificato enzima PEMT, PE può essere aggi...

Fosfatidiletanolamina metiltransferasi (PEMT) enzimi catalizzano l&#39;attacco covalente di uno o più gruppi metilici utilizzando S -adenosylmethionine (SAM) come il gruppo metilico donatore sul PE, PE o monometil-dimetil-PE dare monometil-PE, dimetil-PE e / o fosfatidilcolina (PC). Questi enzimi sono quasi onnipresenti nelle cellule animali e funghi. Possono anche essere trovati in alcune piante 1 e circa il 10% dei batteri, in particolare quelli che interagiscono con eucarioti 2. PEMTs sono rilevanti alla biologia della cellula non solo contribuendo alla produzione di PC, che è la classe principale lipidi nelle cellule animali, ma anche compiendo altre importanti funzioni cellulari. Nei mammiferi, PEMTs sono espressi principalmente nel fegato dove sono richiesti per il normale secrezione di lipoproteine ​​a bassissima densità e contribuiscono anche all&#39;obesità indotta dalla dieta 3, aterosclerosi 4, e l&#39;insulina resistonoANCE 5. Inoltre, PEMT mammiferi sono espressi anche negli adipociti, anche se a livelli più bassi, e partecipare a deposizione di grasso 6, 7. Ruolo PEMT nello sviluppo del cancro 8, 9 apoptosi, e la crescita delle cellule 10 sono stati anche dimostrato. Nei batteri, enzimi PEMT hanno dimostrato di essere importante per la normale crescita delle cellule 2, la virulenza 2, e simbiosi con la pianta ospite 11. L&#39;obiettivo e le motivazioni del presente protocollo è quello di misurare l&#39;attività PEMT da estratti cellulari interi, senza la necessità di purificare l&#39;enzima. Due protocolli distinti sono stati sviluppati per misurare l&#39;attività PEMT. Il primo e più comune misura il trasferimento del gruppo metilico triziata da SAM radioattivo su PE, che è l&#39;argomento di questo articolo. Questo protocollo è stato originariamente sviluppato per misurare l&#39;attività PEMT dal lievito 12 e cellule di mammifero (fegato) 13 per ottenere un understANDing di biosintesi PC in queste cellule, nonché per determinare la specificità di questi enzimi. Successivamente, questa tecnica è stata applicata ad altri tipi di cellule, come i batteri 2 (utilizzando un valore pH basico per il test se 15) e protozoi parassiti 14. Questa tecnica può essere utilizzata con estratti cellulari interi nonché enzima purificato, e può potenzialmente essere applicato a qualsiasi sistema di estratto cellulare. Un test non radioattivo è stato progettato che si basa sulla quantificazione enzimatica di S -adenosylhomocysteine, il prodotto di transmetilazione SAM 16. Quest&#39;ultimo test può essere più conveniente in quanto non comporta radioattività ma è adatto solo per gli enzimi purificati.

<table><tbody><tr><td>S-[Metil-3H]adenosil-L-metionina (attività specifica di 5-15 Ci/mMole)</td><td>Perkin Elmer</td><td>NET155050UC</td><td>Aliquotare il reagente e congelare a -20 &deg; C; seguire le linee guida sulla sicurezza delle radiazioni durante l'utilizzo di questo reagente</td></tr><tr><td>Cocktail di inibitori della proteasi</td><td>Roche Life Sciences</td><td>11836170001</td><td>diluirlo fresco&nbsp;</td></tr><tr><td>Perle di vetro, lavate con acido, 425-600 mm</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di acido bicinconnico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B9643</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di rame (II)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2284</td><td></td></tr><tr><td>Contatore a scintillazione MicroBeta2 con 1-rivelatore</td><td>Perkin Elmer&nbsp;</td><td>2450-0010</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro Biomate 3</td><td>Thermo Scientific</td><td>840208300</td><td></td></tr><tr><td>soluzione madre BSA (10 mg/ml)</td><td>New England Biolabs</td><td>B9001S</td><td></td></tr><tr><td>Liquido a scintillazione&nbsp;</td><td>Prodotto della ricerca International Corp</td><td>111198</td><td></td></tr><tr><td>cloruro di S-(5'-adenosil)-L-metionina (cloridrato)&nbsp;</td><td>Cayman Chemicals</td><td>13956</td><td>diluire il reagente in 20 mM di HCl e congelare le aliquote a -80 gradi; C&nbsp;</td></tr></tbody></table>

in vitro misurare phosphatidylethanolamine metiltransferasi attività

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

Le fosfatidiletanolammina metiltransferasi sono enzimi biosintetici che catalizzano il trasferimento di uno o più gruppi metilici dalla S-adenosil-L-metionina alla fosfatidiletanolammina, monometil-fosfatidiletanolammina o dimetil-fosfatidiletanolammina per dare monometil-fosfatidiletanolammina, dimetil-fosfatidiletanolammina o fosfatidilcolina. Questi enzimi sono onnipresenti nelle cellule animali, nei funghi e si trovano anche in circa il 10% dei batteri. Svolgono varie funzioni importanti nella fisiologia cellulare oltre al loro ruolo diretto nel metabolismo dei lipidi, come nell'insulino-resistenza, nel diabete, nell'aterosclerosi, nella crescita cellulare o nella virulenza. Il presente manoscritto riporta un semplice saggio enzimatico cell-free che misura il trasferimento di gruppi metilici triziati da S-[Metil-3H]adenosil-L-metionina su fosfatidiletanolammina utilizzando estratti di cellule intere come fonte enzimatica. Le forme metilate risultanti di fosfatidiletanolammina sono idrofobiche e quindi possono essere separate dalla S-[metil-3H]adenosil-L-metionina solubile in acqua mediante estrazione organica. Questo test può essere potenzialmente applicato a qualsiasi altro tipo di cellula e utilizzato per testare inibitori/farmaci specifici per una fosfatidiletanolammina metiltransferasi di interesse senza la necessità di purificare l'enzima.

La figura 1 mostra un tempo dipendente PEMT dosaggio, che è stata effettuata con Leishmania estratto cellula intera come fonte dell&#39;enzima utilizzando PE endogena come substrato. La quantità di radioattività nella fase organica è stata quantificata mediante conteggio a scintillazione. I numeri ottenuti sono stati utilizzati per calcolare la quantità di gruppi metilici triziata trasferiti verso PE. L&#39;attività PEMT era lineare per circa 20 min. È quindi ra...

Il presente rapporto descrive un test enzimatico in vitro per misurare l'attività della fosfatidiletanolammina metiltransferasi utilizzando estratti cellulari di Leishmania. Questo test si basa sul trasferimento di un gruppo metilico radioattivo dalla S-[metil-3H]adenosil-L-metionina alla fosfatidiletanolammina endogena.

In vitro misurare phosphatidylethanolamine metiltransferasi attività

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from ...

L'obiettivo generale di questa metodologia è quantificare l'attività della fosfatidiletanolammina metiltransferasi o PEMT da estratti cellulari totali. Con questo metodo è possibile rispondere a domande fondamentali nel campo del metabolismo lipidico, come l'importanza delle fosfatidiletanolammina metiltransferasi nella biosintesi della fosfatidilcolina. Il principale vantaggio di questo protocollo è che può essere misurato direttamente da estratti cellulari totali e non richiede la purificazione dell'enzima.Pertanto, questo protocollo può fornire informazioni su come il parassita sintetizza la sua lipidica più abbondante, la fosfatidilcolina. Questo protocollo può essere applicato anche ad altri tipi cellulari, come le cellule di mammifero e i batteri. Coltivazione delle cellule di Leishmania in una bottiglia di plastica sterile chiusa con un tappo ermetico a 26 gradi Celsius in un mezzo M199 supplementato, senza agitazione.Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 1500G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Quando raggiungono una densità cellulare di 10-20 milioni di cellule per millilitro. Dopo aver rimosso il soprannatante con una pipetta, lavare le cellule risospe

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Questo protocollo descrive la preparazione di un substrato sintetico per il...

Test in vitro Metilazione tRNA con l&#39;Entamoeba histolytica del DNA e Dnmt2 tRNA metiltransferasi (Ehmeth) Enzyme

Questo video mostra un test enzimatico basato sulla cromatografia su strato sottile per determinare l'attività della pirofosfochinasi utilizzando nucleotidi radiomarcati. Il metodo fornisce informazioni sulla sintesi nucleotidica e sulle reazioni di fosfotrasferimento.

Saggio dell'attività enzimatica basato sulla cromatografia su strato sottile: una tecnica per determinare l'attività della pirofosfochinasi in vitro utilizzando la cromatografia su strato sottile

Descriviamo un protocollo di base per quantificare l'attività dell'ATPasi in vitro. Questo protocollo può essere ottimizzato in base al livello di attività e ai requisiti di una data ATPasi purificata.

misurazione<em&gt; In Vitro</em&gt; Attività ATPasi per enzimatica Caratterizzazione

Molte (fosfo)lipasi previste sono scarsamente caratterizzate per quanto riguarda le loro specificità di substrato e le funzioni fisiologiche. Qui forniamo un protocollo per ottimizzare le attività enzimatiche, cercare substrati naturali e proporre funzioni fisiologiche per questi enzimi.

La definizione del substrato Specificità per lipasi e fosfolipasi candidati

C'è una domanda per fare pre-clinica test per una nuova classe di farmaci "orfani" chiamato chaperoni farmacologici riproducibile, veloce ed efficiente. Abbiamo sviluppato un test cellulari semplice, altamente standardizzate e versatile cultura alla schermata per i pazienti eleggibili come pure droghe romanzo chaperoni farmacologici.

In Vitro Misurazione di enzima per Test farmacologici Chaperone reattività in Fabry e malattia di Pompe

Qui, descriviamo un metodo per purificare enzimi pyrophosphokinase istidina-etichettate e utilizzando la cromatografia su strato sottile di radiomarcato substrati e prodotti di test per l' attività enzimatica in vitro. L'analisi di attività dell'enzima è ampiamente applicabile a qualsiasi chinasi, ciclasi del nucleotide o reazione di fosforo-trasferimento cui meccanismo include idrolisi di trifosfato del nucleotide.

Una purificazione e l'analisi di attività In Vitro per un ppGpp (p) sintetasi da Clostridium difficile

Qui, viene descritto un saggio in vitro privo di anticorpi per l'analisi diretta dell'attività di metiltransferasi sull'RNA transscritto sintetico o in vitro.

Analisi anticorp-free per l'analisi dell'attività di RNA methyltransferase

Palmitoylation comporta l'incorporazione di una moiety palmitativa 16-carbonio ai residui di cisteina delle proteine bersaglio in modo reversibile. Qui, descriviamo un approccio biochimico, l'analisi ApegS (acyl-PEGyl exchange gel shift), per studiare lo stato di palmitoylation di qualsiasi proteina di interesse nei lismi cerebrali dei topi.

Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Analisi per la Determinazione Quantitativa della Palmitoylation delle Proteine della Membrana Cerebrale

Presentato qui è un saggio di fluorescenza sensibile per monitorare l'attività dell'apolipoproteina N-aciltransferasi utilizzando il peptide diacilglicerile e gli alchino-fosfolipidi come substrati con click-chemistry.

Saggio fluorometrico basato sulla chimica dei clic per l'apolipoproteina N-aciltransferasi dalla caratterizzazione enzimatica allo screening ad alta produttività

La capacità di valutare l'impegno target da parte degli inibitori candidati nelle cellule intatte è fondamentale per la scoperta di farmaci. Questo protocollo descrive un saggio di spostamento termico cellulare in formato 384 che rileva in modo affidabile l'impegno del bersaglio cellulare degli inibitori che prendono di mira SHP2 di tipo selvaggio o le sue varianti oncogeniche.

Valutazione dell'impegno del bersaglio cellulare da parte degli inibitori della fosfatasi SHP2 (PTPN11)

Le DNA metiltransferasi sono potenziali bersagli di farmaci antitumorali. Qui, viene presentato un protocollo per valutare piccole molecole per l'inibizione della DNA metiltransferasi. Questo test utilizza un'endonucleasi per accoppiare la metilazione del DNA alla generazione di fluorescenza e consente di monitorare l'attività enzimatica in tempo reale.

Saggio di metilazione del DNA accoppiato a endonucleasi a fluorescenza continua per lo screening degli inibitori della DNA metiltransferasi

Impara a misurare l'attività della fosfatidiletanolamina metiltransferasi (PEMT) negli estratti cellulari di Leishmania. Questo metodo radioattivo quantifica la sintesi di fosfatidilcolina senza richiedere la purificazione enzimatica.

In vitro misurare phosphatidylethanolamine metiltransferasi attività

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