Name: Cortex, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, laterale del setto Nucleus- e Striatum specifici In Utero Elettroporazione in C57BL / 6 del mouse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: Scopri l'elettroporazione in utero per manipolare cellule specifiche nel sistema nervoso centrale del topo C57BL/6. Questa tecnica consente di studiare lo sviluppo cerebrale e le vie di segnalazione senza generare topi geneticamente modificati.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Tecnico supportato da Melanie Pfeifer e Nikolai Schmarowski (Istituto di Anatomia Microscopica e Neurobiologia, Centro Medico Universitario di Magonza).

Etica Dichiarazione: Il trattamento dei topi e le procedure sperimentali sono state condotte in conformità agli orientamenti europei, nazionali e istituzionali per la cura degli animali. 1. In Utero Elettroporazione Nota: In utero elettroporazione è stato eseguito come precedentemente pubblicato 12,14. Pertanto, il metodo è descritto brevemente nel seguito (figura 1). <ol><li> Preparativi <ol><li> Preparare veloce verde soluzione priva di endotossine color avanzato trasfezione qualità plasmide (contenente 1,5 pCAGGS) come descritto in precedenza 12. </li><li> Tirare e macinare (35 ° angolo) capillari di vetro borosilicato (0,8-0,9 diametro) per preparazioni iniettabili. </li><li> Sterilizzare gli strumenti. </li></ol></li><li> Chirurgia <ol><li> Somministrare analgesici (carprofen, 4 mg / kg di peso corporeo, sc, 24 ore) deposito di almeno 30 minuti prima di iniziare l&#39;intervento chirurgico. </li><li> Mantenere la lunghezza dellaanestesia ad un massimo di 35-45 min (Fase III - fase dell&#39;anestesia chirurgici secondo Guedel 15 - massima 25-30 min). </li><li> Anestetizzare topi cronometrati in gravidanza con isoflurano (induzione in una camera a 2,8%, la chirurgia tramite maschera: 2,5%). Confermare l&#39;anestesia da non responsività ai piedi-pizzico. </li><li> Applicare pomata occhio per prevenire la secchezza oculare durante l&#39;anestesia. </li><li> Sterilizzare l&#39;area chirurgica con 7,5% di soluzione Providone-iodio e coprire il mouse con garza sterile (umido con una soluzione allo 0,9% di alcool benzilico soluzione fisiologica), con solo l&#39;area chirurgica esposta. </li><li> Tagliare aprire la cavità addominale con un bisturi (incisione cutanea: 1,5-2 cm, incisione muscolo: 1-1,5 cm). </li><li> Preservare la cavità addominale aperta da secchi da inumidire con soluzione salina riscaldata alcool benzilico allo 0,9% o altra soluzione isotonica sterile, come indicato dal personale veterinario o del comitato. </li><li> Estrarre attentamente corna uterine (con pinze ad anello, non toccare l&#39;utero con le ditaS). </li></ol></li><li> L&#39;iniezione di DNA ed elettroporazione. Nota: I dettagli esatti per il targeting regioni specifiche sono indicati nella sezione 2. <ol><li> Iniettare lentamente la soluzione di DNA colorato nel ventricolo come indicato nella figura 1 e la sezione 2 tramite i capillari borosilicato preparati. </li><li> Applicare la tensione appropriata per il corrispondente stadio embrionale (ad es., 36-38 V per E14) tramite elettrodi specializzati forcipe tipo platino (ciclo intervallo di lunghezza 50 msec, intervallo di pausa 950 msec). Pulse le palette elettroporazione durante l&#39;applicazione della tensione per minimizzare i danni della parete uterina. </li></ol></li><li> Messaggio elettroporazione / assistenza post-operatoria <ol><li> Ricollocare accuratamente le corna uterine nella cavità addominale. </li><li> Suturare il muscolo e l&#39;incisione cutanea separatamente. </li><li> Lasciate che il resto del mouse su un dispositivo di supporto per il recupero termico. </li><li> Sorvegliare il mouse durante il recupero (comportamento, alimentazione econsumo di acqua), 4 ore, 24 ore e 48 ore dopo l&#39;intervento chirurgico. Se necessario, applicare analgesici supplementari (carprofen, 4 mg / kg di peso corporeo, 24 ore deposito) per altri 2 giorni. </li></ol></li></ol> 2. Trasfezione di aree cerebrali specifiche Nota: La posizione del polo positivo è mostrato come l&#39;angolo tra la linea centrale verticale attraverso il ventricolo riempito con la soluzione di DNA (ventricolo destro o terzo) e la posizione del polo positivo. Durante il riempimento del ventricolo sinistro le posizioni sono speculare. In Figura 4 sono mostrate le posizioni primordiale dell&#39;orecchio, che forniscono importanti punti di riferimento. <ol><li> Trasfezione di aree corticali (Figura 2A, Tabella 1). <ol><li> Eseguire un intervento chirurgico come descritto nella sezione 1.2. Per l&#39;elettroporazione in utero di aree corticali utilizzare embrioni E14. </li><li> Iniettare 1,5-2 microlitri DNA-soluzione contenente 4 mg di DNA nel ventricolo laterale destroattraverso il capillare borosilicato preparati. <ol><li> Posizionare accuratamente l&#39;embrione utilizzando una pinza ad anello in modo che non ci sono vasi visibili sopra il sito di puntura. </li><li> Iniettare lentamente il DNA-soluzione circa 0,75 mm coronale dalla sutura lambdoidal e 0,5 mm lateralmente dalla sutura sagittale (Figura 3). Assicurarsi che la profondità di inserimento è di 1,2 mm (E14, misurata dalla parete uterina). Verificare la presenza di una colorazione blu-verde con una demarcazione tagliente. </li></ol></li><li> Applicare tensione tramite gli elettrodi di platino forcipe tipo specializzati (ciclo intervallo di lunghezza 50 msec, tempo di pausa 950 msec). <ol><li> Utilizzare un elettrodo pala 3 o 5 mm. </li><li> Utilizzare una tensione compresa 36-38 V. </li><li> Posizionare il centro degli elettrodi solo anteriori dei primordi dell&#39;orecchio. </li><li> Per trasfettare gli angoli uso corteccia retrosplenial 330-0 °, per trasfettare la corteccia motoria 0-40 °, per trasfettare la corteccia somatosensoriale 40-95 °, per trasfettarela corteccia piriforme 95-110 ° (Figura 2A). </li></ol></li><li> Eseguire elettroporazione / assistenza post-operatoria dopo come descritto nel paragrafo 1.4. Sacrifica i topi e analizzare gli embrioni 4 giorni dopo l&#39;elettroporazione (E18), come descritto nella sezione 3. </li></ol></li><li> Transfection dell&#39;ippocampo (Figura 2B, Tabella 1). <ol><li> Eseguire un intervento chirurgico come descritto nella sezione 1.2. Per l&#39;elettroporazione in utero di formazione dell&#39;ippocampo utilizzare embrioni E15. </li><li> Iniettare 2 microlitri DNA-soluzione contenente 4 mg di DNA nel ventricolo laterale destro attraverso il capillare borosilicato preparati. </li><li> Applicare tensione tramite gli elettrodi di platino forcipe tipo specializzati (ciclo intervallo di lunghezza 50 msec, tempo di pausa 950 msec). <ol><li> Utilizzare un elettrodo pala 3 o 5 mm. </li><li> Utilizzare una tensione compresa 38-40. </li><li> Posizionare il centro del polo negativo appena anteriore del primordio orecchio e il centro of il polo positivo al centro della primordium orecchio. </li><li> Per trasfettare giro dentato utilizzano angoli 190-210 °, per trasfettare il Ammonis cornu (CA) 3 210-230 °, per trasfettare il CA2 230-250 °, per trasfettare il CA1 250-275 ° (Figura 2B). </li></ol></li><li> Eseguire elettroporazione / assistenza post-operatoria dopo come descritto nel paragrafo 1.4. Eseguire l&#39;analisi dopo la formazione dell&#39;ippocampo completa (dopo la nascita, p21), come descritto nella sezione 3. </li></ol></li><li> Transfection del laterali nucleo settale e striato (Figura 2C, tabella 1) Nota: Gli angoli si sovrappongono con quelli transfecting l&#39;ippocampo. Per trasfettare efficacemente il nucleo settale laterale e striato senza indesiderate ippocampo transfezione fasi precedenti embrionali (E12) devono essere utilizzati. <ol><li> Eseguire un intervento chirurgico come descritto nella sezione 1.2. Per l&#39;elettroporazione in utero del nucleo settale laterale e striatum utilizzare embrioni E12. </li><li> Iniettare 1 ml di DNA-soluzione contenente 4 mg di DNA nel ventricolo laterale destro attraverso il capillare borosilicato preparati. </li><li> Applicare tensione tramite gli elettrodi di platino forcipe tipo specializzati (ciclo intervallo di lunghezza 50 msec, tempo di pausa 950 msec). <ol><li> Utilizzare un elettrodo 0,5 mm. </li><li> Utilizzare 33 V. </li><li> Posizionare il centro degli elettrodi a livello dei primordi dell&#39;orecchio. </li><li> Per trasfettare le uso angoli del setto nucleo laterali 100-170 °, per trasfettare striato 170-240 ° (Figura 2C). </li></ol></li><li> Eseguire elettroporazione / assistenza post-operatoria dopo come descritto nel paragrafo 1.4. Sacrifica i topi e analizzare gli embrioni 6 giorni dopo l&#39;elettroporazione (E18), come descritto nella sezione 3. </li></ol></li><li> Trasfezione del talamo e ipotalamo (Figura 2D, Tabella 1) <ol><li> Eseguire un intervento chirurgico come descritto nella sezione 1.2. Per l&#39;in utero elettroporazione delle talamo e ipotalamo uso E12-E13 embrioni. </li><li> Iniettare 1-1.5-DNA microlitri soluzione contenente 4 mg DNA nel ventricolo laterale (sinistro o destro) attraverso il capillare borosilicato preparati. Attendere 2-3 minuti, fino a quando la soluzione viene diffuso nel terzo ventricolo. In alternativa iniettare direttamente nel terzo ventricolo. Nota: Questo migliora la specificità, ma potrebbe causare un tasso di sopravvivenza ridotta (alto rischio di danni). </li><li> Applicare tensione tramite gli elettrodi di platino forcipe tipo specializzati (ciclo intervallo di lunghezza 50 msec, tempo di pausa 950 msec). <ol><li> Utilizzare un elettrodo 0,5 o 3 mm. </li><li> Utilizzare una tensione compresa 33-35 V. </li><li> Posizionare il centro degli elettrodi appena posteriore i primordi dell&#39;orecchio. </li><li> Per trasfettare gli angoli uso talamo 25-40 °, per trasfettare l&#39;ipotalamo 90-180 ° (Figura 2D). </li></ol></li><li> Eseguire posta elettroporazione / assistenza post-operatoria come described nella sezione 1.4. Sacrifica i topi e analizzare gli embrioni 6 giorni dopo l&#39;elettroporazione (E18), come descritto nella sezione 3. </li></ol></li></ol> 3. Fissazione perfusione <ol><li> Preparativi <ol><li> Warm 4% paraformaldeide (PFA) a 37 ° C. </li><li> Riempire una siringa da 50 ml con PBS (4 ° C) e una seconda siringa con riscaldato PFA. Evitare le bolle. </li><li> Collegare le siringhe a un rubinetto a tre vie. Collegare il terzo fine di un set di infusione alato (farfalla). </li><li> Lavare il set di infusione alato con PBS. </li></ol></li><li> Perfusione <ol><li> Profondamente anestetizzare topi (gravidanza o postnatale trasfettate) con l&#39;applicazione sottocutanea di ketamina cloridrato (60 mg / kg) e xilazina (7,5 mg / kg). </li><li> Confermare la fase chirurgica tolleranza refrattarietà ai piedi-pizzico. </li><li> Aprire la cavità addominale appena sotto la gabbia toracica. </li><li> Tagliare con cautela la membrana. </li><li> Aprire con cautela la gabbia toracica mediante un taglio sull&#39;esito ach fino alla clavicola. </li><li> Inserire la punta della farfalla nella camera del cuore sinistro (partendo dalla punta del cuore). </li><li> Tagliare l&#39;appendice atriale sinistra. </li><li> Lentamente profumato il mouse con PBS (circa 10 ml). </li><li> Accendere il rubinetto a tre vie. </li><li> Profumato il mouse con 5-10 ml 4% PFA. </li><li> Decapitare il mouse utilizzando le forbici e sezionare il cervello a partire dalla forame magno. Eseguire la dissezione come precedentemente pubblicato 16. </li><li> Postfixate il cervello per 2 giorni a 4% PFA. Mantenere il cervello a 4 ° C al buio. </li></ol></li></ol> 4. immunoistochimica <ol><li> Genera 70 sezioni micron (ad esempio, con un vibratome). </li><li> Opzionale: incrementare la fluorescenza con l&#39;anticorpo colorazione. <ol><li> Bloccare le sezioni per 1 ora a RT (0,1-0,2% Triton X-100, siero di capra normale 5%) </li><li> Incubare O / N con l&#39;anticorpo appropriata (anti-GFP, 1: 1.000) </li><li> Lavare 3-5 Volte con tampone fosfato 0,1 M. </li><li> Incubare 3-5 ore con l&#39;appropriato anticorpo secondario fluorescenza coniugato (Alexa Fluor 488 coniugato anti-coniglio IgG, 1: 1.000). </li><li> Opzionale: Controcolorare con 4-6-diaminodino-2-fenilindolo (DAPI, 0,2 g / ml in tampone fosfato 0,1 M) per 1 min. </li><li> Analizzare fluorescenza con un microscopio a fluorescenza appropriata. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neocortex+patterning+by+the+secreted+signaling+molecule+FGF8%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8.</a> Science. 294 (5544), 1071-1074 (2001).</li>
<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).</li>
<li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation%3A+Visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).</li>
<li>LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+and+improved+tools+for+in+utero+electroporation+studies+of+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex.</a> Cereb Cortex. 19 Suppl 1. (July), i120-i125 (1991).</li>
<li>Nakahira, E., Yuasa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+generation%2C+migration%2C+and+differentiation+in+the+mouse+hippocampal+primoridium+as+revealed+by+enhanced+green+fluorescent+protein+gene+transfer+by+means+of+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neuronal generation, migration, and differentiation in the mouse hippocampal primoridium as revealed by enhanced green fluorescent protein gene transfer by means of in utero electroporation.</a> J Comp Neurol. 483 (3), 329-340 (2005).</li>
<li>Navarro-Quiroga, I., Chittajallu, R., Gallo, V., Haydar, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term%2C+selective+gene+expression+in+developing+and+adult+hippocampal+pyramidal+neurons+using+focal+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Long-term, selective gene expression in developing and adult hippocampal pyramidal neurons using focal in utero electroporation.</a> J Neurosci. 27 (19), 5007-5011 (2007).</li>
<li>Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+delivery+to+telencephalic+inhibitory+neurons+by+directional+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation.</a> J Neurosci Methods. 143 (2), 151-158 (2005).</li>
<li>Kolk, S. M., de Mooij-Malsen, A. J., Martens, G. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+Molecular+Approach+of+in+utero+Electroporation+to+Functionally+Decipher+Endophenotypes+in+Neurodevelopmental+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22FNMOL%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal Molecular Approach of in utero Electroporation to Functionally Decipher Endophenotypes in Neurodevelopmental Disorders.</a> FNMOL. 4 (November), 37(2011).</li>
<li>Tomita, K., Kubo, K. I., Ishii, K., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disrupted-in-schizophrenia-1+%28Disc1%29+is+necessary+for+migration+of+the+pyramidal+neurons+during+mouse+hippocampal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Hu+Mol+Gen%22%5BJournal%5D)">Disrupted-in-schizophrenia-1 (Disc1) is necessary for migration of the pyramidal neurons during mouse hippocampal development.</a> Hu Mol Gen. 20 (14), 2834-2845 (2011).</li>
<li>Niwa, M., Kamiya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+DISC1+by+In+Utero+Gene+Transfer+Disturbs+Postnatal+Dopaminergic+Maturation+in+the+Frontal+Cortex+and+Leads+to+Adult+Behavioral+Deficits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Knockdown of DISC1 by In Utero Gene Transfer Disturbs Postnatal Dopaminergic Maturation in the Frontal Cortex and Leads to Adult Behavioral Deficits.</a> Neuron. 65 (4), 480-489 (2010).</li>
<li>Nakahira, E., Kagawa, T., Shimizu, T., Goulding, M. D., Ikenaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+that+ventral+forebrain+cells+migrate+to+the+cortex+and+contribute+to+the+generation+of+cortical+myelinating+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct evidence that ventral forebrain cells migrate to the cortex and contribute to the generation of cortical myelinating oligodendrocytes.</a> Dev Biol. 291 (1), 123-131 (2006).</li>
<li>Baumgart, J., Grebe, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C57BL%2F6-specific+conditions+for+efficient+in+utero+electroporation+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">C57BL/6-specific conditions for efficient in utero electroporation of the central nervous system.</a> J Neurosci Methods. 240, 116-124 (2015).</li>
<li>Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electroporation+in+the+embryonic+mouse+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protc%22%5BJournal%5D)">In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system.</a> Nat Protc. 1 (3), 1552-1558 (2006).</li>
<li>Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+in+utero+electroporation%3A+controlled+spatiotemporal+gene+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection.</a> JoVE. (54), (2011).</li>
<li>Guedel, A. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGuedel%2C+AE+%22Inhalation+anesthesia%3A+a+fundamental+guide%22">Inhalation anesthesia: a fundamental guide</a>. , Macmillan. New York. (1937).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> JoVE. (65), e3564(2012).</li>
<li>Mizutani, K., Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progenitors+resume+generating+neurons+after+temporary+inhibition+of+neurogenesis+by+Notch+activation+in+the+mammalian+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Progenitors resume generating neurons after temporary inhibition of neurogenesis by Notch activation in the mammalian cerebral cortex.</a> Development. 132 (6), 1295-1304 (2005).</li>
<li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+embryonic+mouse+central+nervous+system+cells+by+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev%2C+Growth+%26+Differ%22%5BJournal%5D)">Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation.</a> Dev, Growth & Differ. 50 (6), 507-511 (2008).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo protocollo descrive in dettaglio come trasfettare la corteccia retrospleniale, la corteccia motoria, la corteccia somatosensoriale, la corteccia piriforme, il cornu ammonis 1-3, il giro dentato, lo striato, il nucleo del setto laterale, il talamo e l'ipotalamo di topi C75BL/6. Con tutte le informazioni fornite, questo è il primo protocollo, che fornisce tutte le informazioni necessarie per ricreare facilmente le trasfezioni di queste regioni cerebrali nel topo C57BL/6. Le pubblicazioni precedenti si sono per lo pi...

Dalla prima descrizione nel 2001 da tre gruppi indipendenti 1-3 i n utero elettroporazione è diventato uno strumento standard ampiamente utilizzato per analizzare l&#39;espressione genica nel sistema nervoso centrale dei roditori. Rispetto alla generazione di topi knockout, che è, nonostante le tecniche di continuo miglioramento, ancora di tempo e denaro che consumano, i ricorsi in utero elettroporazione a causa della sua semplicità. Così, in utero elettroporazione consente GAIN- veloce ed efficiente e la perdita di funzione studi 4. Per trasfettare le regioni cerebrali, la soluzione contenente il plasmide carica negativa viene iniettato in un ventricolo. Durante l&#39;impulso elettrico, il DNA carico negativamente migra verso il polo positivo e quindi la regione trasfettate è selezionabile semplicemente modificando la posizione del polo positivo. E &#39;stato spesso dimostrato che numerose regioni del sistema nervoso centrale possono essere targeted 3,5-8. Ad esempio, recenti studi dimostrano trasfezioni specifiche del ippocampo, la corteccia piriforme o striato 9-11. Tuttavia, le informazioni sulle posizioni appropriate sono spesso solo poco standardizzato e non sono sempre facili da trasferire a diversi ceppi di topi. Trasfezione di alcune fasi embrionali è tutt&#39;altro che banale. Molti fattori influenzano devono essere presi in considerazione quando si sceglie il set-up per specifici elettroporazione in utero. In primo luogo, per trasfettare in modo ottimale i rispettivi stadi embrionali, è necessaria la conoscenza delle tensioni del caso. Tensioni elevate riducono il tasso di sopravvivenza, mentre basse tensioni riducono l&#39;efficienza di trasfezione 2,3,12. Anche le dimensioni del paddle dell&#39;elettrodo gioca un ruolo fondamentale, perché l&#39;uso di piastre di elettrodi che sono troppo grandi risultati a ridotta specificità o possono causare la morte per affetto del ritmo cardiaco 4,12,13. La applicatatensione e la dimensione e la posizione della pala dell&#39;elettrodo sono le caratteristiche più importanti da considerare, ma ci sono anche altri fattori che influenzano il risultato della elettroporazione, come la quantità applicata di DNA-soluzione. Abbiamo sviluppato un protocollo dettagliato che consente trasfezione veloce ed efficiente di varie regioni cerebrali del C57BL / 6 del mouse 12. In questo protocollo informazioni dettagliate sulle tensioni da utilizzare e la dimensione del paddle dell&#39;elettrodo per una maggiore specificità è disponibile. Inoltre, informazioni riguardanti il ​​ventricolo da riempire con raccomandazioni per la quantità di soluzione plasmide e la posizione dell&#39;elettrodo è fornito. L&#39;indicazione delle informazioni dettagliate sulla posizione in una cartina e l&#39;ulteriore visualizzazione di queste posizioni permette specifico semplice ed efficiente in utero elettroporazione della corteccia retrosplenial, la corteccia motoria, la corteccia somatosensoriale, la corteccia piriforme, tegli cornu Ammonis 1-3, il giro dentato, lo striato, il nucleo settale laterali, il talamo e l&#39;ipotalamo.

<table><tbody><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>QIAGEN</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green</td><td>Roth</td><td>0301.1</td><td></td></tr><tr><td>pCAGGS</td><td>Addgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>capillari in vetro borosilicato (diametro 0,8-0,9 mm)</td><td>Wold Precision Instrument Inc.</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano (Forene)</td><td>Abbott</td><td>PZN 4831850</td><td></td></tr><tr><td>Carprofene (Rimadyl)</td>Numero di approvazione <td>Pfizer GmbH</td><td>: 400684.00.00</td><td></td></tr><tr><td>unguento per gli occhi (Bepanthen Augen und Nasensalbe)</td><td>Bayer&nbsp;</td><td>PZN 01578681</td><td></td></tr><tr><td>0,9% alcool benzilico 0,9% soluzione salina</td><td>Farmacia del Centro medico universitario Garza di Magonza</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(ES-Kompressen)</td><td>Hartmann</td><td>407835</td><td></td></tr><tr><td>sterile 5-0 Perma-Hand Silk Suture</td><td>Ethicon Johnson & Johnson</td><td>K890H</td><td></td></tr><tr><td>pinza ad anello 1/ 1,5 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>11101-09</td><td></td></tr><tr><td>pinza ad anello 4,8/ 6 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>11106-09</td><td></td></tr><tr><td>pinza ad anello 2,2/ 3 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>11103-09</td><td></td></tr><tr><td>Pinza Adson-Seghettata dritta 12 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>1106-12</td><td></td></tr><tr><td>IrisForbici-Delicata dritta-Affilata/ Smussato 10 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>14028-10</td><td></td></tr><tr><td>Forbici Mayo-Stille-Dritto 15 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>14012-15</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinze-Inox</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo Portaago-con bloccaggio-Carburo di tungsteno 14 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>12565-14</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporator CUY21 SC&nbsp;</td><td>Nepa Gene Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FST 250 Sterilizzatore a tallone caldo</td><td>Strumenti di scienza fine</td><td>18000-45</td><td></td></tr><tr><td>Microgrinder EG-44</td><td>Narishige</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P-97 Estrattore di micropette</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Elettrodi in platino 650P 0,5 mm</td><td>Nepagene</td><td>CUY650P0,5</td><td></td></tr><tr><td>Elettrodi in platino 650P 3 mm</td><td>Nepagene</td><td>CUY650P3</td><td></td></tr><tr><td>Elettrodi di platino 650P 5 mm</td><td>Nepagene</td><td>CUY650P5</td><td></td></tr><tr><td>Elettrodi di platino 650P 10 mm</td><td>Nepagene</td><td>CUY650P10</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di anestesia</td><td>Rothacher-Medical GmbH</td><td>CV-30511-3 Vapor 19.3</td><td></td></tr><tr><td>Piastra riscaldante</td><td>Rothacher-Medical GmbH</td><td>HP-1M</td><td></td></tr><tr><td>Regolatore di temperatura 220V AC</td><td>Rothacher-Medical GmbH</td><td>TCAT-2LV</td><td></td></tr></tbody></table>

cortex, hippocampus-, thalamus-, hypothalamus-, laterale del setto nucleus- e striatum specifici<em&gt; in utero</em&gt; elettroporazione in c57bl / 6 del mouse

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

L'elettroporazione in utero è una tecnica ampiamente utilizzata per la manipolazione spazio-temporale rapida ed efficiente di vari geni nel sistema nervoso centrale dei roditori. La sovraespressione dei geni desiderati è possibile tanto quanto gli studi sulla perdita di funzione mediata da shRNA. Pertanto offre un'ampia gamma di applicazioni. La possibilità di indirizzare particolari cellule in un'area distinta aumenta ulteriormente la gamma di potenziali applicazioni di questo metodo molto utile. Per indirizzare in modo efficiente regioni specifiche, è indispensabile conoscere le sottigliezze, come lo stadio embrionale, la tensione da applicare e, soprattutto, la posizione degli elettrodi.
Qui, forniamo un protocollo dettagliato che consente l'elettroporazione in utero specifica ed efficiente di diverse regioni del sistema nervoso centrale del topo C57BL/6. In particolare viene mostrato come trasfettare le regioni che si sviluppano nella corteccia retrospleniale, nella corteccia motoria, nella corteccia somatosensoriale, nella corteccia piriforme, nel cornu ammonis 1-3, nel giro dentato, nello striato, nel nucleo del setto laterale, nel talamo e nell'ipotalamo. Per queste informazioni sullo stadio embrionale appropriato, viene fornita la tensione appropriata per lo stadio embrionale corrispondente. Soprattutto è raffigurata una mappa angolare, che indica la posizione appropriata del polo positivo. Questo protocollo standardizzato aiuta a facilitare un'efficiente elettroporazione in utero, che potrebbe anche portare a una riduzione del numero di animali.

La figura 2 mostra esempi di specifica in utero elettroporazione delle regioni in via di sviluppo nella corteccia retrosplenial, la corteccia motoria, la corteccia somatosensoriale, la corteccia piriforme, il cornu Ammonis 1-3, il giro dentato, lo striato, il nucleo settale laterali , il talamo e l&#39;ipotalamo. I risultati delle trasfezioni sono confrontate con l&#39;angolazione consigliata (Figura 2). Per una migliore visualizzazione degli angoli in vivo la posizion...

Questo protocollo descrive in dettaglio come trasfettare in modo specifico diverse regioni del sistema nervoso centrale C57BL/6 tramite elettroporazione in utero. Incluso in questo protocollo ci sono istruzioni dettagliate per le trasfezioni delle regioni che si sviluppano nella corteccia, nell'ippocampo, nel talamo, nell'ipotalamo, nel nucleo del setto laterale e nello striato.

Cortex, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, laterale del setto Nucleus- e Striatum specifici<em&gt; In Utero</em&gt; Elettroporazione in C57BL / 6 del mouse

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous ...

L'obiettivo generale di questa manipolazione cellulare in vivo è modificare in modo specifico le cellule di determinate regioni del sistema nervoso centrale del topo, come la corteccia, l'ippocampo, il talamo, l'ipotalamo, il nucleo settale laterale e lo striato. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali riguardo lo sviluppo e la funzione del cervello, ad esempio identificando diverse cascate di segnali e determinando il grado di differenziazione cellulare. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente una manipolazione rapida ed efficiente di diversi tipi cellulari nel sistema nervoso centrale, senza dover ricorrere alla generazione di topi geneticamente modificati, un processo lungo e laborioso.In generale, la dimostrazione di questo metodo è utile, poiché le persone alle prime armi con questa tecnica spesso incontrano difficoltà nel trovare la posizione corretta dell'elettrodo, che è fondamentale per un'elettroporazione specifica. Per iniziare la procedura, aprire con un bisturi la cavità addominale di un topo gravido anestetizzato. Evitare che la cavità addominale aperta si secchi, inumidendola con soluzione salina al 0,9% di alcol metilico ti

cortex-hippocampus-thalamus-hypothalamus-lateral-septal-nucleus

Research

Ricerca

JoVE Journal

Neuroscience

Neuroscienze

In Utero iniezione intraventricolare e Elettroporazione di E15 embrioni di topo

Elettroporazione in utero permette per la consegna rapida in un gene-spazialmente e temporalmente modo controllato nello sviluppo del sistema nervoso centrale (SNC). Qui descriviamo altamente adattabile a protocollo di elettroporazione utero che possono essere usati per fornire costruisce espressione in più domini embrionale del SNC, tra cui il diencefalo telencefalo, e della retina.

Gene consegna efficiente in più territori SNC utilizzo In Utero Elettroporazione

Un metodo di trasferimento genico nel cervello del mouse di sviluppo è descritta utilizzando un metodo unico chirurgico e la forma speciale di elettrodi. Questa tecnica unica consente la trasfezione di DNA plasmidico temporalmente e spazialmente, che aiuterà molti neuroscienziati a studiare lo sviluppo del cervello.

Mouse in Utero elettroporazione: controllato Transefection Gene spazio-temporale

Questo articolo descrive in dettaglio un protocollo per elettroporare in utero della corteccia cerebrale e l'ippocampo a E14.5 nei topi. Abbiamo anche dimostrato che questo è un metodo valido per studiare dendriti e spine in queste due regioni cerebrali.

Visualizzazione e manipolazione genetica di dendriti e spine nella corteccia cerebrale e nell&#39;ippocampo mouse utilizzando<em&gt; In utero</em&gt; Elettroporazione

Questo protocollo descrive un procedimento di espianto che...

Ex utero elettroporazione e Espianti intero emisfero: un semplice metodo sperimentale per gli studi del primo sviluppo corticale

Nonostante l'importanza funzionale e mediche...

La manipolazione genetica del topo sviluppo dell&#39;ipotalamo attraverso<em&gt; In utero</em&gt; Elettroporazione

La superficie piale è una zona progenitore unico nel SNC che sta ricevendo crescente attenzione. Qui, noi dettaglio un metodo per la manipolazione genetica rapido di questa zona progenitore utilizzando un metodo di elettroporazione modificato. Questa procedura può essere utilizzata per indagini cellulari e molecolari delle linee cellulari e vie di segnalazione coinvolte nella differenziazione cellulare e per chiarire il destino e le proprietà delle cellule figlie.

Neonatale Pial elettroporazione Surface

Qui presentiamo un protocollo che fornisce uno strumento per esaminare i meccanismi di regolazione di geni specifici durante lo sviluppo dell'ippocampo. L'impiego dell'elettroporazione ex utero e della coltura organotipica di fette consente l'up- e down-regolazione dell'espressione di geni di interesse in singole cellule e segue il loro destino durante lo sviluppo.

Ex utero elettroporazione e Organotipica Fetta Cultura del mouse ippocampale Tissue

Questo protocollo fornisce istruzioni per l'osservazione diretta dei migratori radiali di neuroni corticali. Nell'utilizzo dell'elettroporazione uterina, la coltura organotipica della fetta e l'imaging confocale a tempo intervallo sono combinati per studiare direttamente e dinamicamente gli effetti di sovraespressione o di downregolazione di geni di interesse nei neuroni migratori e di analizzare la loro differenziazione durante lo sviluppo.

Impressione confocale dei migratori dei neuroni nella cultura di fetta organotipica del cervello embrionale del mouse usando<em&gt; In Utero</em&gt; Elettroporazione

Cella-autonome funzioni dei geni nel cervello possono essere studiate inducendo perdita o guadagno di funzione in popolazioni sparse delle cellule. Qui, descriviamo in utero elettroporazione per consegnare la Cre ricombinasi nelle popolazioni sparse di sviluppare neuroni corticali con floxed geni per causare la perdita di funzione in vivo.

Induzione della ricombinazione di Cre-lox nella corteccia cerebrale del Mouse attraverso elettroporazione In Utero

Qui, forniamo un metodo affidabile e a basso costo per generare colture individulamente cervello organotipiche fetta da embrioni del mouse adatti per la microscopia confocale e tecniche di imaging live.

Ex Utero Elettroporazione e colture Organotypic fetta di cervelli embrionali del Mouse per vivere-Imaging di migrazione interneuroni GABAergici

Scopri l'elettroporazione in utero per manipolare cellule specifiche nel sistema nervoso centrale del topo C57BL/6. Questa tecnica consente di studiare lo sviluppo cerebrale e le vie di segnalazione senza generare topi geneticamente modificati.

Cortex, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, laterale del setto Nucleus- e Striatum specifici In Utero Elettroporazione in C57BL / 6 del mouse (Video) | JoVE Journal

Cortex, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, laterale del setto Nucleus- e Striatum specifici

Esplora altri video