Una alternativa semplice per iniezione stereotassica per Brain Knockdown specifico miRNA

Qui dimostriamo l'uso di un peptide che penetra nelle cellule con un oligonucleotide antisenso modificato per abbattere specificamente il micro RNA nel cervello dei topi. Ciò è stato ottenuto progettando un'antigo contro il 29 maggio. In questo studio, abbiamo utilizzato i maschi antigo per colpire i microRNA che bloccano le modifiche dell'acido nucleico.

Cioè, le modifiche all'LNA sono state incorporate in cinque diverse posizioni. In questo, l'incorporazione di modifiche dell'LNA aumenta la sua affinità di legame con il micro RNA. Inoltre, conferisce resistenza al nucleo e quindi migliora l'efficienza del targeting dei microRNA.

I complessi di ANTIGO MAR con il peptide sono stati preparati in vitro e iniettati nei topi attraverso la vena caudale. Il knockdown del micro RNA ha provocato cambiamenti comportamentali che suggeriscono che il coinvolgimento di questo microRNA nell'atassia tre iniezioni consecutive sono state sufficienti per indurre un notevole cambiamento nell'andatura dopo il trattamento, il tessuto cerebrale è stato raccolto e il knockdown del microRNA è stato confermato. I CPP o peptidi autopenetranti sono recentemente emersi come vettori interessanti per la veicolazione di acidi nucleici.

Qui abbiamo usato uno di questi peptidi neurotropi ricchi di arginina che può subire una complessazione basata sulla carica con l'LNA, che dopo la somministrazione nella circolazione sistemica, raggiungerà il suo sito bersaglio designato che in questo caso sono le cellule neuronali e garantirà il corretto rilascio dell'LNA in queste cellule. Le sequenze dei membri della famiglia ME 29 sono state recuperate da mease e le 16 MER antisenso sono state sintetizzate con modifiche dell'acido nucleico di blocco in cinque posizioni equidistanti per preparare i complessi. Le soluzioni di peptide e antigo di concentrazioni appropriate sono state preparate separatamente in glucosio sterile al 10%.

In condizioni asettiche. La soluzione di Antigo è stata aggiunta lentamente goccia a goccia alla soluzione peptidica con una leggera agitazione. L'aggiunta lenta e l'agitazione delicata sono fondamentali per la formazione di complessi monodispersi la cui dimensione è nella scala trica.

L'antigo è stato aggiunto in tre parti uguali ogni volta, lasciando un minuto per la miscelazione, seguito da un minuto di incubazione senza mescolare. L'aggiunta rapida può portare all'aggregazione dei complessi e alle precipitazioni. Il complesso Antigo è ora pronto per l'iniezione iniettabile.

Il complesso è stato somministrato attraverso un'iniezione della vena caudale. I topi sono stati riportati nella stessa gabbia. I test comportamentali per l'atassia sono stati effettuati quotidianamente, tre ore dopo l'iniezione.

Il topo era tenuto per la coda, non permettendogli di toccare gli oggetti circostanti. Nota il modo in cui gli arti posteriori sono divaricati per 10 secondi. Nel test della sporgenza, ai topi è stato richiesto di camminare lungo la sottile sporgenza della gabbia.

I Topi camminano attraverso un canale sottile lasciando impronte con le zampe inchiostrate su una striscia di carta spessa assorbente inchiostra, solo le zampe posteriori. Per evitare di confondere i dati Da quattro arti, vediamo L'effetto del trattamento antigo. Abbiamo isolato il cervello e altri tessuti dai topi trattati e controllati.

Abbiamo scoperto che il peptide R VG ha fornito un siRNA marcato in fluorescenza specificamente al cervello, ma non ad altri tessuti come il fegato. Un peptide di controllo non neurotropico RVM ha consegnato il siRNA al fegato. I topi trattati con ANTIER 29 hanno mostrato difetti negli arti posteriori.

I topi controllati trattati con un ano strapazzato potevano negoziare la sporgenza, ma dopo il trattamento con l'anme contro MARE 29, i topi hanno mostrato lievi difetti in questo test. Nel test dell'impronta, c'è stato un notevole accorciamento della lunghezza del passo nei topi trattati. Inoltre, abbiamo confermato tramite QR tpcr che i livelli di mid 29 A e mid 29 B erano downregolati per lo sviluppo di terapie basate su micro NNA.

La somministrazione specifica del cervello di anti microRNA è una sfida a causa della barriera ematoencefalica. Utilizzando la tecnica qui presentata, possiamo evitare il metodo convenzionale di somministrazione di anti microRNA al cervello. Questo metodo rende tecnicamente fattibile il knockdown dei microRNA e aumenta la specificità tissutale.