Name: Panni nasale per linfluenza A rilevazione antivirus e isolamento da Suina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 59 s
Description: Scopri un metodo a basso stress per la raccolta di tamponi nasali su suini per la sorveglianza del virus dell'influenza A. Questa tecnica semplice migliora il benessere animale e l'efficacia del monitoraggio virologico.

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Questo lavoro è stato finanziato in parte con fondi federali dai Centri di Eccellenza per la Ricerca e la Sorveglianza dell'Influenza (CEIRS), dall'Istituto Nazionale di Allergia e Malattie Infettive, dal National Institutes of Health, dal Dipartimento della Salute e dei Servizi Umani, nell'ambito del Contratto n. HHSN272201400006C.

Tutti i suini utilizzati per la raccolta dei seguenti dati sono stati protetti ai sensi della Istituzionale Animal Care and Use Committee Ohio State University (uso animale numero di protocollo 2009A0134-R1). 1. Preparazione di trasporto virale media e provate Fiale Collection <ol><li> Aggiungere 37 g di Brain Heart Infusion a 900 ml di acqua purificata e mescolare accuratamente con un ancoretta e agitatore magnetico mentre il riscaldamento a 70 ° C per sciogliere completamente la polvere. </li><li> Autoclavare il brodo a 121 ° C per 15 min. Raffreddare sul banco fino brodo raggiunge la temperatura ambiente. Mettete in frigorifero a 4 ° C durante la notte se necessario. </li><li> Sciogliere, mescolando con ancoretta magnetica, 6,02 g di sale sodico Penicillina G e 10 g di solfato di streptomicina in 50 ml di acqua depurata a temperatura ambiente. Aggiungere acqua purificata supplementare per portare il volume totale di 100 ml. Filtrare la soluzione attraverso una membrana polietersulfone 0,22 micron in una bottiglia sterile. </li><li> Asetticamente aggiungere la penicillina filtrato e la soluzione di streptomicina nella raffreddato Brain Heart Infusion Broth e mescolare bene (o ancoretta pallone ricciolo mano) per rendere il mezzo di trasporto virale. </li><li> Asetticamente testare il pH del mezzo di trasporto virale; se necessario, regolare il pH a 7,4 ± 0,2 con HCl o NaOH. </li><li> Eseguire test di garanzia della qualità del mezzo di trasporto virale da test per l&#39;influenza A proteina di matrice del virus da rRT-PCR, come descritto da Zhang e Harmon. 22 </li><li> Dispensare 5 ml di mezzo di trasporto virale in bottiglie di polietilene ad alta densità sterili con capacità da 8 ml. Etichetta le fiale per uso nel settore. </li><li> Conservare le fiale pronti per l&#39;uso in crio-scatole standard a -20 ° C fino a quando la raccolta del campione. </li></ol> 2. Raccolta di nasale Salviette da Swine <ol><li> Scongelare il numero appropriato di flaconcini immediatamente prima del prelievo; Sarà necessario un flaconcino per suino campionato. Scongelamento in cameratemperatura richiede circa 30-45 minuti. Tenere le fiale scongelate raffreddare su impacchi di ghiaccio fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Don adeguati dispositivi di protezione personale come dettate dalla situazione (ad esempio, tuta, calzari, respiratore, tappi per le orecchie, ecc). </li><li> Entra nell&#39;area animale. Se necessario, limitare il maiale ad una piccola area ma senza frenare. Non svegliare riposo animali. </li><li> Indossare un paio di guanti monouso di esame. Fare attenzione a non contaminare i guanti da maiali toccando, persone o oggetti inanimati. </li><li> Usare una mano guantata per rimuovere una sterile 5,08 cm × 5,08 cm (2 in. × 2 in.) Tampone di garza di cotone dal suo involucro. Garze sterili devono essere usati quando possibile. Garze confezionati singolarmente sono più comodi da usare rispetto a quelli avvolto con due tamponi di garza per collo. </li><li> Tenere il tampone di garza di cotone con la punta delle dita di una mano esporre come gran parte del pad come possibile per il campionamento. </li><li> Pulire il tampone di garza attraverso il muso del maiale, presaattenzione per entrare nelle narici esterne, se possibile. Raccogliere visibili secrezioni nasali (circa 1 ml) con lo stesso tampone di garza. </li><li> Utilizzando la stessa mano, piegare la garza su se stesso per facilitare il posizionamento nel flaconcino contenente mezzo di trasporto virale. </li><li> Utilizzando invece, rimuovere il tappo dal flacone e posizionare la garza piegata nel flaconcino. Richiudere la fiala e agitare il flaconcino per garantire la miscelazione del garza e mezzo di trasporto virale. </li><li> Togliere i guanti e posto in un contenitore adeguato. Cambiare i guanti tra ogni suino. </li><li> Verificare l&#39;identificativo fiala. Numero record di identificazione maiale, età, sesso, segni clinici, e altre note ritenute necessarie da investigatore. </li><li> Raffreddare i campioni immediatamente dopo il prelievo. Considerare la possibilità aliquote del campione prima del congelamento per evitare più cicli di congelamento-scongelamento. Non appena possibile dopo la raccolta, posizionare i campioni in ghiaccio secco per il trasporto al laboratorio. Conservare le fiale a -80° C fino all&#39;avvio test. </li></ol> 3. Rilevamento di virus influenzale A Nucleic Acid <ol><li> Scongelare i campioni a 37 ° C bagno branello secco per 5 min e quindi completare scongelamento i campioni sul banco a temperatura ambiente per 20-30 min. L&#39;aggiunta contemporanea di più flaconi alle perline causerà la vasca al calore; si deve prestare attenzione per non surriscaldare i flaconi. </li><li> Togliere 100 ml di mezzo di trasporto virale per l&#39;estrazione dell&#39;RNA. <ol><li> Utilizzare un high-throughput (96 formato pozzetti) piattaforma perla magnetica per l&#39;estrazione di RNA da un gran numero di campioni. 31 </li></ol></li><li> Utilizzare in tempo reale analisi della trascrittasi inversa PCR per il rilevamento rapido di influenza virus. 31 </li></ol> 4. L&#39;isolamento del virus influenzale A da nasali Salviettine <ol><li> Scongelare i campioni come descritto in precedenza nella sezione 3.1 </li><li> Trattare i campioni scongelati con gentamicina solfato (1.000mcg / ml), amfotericina B (22,5 mg / ml), e kanamicina solfato (325 mcg / ml). </li><li> Seminare in Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) le cellule epiteliali, come descritto in precedenza. 32 </li></ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La raccolta di campioni da suini utilizzando tamponi nasali di poliestere con la punta si è dimostrato utile nel condurre sorveglianza IAV; Tuttavia, l&#39;uso della procedura di tampone nasale ostacola gli sforzi di sorveglianza dovuti all&#39;uso richiesto di un laccio per contenzione. Salviette nasale rappresentano un affinamento delle attuali tecniche di campionamento suina per minimizzare lo stress sulle persone e maiali durante la raccolta del campione. Mentre il metodo è stato messo a punto e validato in contesti...

<html> I virus influenzali A (IAV) causano malattie respiratorie in molte specie, tra cui uccelli domestici, suina, e gli esseri umani. A causa riassortimento del genoma segmentato IAV rapida evoluzione virale possono verificarsi e nuovi ceppi IAV emergere frequentemente. Maiali sono una specie che può servire come un vaso di miscelazione per riassortimento di IAV da più specie ospiti. 1 Al momento non ci sono tre principali sottotipi di IAV comunemente circolano tra nordamericano suina (H1N1, H1N2, H3N2), ma più introduzioni IAV da esseri umani hanno ha portato alla vasta diversità IAV all&#39;interno di tali sottotipi. 2 rapida evoluzione della IAV infettare suina è evidente dal 1998, quando un reassortant tripla IAV contenente segmenti di geni provenienti da virus umani, aviari e suini 3 si diffuse tra i maiali negli Stati Uniti. 4 Il gene interna segmenti di quel triplice reassortant IAV rimangono altamente diffusa tra IAV attualmente infettare suina. 5 &quot;&gt; In tutto il mondo, IAV è una causa importante di malattia respiratoria dei suini in cui i segni clinici tipici comprendono febbre, anoressia, letargia, tosse, respiro affannoso, starnuti, scolo nasale e scarso aumento di peso. IAV può essere particolarmente onerosa seminare aziende agricole in cui riproduttiva fallimento a causa di IAV febbre indotta e suinetti deboli di origine sono stati documentati. 6,7 Negli Stati Uniti, IAV è comunemente individuato in allevamenti suini commerciali e l&#39;ampia diversità antigenica e genomica e continua evoluzione tra IAV suina infettare ha ostacolato il controllo di questa virus. 8-11 Salute pubblica teme la comparsa di un ceppo IAV pandemia derivante dal riassortimento nei suini sono stati realizzati nel 2009, quando un IAV suina lignaggio contenente segmenti di geni della stirpe suina nordamericana triplo riassortanti e il lignaggio suina aviaria-come eurasiatico ha causato una pandemia a livello mondiale negli esseri umani. 12 La virus pandemico (A (H1N1) pdm09) ha dalriassortito con suina endemica IAV ceppi 13,14 e alcuni di questi ceppi di nuova riassortito sono stati trasmessi di nuovo agli esseri umani. 15 La frequenza di eventi riassortimento e comparsa di nuovi ceppi IAV con potenziale pandemico rende sorveglianza attiva di far circolare i virus nei suini IAV imperativo, soprattutto all&#39;interfaccia suina umana. L&#39;interfaccia suina-umano è importante per interspecie bidirezionale trasmissione di IAV. Human-to-suina trasmissione che si verificano nella produzione suina commerciale è responsabile di una grande quantità di diversità IAV attualmente presenti nella popolazione suina. Fiere agricole sono le impostazioni per la comingling di persone e suina negli Stati Uniti più grandi e sono noti siti per la trasmissione zoonotica di IAV. 15-21 Nel 2012, durante l&#39;epidemia di una variante H3N2 IAV, il 93% dei casi segnalati partecipazione a una fiera agricola, nei giorni precedenti l&#39;inizio della malattia. 15 Analisi genomicadi isolati virali da suini espositivi rispetto al isolati umani confermato trasmissione zoonotici. 21 Exhibition suina infetta da IAV spesso non presentavano segni clinici di malattia, 21-23 che indicano la necessità di test diagnostici diretti. Il campionamento dei suini visibilmente malati da solo non identificare con successo IAV prevalenza nei suini e non può essere invocata per individuare nuovi ceppi di IAV emergenti tra maiali. La sorveglianza attiva è assolutamente necessario per il rilevamento di ceppi emergenti di IAV in suini e per valutare la loro minaccia sia per la suina e della salute pubblica. La maggior parte delle attività di sorveglianza IAV sono volontarie e, pertanto, sono necessari metodi minimamente dirompenti. Le tre principali procedure di raccolta del campione ante mortem per IAV infettare suina sono: tamponi nasali, fluidi orali, e salviette nasali. Le attuali raccomandazioni per il campionamento dei suini individuale per rilevare lista IAV l&#39;inserimento di fibre sintetiche ribaltati tamponi nelle narici come il metodo preferitoraccogliere le secrezioni nasali e le cellule epiteliali. 24,25 Poiché suini possono cercare di evitare questa procedura, una squadra di personale addestrato deve trattenere suini manualmente o con un laccio seconda della taglia dell&#39;animale. 26 Il processo di ritenuta è laborioso per il personale e stressante per i maiali. Inoltre, mostra suini sono spesso coinvolti in molteplici competizioni in una fiera così la percezione di stress aggiunto su un animale di concorrenza può offrire proprietari resistenti agli sforzi di sorveglianza. Con probabilità di rilevazione IAV che vanno dal 80-100% in IAV allevamenti infetti, fluidi orali sono diventati una alternativa popolare per nasale tamponi per la diagnosi molecolare di IAV nelle popolazioni di suini. 27,28 Inoltre, fluidi orali possono fornire una finestra più ampia di rilevamento IAV di tamponi nasali dopo l&#39;infezione iniziale. Tuttavia, IAV isolamento da fluidi orali è stato problematico con solo il 50% dei virus tentativi di isolamento con conseguente IAV recupero. 29 Utilizzando salviette nasali in luogo di tamponi nasali durante IAV sorveglianza nei suini supera i limiti di cui sopra. Salviette nasali non richiedono l&#39;uso di un laccio di ritegno e possono essere eseguite senza stress agli animali o testimoni della procedura. Formazione tecnica minima è necessaria per raccogliere salviette nasali, che consente ai professionisti non veterinari, compresi i proprietari dei suini, per raccogliere i campioni di sorveglianza. Salviette nasali sono stati precedentemente confrontati con tamponi nasali per la rilevazione e l&#39;isolamento di virus influenzale A 30 e il protocollo dettagliato per questo metodo non invasivo di campionamento è descritto di seguito.

<table><tbody><tr><td>BBL Brain Infusione Cardiaca</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>211059</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina G Sale di Sodio</td><td>MP Biomedicals, LLC</td><td>021194537</td><td>1500 u/mg</td></tr><tr><td>di Streptomicina Solfato</td><td>AMRESCO LLC</td><td>0382</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di gentamicina</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>30-005-CR</td><td>50 mg/ml</td></tr><tr><td>Soluzione di amfotericina B</td><td>Fisher</td><td>S 24 25</td><td>250 ug/ml</td></tr><tr><td>Kanamicina solfato</td><td>Teknova</td><td>K2105</td><td>5000 ug/ml</td></tr><tr><td>TPP Rapid Filtermax System</td><td>TPP Techno Plastic Products AG&nbsp;</td><td>99150</td><td></td></tr><tr><td>Flaconi diagnostici Nalgen</td><td>Thermo Scientific</td><td>342002-9025</td><td>HDPE con chiusura in PP bianco</td></tr><tr><td>Spugna di garza Dermacea, 8 strati</td><td>Covidien</td><td>441211</td><td>5,08 cm & volte; 5,08 cm (2 pollici & volte; 2 pollici)&nbsp;</td></tr><tr><td>Guanti da esame in nitrile</td><td>Saftey Choice</td><td>19-170-010 (A-D)</td><td></td></tr></tbody></table>

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Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Sorveglianza di virus dell&#39;influenza A in suina è fondamentale per la salute umana e animale perché virus evolve rapidamente nella popolazione suina e nuovi ceppi sono continuamente emergendo. Swine sono in grado di essere infettati da diversi lignaggi di virus influenzale che li ospita importanti per la formazione e il mantenimento di nuova influenza A ceppi di virus. Campionamento suini in contesti diversi, quali aziende agricole suini, fiere agricole e mercati di animali vivi è importante fornire una visione completa di ceppi attualmente in circolazione IAV. La corrente ante mortem tecnica di campionamento gold-standard (ossia la raccolta di tamponi nasali) è laborioso perché richiede contenzione fisica dei suini. Salviette nasale coinvolgere strofinando un pezzo di tessuto attraverso il muso del maiale con minima o nessuna moderazione dell&#39;animale. Il nasale wipe procedura è semplice da eseguire e non richiede personale con veterinaria professionale o formazione trattamento degli animali. Wentre leggermente meno sensibile di tamponi nasali, tassi di rilevazione di virus e l&#39;isolamento sono sufficienti per fare nasale pulisce una valida alternativa per il campionamento singoli suini quando sono richiesti bassi di stress metodi di campionamento. Il protocollo procedura delinea i passi necessari per raccogliere un nasale valida wipe da un maiale individuo.

Uso di successo di questo metodo produce rRT-PCR risulta che, accompagnato con l&#39;uso di un controllo interno durante l&#39;estrazione di RNA e rRT-PCR, mostrano campioni non contenevano inibitori della PCR da eventuali detriti ambientali prelevati durante il campionamento. Dopo il campione inoculazione, virus sacche di isolamento dovrebbe essere libero di detriti visibile ambientale dal campione. Vi è ragionevole concordanza tra i risultati rRT-PCR e risultati di isolamento del virus con la consapevolezza che la PCR...

Gli autori presentano un protocollo per raccogliere salviette nasali suine per rilevare e isolare i virus dell'influenza A.

Panni nasale per l&#39;influenza A rilevazione antivirus e isolamento da Suina

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

L'obiettivo generale di questa procedura è raccogliere tamponi nasali da suini per la sorveglianza del virus dell'influenza A, offrendo un'alternativa a basso stress rispetto ai tamponi nasali tradizionali. Questo metodo può migliorare la sorveglianza e fornire informazioni sui ceppi di virus dell'influenza A che circolano nel suino, poiché è semplice da eseguire e non richiede un addestramento specializzato.Il principale vantaggio di questa tecnica è che i campioni per i test diagnostici possono essere prelevati da animali singoli con un minimo di immobilizzazione. Le implicazioni di questa tecnica riguardano il miglioramento della partecipazione ai programmi di sorveglianza del virus dell'influenza A, poiché un metodo a basso stress risulta più accettabile per gli allevatori di suini. Sebbene questo metodo sia stato inizialmente sviluppato per l'uso con suini esposti in mostre, può essere applicato anche alla sorveglianza virale in allevamenti commerciali di suini, aziende agricole e mercati di animali vivi.Per iniziare, sciogliere prima 37 grammi di brain heart infusion, o polvere di BHI, in 900 millilitri di acqua purificata. Mescolare la soluzione a 70 gradi Celsius per sciogl

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Research

Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Questo metodo descrive l'utilizzo di Infrared sistema colorante di imaging based per il rilevamento di H1N1 in bronchioalveolar lavaggio (BAL) fluido di topi infettati ad una sensibilità elevata. Questa metodologia può essere eseguita in uno 96 - o 384-bene piastra, richiede &lt;10 volume pl di materiale di prova e ha il potenziale per lo screening concomitante di agenti patogeni multipli.

High-throughput Metodo di rilevazione per il virus dell&#39;influenza

Fonte: Lenhard, A. et al. Un modello murino per la transizione di Streptococcus pneumoniae da colonizzatore a patogeno dopo la co-infezione virale riproduce la malattia aggravata dall'età. J. Vis. Esp. (2022)Questo video mostra un modello di co-infezione topina in cui il virus influenzale innesca la transizione di Streptococcus pneumoniae da colonizzatore a patogeno. Descrive le fasi coinvolte nella colonizzazione batterica, nelle infezioni virali e nella progressione della malattia.

Un modello murino per studiare la transizione patogena di Streptococcus pneumoniae dopo la co-infezione virale

Source: Wang, M., et al, Evaluation of T Follicular Helper Cells and Germinal Center Response During Influenza A Virus Infection in Mice. J. Vis. Exp. (2020).This video demonstrates intranasal infection of a mouse with a pathogenic influenza virus to establish a respiratory tract infection. The procedure outlines the administration of the virus into the nasal cavity. The virus enters host cells, replicates, and activates the immune system.

Intranasal Infection of a Mouse with a Pathogenic Influenza Virus

Il video mostra un test per quantificare i virus influenzali A e B. Questo test utilizza l'amplificazione dell'endonucleasi con primer specifici per l'influenza e il rilevamento del bersaglio mediante sonde beacon molecolari.

Un test su base molecolare per la quantificazione dei virus dell'influenza A e B

Descriviamo un test rapido, molecolare a base di Influenza A e B. Il saggio Influenza rileva ogni bersaglio entro 15 minuti utilizzando l'amplificazione isotermica con primer specifici per l'influenza seguita da rilevamento di target con sonde segnale molecolare. Il saggio e influenza A B è facile da usare e richiede minimi hands-on tempo per eseguire.

Rilevazione rapida molecolare e la differenziazione dei virus influenzali A e B

test high-throughput di DNA e RNA patogeni a base di nanoscala PCR è descritto con un cane sindromica e equini pannello PCR respiratorio.

Detection High-throughput respiratorie patogeni nei campioni animali da Nanoscale PCR

Questo studio descrive un   di imaging basata su test di micro-neutralizzazione per analizzare le relazioni antigeniche tra virus. Il protocollo impiega uno scanner piano ed ha quattro fasi, tra cui la titolazione, la titolazione quantificazione, neutralizzazione, e la neutralizzazione quantificazione. Il test funziona bene con corrente circolante pdm09 influenza A (H1N1), A (H3N2), e virus B.

Ottimizzazione di un Quantitative Micro-neutralizzazione Assay

Influenza A virus (IAVs) è importanti patogeni respiratori umani. Per capire la patogenicità di IAVs e per eseguire test preclinici di approcci vaccinali romanzo, modelli animali che imita la fisiologia umana sono necessari. Qui, descriviamo le tecniche per valutare IAV patogenesi, le risposte umorali e l'efficacia del vaccino utilizzando un modello murino di infezione.

Studi del Virus di riossidazione A in un modello murino di infezione

Il presente protocollo descrive un nuovo metodo per evitare la contaminazione del sangue nel liquido di lavaggio nasale murino (NLF). Poiché questo metodo garantisce la raccolta dell'NLF senza contaminazione del sangue, consente rilevamenti più accurati dei componenti immunologici e di vari agenti patogeni respiratori.

Raccolta di liquidi per il lavaggio nasale muino senza contaminazione del sangue

Questo protocollo fornisce istruzioni per la somministrazione intranasale di IAV e l'analisi a valle del danno polmonare di topo e delle modifiche trascrizionali associate ai tipi di cellule polmonari.

Modellazione della riparazione alveolare polmonare displastica e funzionale dopo l'infezione influenzale

Scopri un metodo a basso stress per la raccolta di tamponi nasali su suini per la sorveglianza del virus dell'influenza A. Questa tecnica semplice migliora il benessere animale e l'efficacia del monitoraggio virologico.

Panni nasale per l'influenza A rilevazione antivirus e isolamento da Suina

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