Name: Imaging neutrofili e monociti in mesenterica Veins intravitale Microscopia su topi anestetizzati in tempo reale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Impara a monitorare neutrofili e monociti in vene mesenteriche mediante microscopia confocale intravivente su topi anestetizzati. Questo metodo consente di studiare la migrazione leucocitaria in condizioni di omeostasi e infiammazione.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato sostenuto da EMBO (a Y.E.), Foundation Machaon (a Y.E.) e SNSF (a B.A.I.). Ringraziamo la Bioimaging Core Facility per la disponibilità del microscopio Nikon A1r e l'assistenza tecnica. Ringraziamo la signora Clarissa Bartley per la correzione in inglese.

NOTA: le procedure di animali sono stati eseguiti in conformità con la Comitato Etico Istituzionale di Animal Care a Ginevra, in Svizzera e l&#39;Ufficio cantonale di veterinaria. Numero di autorizzazione GE / 63/14. 1. Preparazione di una sospensione singola cella da midollo osseo <ol><li> Mouse Sacrificio (8-12 settimane di età) per dislocazione cervicale. Sterilizzare zampe posteriori con il 70% di etanolo. Togliere la pelle dalle gambe posteriori. </li><li> Sezionare femori e tibie e il mouse rimuovere il tessuto da gambe con un bisturi. Sciacquare gambe con il 90% di etanolo e posto in un piatto cultura piena di PBS. </li><li> Sotto il cofano della cultura, il tessuto pulito da femore e tibia con un bisturi e separato ginocchio. Tagliare ogni estremità delle ossa. </li><li> Lavare midollo osseo da ciascun osso utilizzando un ago 23G e una siringa da 1 ml riempito con media preparazione (fenolo aneritro DMEM / F12, siero di ratto 1%), in 50 ml vite tubo. Disrupt aggregati di cellule da delicatamente passaging attraverso il non 23Gedle e una siringa da 1 ml. Portare il volume totale di 25 ml di media preparazione. </li><li> Centrifuga 250 xg, 5 min, 4 ° C. Surnatante scarto. Risospendere pellet in 1 ml Globulo rosso tampone Lysis rblc (8,3 g di NH 4 Cl, 1 g NaHCO 3, 1 ml di EDTA (100 mm), completo di 1 L con acqua distillata, filtrare 0,22 micron) in 15 ml di vite tubo. Incubare 30 sec su ghiaccio. </li><li> Aggiungere 10 ml di terreno preparato e centrifugare a 250 xg, 5 min, 4 ° C. Gettare il surnatante e risospendere in 2 ml di mezzo di preparazione. </li></ol> 2. neutrofili Arricchimento per selezione negativa <ol><li> Aggiungere 150 ml di mouse cocktail neutrofili arricchimento (isolamento delle cellule kit piattaforma come EasySep). Mescolare e incubare in ghiaccio per 10 min. </li><li> Aggiungere 10 ml di fenolo DMEM rosso gratuito. Invertire una volta e centrifugare 250 xg, 3 min, 4 ° C. </li><li> Surnatante scarto. Risospendere pellet in 1,75 ml di media preparazione in 5 ml di polistirolo tubi tondi fondo. Aggiungere 250 microlitri Biotin Selezione Cocktail. Mescolare e incubare in ghiaccio per 10 min. </li><li> Agitare le particelle magnetiche (dal kit piattaforma di isolamento delle cellule) per 30 secondi per risospendere le particelle. Aggiungere 500 microlitri di particelle magnetiche sospensione cellulare. Mescolare e incubare in ghiaccio per 10 min. </li><li> Mettere la provetta a magnete. Attendere 3 minuti. </li><li> Invertire il magnete su un nuovo 5 ml polistirolo tubi tondi fondo per raccogliere le cellule senza etichetta desiderati. Non prendere l&#39;ultima goccia appeso nel tubo. Cellule indesiderate rimarranno nel tubo all&#39;interno del magnete. Eliminare questo tubo in una rifiuti a rischio biologico. </li><li> Posizionare il nuovo tubo nel magnete. Attendere 3 minuti. </li><li> Invertire il magnete su un nuovo 15 ml vite tubo per raccogliere le cellule senza etichetta desiderati. Non prendere l&#39;ultima goccia appeso nel tubo. </li><li> Completa il volume a 5 ml con rosso fenolo DMEM gratuito. </li></ol> 3. Etichettatura dei neutrofili <ol><li> Aggiungere 0,5 ml di un colorante arancione come il cellulare Tracker Orange (concentrazione di lavoro1 micron, CMRA - clorometil-rodol-acetato, magazzino 10 mM in DMSO). Incubare 2 min a 37 ° C. </li><li> Aggiungere 2,5 ml di terreno preparato. Centrifuga 250 xg, 5 min, 4 ° C. </li><li> Surnatante scarto. Risospendere pellet in 1 ml di media preparazione in una provetta da 1,5 ml. </li><li> Prelevare un &#39;aliquota di contare con hematocytometer. </li><li> Incubare 5 minuti a 37 ° C. Centrifuga 250 xg, 5 min, 4 ° C. </li><li> Surnatante scarto. Risospendere pellet in 1 ml di PBS. Centrifugare 250 xg, 5 min, 4 ° C per lavare. </li><li> Surnatante scarto. Risospendere il pellet come 10x10 6 cellule per 100 l di PBS. Tenere in ghiaccio fino a iniezione endovenosa. NOTA: cellule devono essere iv iniettato il più rapidamente possibile. 6-12x10 6 neutrofili / mouse sono solitamente ottenuti. </li></ol> 4. Preparazione del mouse per intravitale Microscopia NOTA:.. Fase 4.1) e 4.2) deve essere eseguita all&#39;inizio dell&#39;esperimento per evitare tempi di attesa prolungato di neutrofili etichettati sulla ice. <ol><li> Pesare il CX 3 CR1 topo GFP (8-12 settimana di vita). </li><li> Preparare 800 ml di anestetici (ketamina 60 mg / kg, xilazina 4,5 mg / kg, acepromazone 1,75 mg / kg in PBS). </li><li> Anestetizzare il mouse. Ip Iniezione con 200 microlitri / 20 g di mouse. Controllo anestesia da punta pizzicotti e controllando la frequenza respiratoria. </li><li> Iniettare neutrofili (10x10 6 cellule in 100 microlitri di PBS) per via endovenosa utilizzando le vene coda laterali o seno retro-orbitale, alla convenienza dello sperimentatore. </li><li> Ponga il mouse sul tappetino riscaldamento e proteggere gli occhi con il gel oculare. </li><li> Un coprioggetto di vetro (diametro 35 mm) viene messo in un piatto di coltura di tessuto 10 cm, che ha un foro di diametro 30 mm. Usare olio è di mantenere il piatto di coltura di tessuto a contatto con il coprioggetto. </li><li> Incidere la pelle addominale con le forbici per esporre il peritoneo. Incidere peritoneo con le forbici per esporre intestino. </li><li> Aggiungere 200 microlitri di PBS (preriscaldata a 37 ° C) in pcavità eritoneal. Prendete il mouse in mano e girare a faccia in giù, in modo che l&#39;intestino esce dalla cavità peritoneale con una leggera pressione. Posizionare il mouse nel piatto coltura di tessuti. </li><li> Deroll delicatamente l&#39;intestino con bastoncini di cotone sterilizzati sul vetrino, al fine di esporre i vasi mesenterici. </li><li> Tagliate fazzoletti di carta in bande e bagnarli con 37 ° C riscaldata PBS. Immobilizzare l&#39;intestino con i pezzi di fazzoletti di carta per ridurre i movimenti risultanti dal peristalsi. </li><li> Mettere il piatto di coltura tissutale e il mouse all&#39;interno della camera termostatata 37 ° C sul palco del vassoio su misura del microscopio invertito. Introdurre una siringa contenente anestetici sc nella zampa posteriore. NOTA: Inoltre, il mouse può ricevere ossigeno (0,5 L / min) con una maschera. </li><li> Il mouse di controllo per l&#39;anestesia da punta pizzicare e il controllo della frequenza respiratoria ogni 30 min. Se necessario, fornire una spinta di anestetici (20 ml) per mantenere correttamente anestesia. NONE: Essiccamento della vascolarizzazione deve essere evitato. Pertanto, l&#39;umidità è mantenuta bagnando regolarmente i fazzoletti di carta usati per immobilizzare l&#39;intestino con 37 ° C-riscaldato PBS. </li></ol> 5. Misurazione dei neutrofili e monociti comportamento in recipienti infiammate In Vivo con intravitale Microscopia <ol><li> Impostare laser per 488- 561- e alla potenza minima necessaria per evitare la fototossicità indotta da laser. Nei nostri esperimenti, è inferiore a 0,5%. Intensità di GFP in monociti e arancio tintura dei neutrofili è così intensa che di solito lo 0,3% è sufficiente. NOTA: Ciò rappresenta una potenza laser di 0.15 al 0.25 mW con il nostro sistema. </li><li> Acquisire immagini da 512 x 512 pixel (vale a dire, 635 micron) in 2.2 secondi con un foro stenopeico aperto con l&#39;obiettivo 20X secco del microscopio invertito. Utilizzare un z-profondità compresa tra 10 e 20 micron, che garantisce un segnale sufficientemente con le potenze laser bassi. NOTA BENE: Di solito effettuare esperimenti con una z-profondità compresa tra 12 a 1656; m. Nel caso delle cifre presentate e film, la z-profondità è di 20 micron. Contrasto di fase permette l&#39;identificazione di pareti endoteliali e di imaging viene eseguita su vene mesenteriche. Poiché le cellule pattugliano muovono molto lentamente con una velocità di 5-10 micron / min 6, la registrazione di un campo di interesse ogni 20 s è soddisfacente. Con le impostazioni descritte, la fase motorizzato consente di registrare fino a 7 campi di interesse allo stesso tempo. </li><li> Posizionare il mouse e vasi mesenterici nella camera del termostato del microscopio sono consentirne il recupero dalla preparazione per 30 minuti prima dell&#39;acquisizione del primo film. Durante questo tempo, scegliere diversi campi di interesse. Focus sulla superficie luminale della nave vicina all&#39;obiettivo. Se necessario, sfruttare la leggera auto-fluorescenza di endotelio per impostare la messa a fuoco. NOTA: La chirurgia durante la preparazione del mouse sottolinea leggermente l&#39;endotelio. Di conseguenza, a rotazione dei neutrofili e/ o monociti possono essere osservati nei primi 15 minuti dopo la preparazione del mouse. </li><li> Registrare un primo film per 30 min a regime, una immagine ogni 20 secondi. NOTA: Il software acquisisce ogni campo di interesse per 2,2 secondi e lo stadio motorizzato si sposta automaticamente da un campo all&#39;altro. Si ritorna alla prima posizione entro 20 secondi durante i 30 min del film registrazione. </li><li> Per avviare infiammazione dei vasi sanguigni, aggiungere una goccia di 20 l di PBS contenente 100 mg di TLR2 / TLR1 agonista Pam3CSK4 12 direttamente sui vasi imaged. </li><li> Controllare il punto di riferimento per ogni campo di interesse. NOTA: Nel corso di acquisizione, c&#39;è sempre lievi modifiche di focalizzazione su asse z. Nonostante il 10-20 micron z-profondità, questo può provocare una diminuzione dell&#39;intensità di fluorescenza. Pertanto, riorientare manualmente ogni campo di interesse alla fine di ogni film, se necessario. Film record per 30 min-periodi e fino a 3 ore aTal dopo l&#39;inizio di infiammazione. </li><li> Alla fine dell&#39;esperimento, sacrificare topo anestetizzato per dislocazione cervicale. </li></ol> 6. Generazione di file di film e tracciamento dei leucociti NOTA: Il software di acquisizione Nikon genera .nd2 file, ma la seguente procedura sarà simile con altri software e marchi. <ol><li> I file di esportazione come serie tiff. </li><li> Vai a software ImageJ <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">(http://rsb.info.nih.gov/ij/).</a> Importare la serie tiff. Ogni canale come un file diverso. </li><li> Applicare un filtro mediano con un raggio di 2.0 pixel per i canali verde e rosso per ridurre il rumore di fondo (di processo&gt; Filtri&gt; mediani ...). </li><li> Convertire i file in binario (Processo&gt; Binary&gt; Crea Binary). Attivare il software per calcolare la soglia per ogni immagine. </li><li> Unire i canali in un&#39;unica serie di immagini (Immagine&gt; Colore&gt; Unisci canali ...). Selezionare i monociti del green canali, i neutrofili nel canale rosso e la luce trasmessa nel canale grigio. </li><li> Convertire immagini impilate in colori RGB (Immagine&gt; Colore&gt; Stack per RGB). </li><li> Salvare il file come .avi </li><li> I dati vengono importati e compilati nel software Imaris (Bitplane). Movimenti di monociti e neutrofili vengono poi monitorati tramite il tracking guidata Spot. </li></ol>

<ol><li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+to+the+site+of+inflammation%3A+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat Rev Immunol. 7, 678-689 (2007).</li>
<li>Nourshargh, S., Hordijk, P. L., Sixt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaching+multiple+barriers%3A+leukocyte+motility+through+venular+walls+and+the+interstitium%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Breaching multiple barriers: leukocyte motility through venular walls and the interstitium.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11, 366-378 (2010).</li>
<li>Nourshargh, S., Alon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+migration+into+inflamed+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Leukocyte migration into inflamed tissues.</a> Immunity. 41, 694-707 (2014).</li>
<li>Ley, K., et al. Chapter 11. Intravital microscopic investigation of leukocyte interactions with the blood vessel wall. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLey%2C+K+%22Methods+Enzymol%22">Methods Enzymol</a>. 445, 255-279 (2008).</li>
<li>Sperandio, M., Pickard, J., Unnikrishnan, S., Acton, S. T., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+leukocyte+rolling+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Analysis of leukocyte rolling in vivo and in vitro.</a> Methods Enzymol. 416, 346-371 (2006).</li>
<li>Auffray, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+blood+vessels+and+tissues+by+a+population+of+monocytes+with+patrolling+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Monitoring of blood vessels and tissues by a population of monocytes with patrolling behavior.</a> Science. 317, 666-670 (2007).</li>
<li>Cros, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+CD14dim+monocytes+patrol+and+sense+nucleic+acids+and+viruses+via+TLR7+and+TLR8+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Human CD14dim monocytes patrol and sense nucleic acids and viruses via TLR7 and TLR8 receptors.</a> Immunity. 33, 375-386 (2010).</li>
<li>Hanna, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+NR4A1+%28Nur77%29+controls+bone+marrow+differentiation+and+the+survival+of+Ly6C-+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">The transcription factor NR4A1 (Nur77) controls bone marrow differentiation and the survival of Ly6C- monocytes.</a> Nat Immunol. 12, 778-785 (2011).</li>
<li>Woodfin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+junctional+adhesion+molecule+JAM-C+regulates+polarized+transendothelial+migration+of+neutrophils+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">The junctional adhesion molecule JAM-C regulates polarized transendothelial migration of neutrophils in vivo.</a> Nat Immunol. 12, 761-769 (2011).</li>
<li>Proebstl, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+support+neutrophil+subendothelial+cell+crawling+and+breaching+of+venular+walls+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Pericytes support neutrophil subendothelial cell crawling and breaching of venular walls in vivo.</a> J Exp Med. 209, 1219-1234 (2012).</li>
<li>Wantha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil-derived+cathelicidin+promotes+adhesion+of+classical+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Neutrophil-derived cathelicidin promotes adhesion of classical monocytes.</a> Circ Res. 112, 792-801 (2013).</li>
<li>Ozinsky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+repertoire+for+pattern+recognition+of+pathogens+by+the+innate+immune+system+is+defined+by+cooperation+between+toll-like+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The repertoire for pattern recognition of pathogens by the innate immune system is defined by cooperation between toll-like receptors.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 97, 13766-13771 (2000).</li>
<li>Lammermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+swarms+require+LTB4+and+integrins+at+sites+of+cell+death+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo.</a> Nature. 498, 371-375 (2013).</li>
<li>Carlin, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nr4a1-dependent+Ly6C%28low%29+monocytes+monitor+endothelial+cells+and+orchestrate+their+disposal%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Nr4a1-dependent Ly6C(low) monocytes monitor endothelial cells and orchestrate their disposal.</a> Cell. 153, 362-375 (2013).</li>
<li>Hamon, P., Rodero, M. P., Combadiere, C., Boissonnas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+mouse+bone+marrow+monocytes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Tracking mouse bone marrow monocytes in vivo.</a> J Vis Exp. , (2015).</li>
<li>Iqbal, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+CD68+promoter+GFP+transgenic+mice+allow+analysis+of+monocyte+to+macrophage+differentiation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human CD68 promoter GFP transgenic mice allow analysis of monocyte to macrophage differentiation in vivo.</a> Blood. 124, e33-e44 (2014).</li>
<li>Jenne, C. N., Wong, C. H., Petri, B., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+spinning-disk+confocal+microscopy+for+the+intravital+analysis+of+platelet+dynamics+in+response+to+systemic+and+local+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">The use of spinning-disk confocal microscopy for the intravital analysis of platelet dynamics in response to systemic and local inflammation.</a> PloS One. 6, e25109(2011).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Le metodologie descritte in questo manoscritto forniscono un approccio coerente per studiare in modo efficiente monociti e il comportamento dei neutrofili nelle vene mesenteriche in condizioni di stato e infiammatorie costante. La fase cruciale della preparazione è l&#39;immobilizzazione dell&#39;intestino con tessuti PBS-bagnate. Se eseguita correttamente, vasi mesenterici sono ben esposti sul vetrino per l&#39;acquisizione delle immagini. Ciò consente la selezione di vari campi di interess...

<html> Neutrofili e monociti sono cellule del sistema immune innato che circolano continuamente nel sangue. Su lesioni o infezioni, segnali infiammatori inducono leucociti diapedesi in tessuti danneggiati e infetti, qui l&#39;avvio di una risposta immunitaria cellulare 1-3. La rapidità di leucociti mobilizzazione determina l&#39;esito positivo delle risposte immunitarie. Questi processi intricati basano su molecole specifiche (ad esempio, selectine, chemochine endotelio-bound) presenti sull&#39;endotelio infiammata che aiutano per la creazione di contatti tra adesivi leucociti circolanti e l&#39;endotelio 1-3 .Per ottenere approfondimenti sulle molecole implicate nella leucociti assunzione in cascata, è importante visualizzare la cinetica di reclutamento di cellule e per monitorare il comportamento di ciascuna cella / popolazione. Un metodo efficace consiste microscopia intravitale su topi transgenici che esprimono proteine ​​fluorescenti in cellule di interesse. content &quot;&gt; Ad oggi, diversi approcci usando la microscopia intravitale sono stati sviluppati per l&#39;immagine del sistema vascolare 4,5. Ad esempio, l&#39;imaging del derma orecchio vascolarizzazione o vene mesenteriche mediante microscopia confocale intravitale è stato utilizzato per identificare il comportamento pattugliamento delle Ly6C murino monociti bassi e umano CD14 dim CD16 + monociti sul lato luminale dei vasi sanguigni a regime di 6-8. Il modello di vascolarizzazione del mouse cremastere viene spesso utilizzato per monitorare il comportamento di neutrofili o Ly6C infiammatoria elevati monociti in condizioni infiammatorie o ischemiche in topi transgenici. In tale caso, Cremaster è stimolata mediante iniezione intrascrotale di IL1β, CCL2, TNFβ o fMLP. Dopo 2-4 ore, i tessuti vengono poi chirurgicamente esteriorizzate e analizzati da confocale microscopio intravitale 9-11. Il protocollo seguente descrive un metodo per monitorare monociti e neutrofili contemporaneamente con qualsiasifluorescenza invertito microscopio confocale. Inoltre, il nostro metodo descrive come immagine stessa nave prima (condizione di stato stazionario) e dopo l&#39;infiammazione e come seguire la cinetica di reclutamento dei leucociti. A questo scopo, si usa il CX 3 CR1 topo GFP / peso, il cui monociti esprimere eGFP, iv iniettato con un arancio neutrofili murini dye-etichettati. Utilizzando un microscopio confocale invertito, è possibile (1) per monitorare e analizzare le pattugliamento Ly6C basse monociti in condizioni stazionarie e (2) a seguire l&#39;assunzione di entrambi i monociti e neutrofili nella stessa nave dopo infiammazione locale. Qui creiamo le condizioni infiammatorie utilizzando l&#39;agonista TLR2 / TLR1 Pam3CSK4 12. Inoltre, tali immagini può aiutare a determinare il ruolo di specifiche molecole di interesse nelle varie fasi della cascata reclutamento dei leucociti se eseguita su specifici topi knock-out o in presenza di anticorpi bloccanti 6,9,13.

<table><tbody><tr><td>Tubi a fondo tondo in polistirene da 5 ml&nbsp;</td><td>Beckton Dickinson</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>10x CFI Plan Apochromat 0.45&nbsp; &nbsp; DT: 4 mm</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20x CFI Piano Apocromatico VC 0,75 DT:1mm&nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Tracker Arancione CMRA Dye</td><td>Life Technologies</td><td>C34551</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Magnet</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Mouse Kit di arricchimento dei neutrofili</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>19762</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>PAA</td><td>A15-042</td><td></td></tr><tr><td>Olio da immersione Tipo A</td><td>Nikon</td><td></td><td>qualsiasi olio viscoso&nbsp;</td></tr><tr><td>Life Box Sistema di controllo della temperatura</td><td>Life Imaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale Nikon A1R</td><td>Microscopio</td> invertito Nikon <td>A1R</td><td>, tavolino x/y/z motorizzato, software elementi NIS</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>senza rosso fenolo DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>21041-025</td><td>qualsiasi terreno privo di rosso fenolo è adatto</td></tr><tr><td>PAM3CSK4</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-pms</td><td>ricostituire in PBS</td></tr><tr><td>Siero di ratto</td><td>Tecnologie</td><td></td> per le cellule staminali <td>incluse nel kit di arricchimento dei neutrofili del topo EasySep</td></tr><tr><td>Piatto di coltura tissutale 100</td><td>TPP</td><td>93100</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging neutrofili e monociti in mesenterica veins intravitale microscopia su topi anestetizzati in tempo reale

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Risposta immunitaria efficace dipende da una rapida mobilitazione dei leucociti del sangue al sito di infezione o lesioni. Indagare la migrazione dei leucociti in vivo è di fondamentale importanza per la comprensione delle basi molecolari della migrazione dei leucociti transendoteliale e l&#39;interazione con l&#39;endotelio vascolare. Un approccio potente coinvolge microscopia intravitale su topi transgenici che esprimono proteine ​​fluorescenti in cellule di interesse. Qui vi presentiamo un protocollo per i monociti imaging e neutrofili nel CX 3 CR1 GFP / peso del mouse iv iniettato con arancio neutrofili dye-etichettati con un microscopio confocale invertito. Film time-lapse raccolti da 30 minuti a diverse ore dell&#39;imaging permettere l&#39;analisi del comportamento dei leucociti nelle vene mesenteriche sia in condizioni di stato e infiammatorie costante. Abbiamo inoltre descritti i passi per indurre localmente infiammazione dei vasi sanguigni con TLR2 / TLR1 agonisti Pam3SK4 e monitorare la subsequent reclutamento dei neutrofili e monociti. La tecnica presentata può anche essere utilizzato per monitorare altre popolazioni di leucociti e indagare le molecole implicate nel reclutamento dei leucociti o nel traffico con altri stimoli o topi transgenici.

Il manoscritto descrive un protocollo ottimizzato in modo da controllarne il comportamento di monociti e neutrofili nelle vene mesenteriche di topi anestetizzati in tempo reale. L&#39;uso di una camera 37 ° C-termostatato è obbligatoria per mantenere la temperatura del mouse e anche a causa della temperatura di circolazione dipendente leucociti. Preparazione del mouse viene visualizzato in Figura 1. La Figura 2 mostra tutta la zona visto al microscopio. Luce trasmessa permette l&#39;ide...

Descriviamo un protocollo per monitorare il comportamento dei neutrofili e dei monociti nelle vene mesenteriche in condizioni stazionarie e infiammatorie utilizzando la microscopia confocale intravitale su topi anestetizzati.

Imaging neutrofili e monociti in mesenterica Veins intravitale Microscopia su topi anestetizzati in tempo reale

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

L'obiettivo generale di questa procedura di microscopia confocale intravitale è monitorare la dinamica di neutrofili e monociti in vene mesenteriche in condizioni di stato stazionario e infiammatorie nei topi. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'immunologia, come ad esempio quali siano le basi molecolari della migrazione dei leucociti, del reclutamento e dell'interazione con l'endotelio vascolare. I principali vantaggi di questa tecnica sono la capacità di tracciare e analizzare la sorveglianza dei monociti LY6C-low in condizioni di stato stazionario e di seguire il reclutamento sia di monociti che di neutrofili nello stesso vaso dopo stimoli infiammatori locali. A dimostrazione della procedura sarà Stefan Ler, il tecnico del laboratorio. Per preparare una sospensione cellulare singola dal midollo osseo, sterilizzare le zampe posteriori di un topo di otto-dodici settimane con etanolo al 70% e quindi utilizzare un bisturi per prelevare femori e tibie; quando tutti gli ossi sono stati staccati.Risciacquare le zampe con etanolo al 90% e trasferire le ossa in una piastra di coltura riempita con PBS. Successivamente, in una cappa da coltura, utilizzare un bisturi per pulire i femori e le tibie e separarli all'articolazione del ginocchio. Poi, tagliare le estremità delle ossa e utilizzare una siringa da un millilitro caricata con mezzo di preparazione, dotata di un ago da 23 gauge, per lavare il midollo da ciascuna ossa in un tubo conico da 50 millilitri.Disperdere gli aggregati cellulari passandoli nuovamente attraverso la punta dell'ago, quindi portare il volume totale della sospensione cellulare a 25 millilitri con mezzo fresco, centrifugare le cellule e poi risospendere. Sospendere il pellet in un millilitro di tampone per la lisi dei globuli rossi e trasferire le cellule in un tubo conico da 15 millilitri posto sul ghiaccio. Dopo 30 secondi, arrestare la lisi aggiungendo 10 millilitri di mezzo di preparazione.Centrifugare nuovamente le cellule e risospendere il pellet in due millilitri aggiuntivi di mezzo di preparazione per arricchire i neutrofili mediante selezione negativa. Per prima cosa, incubare le cellule del midollo osseo con 150 microlitri di cocktail di arricchimento per neutrofili murini a ghiaccio per 10 minuti.Al termine dell'incubazione, aggiungere 10 millilitri di DMEM senza rosso fenolo. Capovolgere il tubo una volta e centrifugare le cellule. Ri-sospendere il pellet in 1,75 millilitri di mezzo di preparazione e trasferire le cellule in un tubo rotondo in polistirene da 5 millilitri.Quindi incubare le cellule con 250 microlitri di cocktail di selezione con biotina su ghiaccio per 10 minuti. Al termine dell'incubazione, risospendere le particelle magnetiche del kit di isolamento cellulare mediante vortex per 30 secondi. Quindi incubare le cellule con 500 microlitri delle particelle su ghiaccio per 10 minuti.Al termine dell'incubazione, posizionare il tubo sul magnete. Dopo tre minuti, capovolgere il magnete in un nuovo tubo in polistirene da cinque millilitri con fondo rotondo. Per raccogliere le cellule non marcate, posizionare il tubo contenente le cellule non marcate sul magnete.Dopo tre minuti, capovolgere il magnete in un tubo conico da 15 millilitri per trasferire le cellule non marcate, lasciando l'ultima goccia nel tubo. Successivamente, portare il volume a cinque millilitri con dm fresco privo di rosso fenolo. Ora aggiungere mezzo microlitro del colorante citoplasmatico appropriato, come il colorante per cellule tracker arancione utilizzato in questo caso, alle cellule a 37 gradi Celsius.Dopo due minuti a 37 gradi Celsius, lavare le cellule con 2,5 millilitri di mezzo di preparazione e risospendere il pellet in un millilitro di mezzo di preparazione in una provetta da 1,5 millilitro, contare le cellule e quindi incubarle per cinque minuti a 37 gradi Celsius. Dopo aver centrifugato le cellule, risospendiamo il pellet in un millilitro di PBS seguito da un'altra centrifugazione mentre le cellule stanno centrifugando. Utilizzare dell'olio per fissare un coprivetrino di vetro da 35 millimetri a una piastra per colture cellulari da 10 centimetri dotata di un foro con diametro di 30 millimetri.Quindi risospendere il pellet a una concentrazione di dieci alla settima cellula per 100 microlitri di PBS e porre le cellule sul ghiaccio il più rapidamente possibile dopo la marcatura. Iniettare per via endovenosa le cellule di neutrofili marcate in un topo CX3CR1 GFP anestetizzato di età compresa tra otto e dodici settimane e posizionare il topo su un tappetino riscaldante. Applicare immediatamente un unguento sugli occhi dell'animale e utilizzare le forbici per aprire la cute addominale, esponendo il peritoneo, quindi praticare un'incisione sul peritoneo con le forbici per esporre l'intestino.Quindi somministrare 200 microlitri di PBS a 37 gradi Celsius nella cavità peritoneale e posizionare il topo a faccia in giù sopra la piastra di coltura tissutale per rimuovere gli intestini dalla cavità peritoneale esercitando una pressione delicata. Successivamente, utilizzando bastoncini di cotone sterili, arrotolare con cura gli intestini sul vetrino per esporre i vasi mesenterici e immobilizzare il tessuto con pezzetti di carta da filtro inumiditi con PBS a 37 gradi Celsius, al fine di ridurre i movimenti derivanti dalla peristalsi. È molto importante prendersi il tempo necessario per immobilizzare con attenzione l’intestino utilizzando strisce di carta imbevute di PBS.Altrimenti, i movimenti derivanti dalla peristalsi durante l'acquisizione delle immagini rovineranno l'esperimento. Successivamente, trasferire la piastra per colture cellulari e il topo in una camera termostatica a 37 gradi Celsius posizionata su un supporto personalizzato di un microscopio invertito ed eseguire una seconda somministrazione di anestetico per via intramuscolare alla zampa posteriore. Impostare ora i laser appropriati alla potenza più bassa necessaria per evitare fototossicità indotta dal laser e lasciare riposare il topo per 30 minuti.Una volta che l'animale si è ripreso, registrare il primo filmato per 30 minuti in condizioni di stato stazionario. Successivamente, per indurre l'infiammazione del vaso sanguigno, aggiungere una goccia di 20 microlitri di PBS contenente 100 microgrammi dell'agonista TLR due TLR uno PAM tre CSK quattro direttamente sui vasi immaginati. Infine, acquisire un secondo filmato avendo cura di controllare il fuoco dopo l'aggiunta dell'agonista, poiché l'infiammazione induce cambiamenti nella larghezza dell'endotelio, alterando il fuoco dell'asse Z. Qui, i diversi passaggi di elaborazione delle immagini per il primo punto temporale di un filmato acquisito in condizioni di stato stazionario, come appena dimostrato, sono mostrati in questo filmato.Il monitoraggio dei monociti verdi LASIK cilo in condizioni di stato stazionario può essere visualizzato insieme ai neutrofili rossi osservati in circolo nel torrente ematico. Qui, lo stesso campo di interesse è mostrato 90 minuti dopo l'aggiunta di PAM three CSK four, che determina il reclutamento massiccio di neutrofili e monociti sulla parete endoteliale, che i monociti analizzano meticolosamente. Utilizzando il software appropriato, è possibile tracciare i percorsi esatti dei monociti e dei neutrofili mentre sorvegliano l'endotelio, prima e dopo l'inizio dell'infiammazione.È importante notare che una perdita di fuoco sull'asse Z o uno spostamento XY può verificarsi a causa dei movimenti intestinali, compromettendo l'esperimento. Questa tecnica può essere ulteriormente modificata utilizzando diversi modelli di topi geneticamente modificati o iniettando anticorpi bloccanti o farmaci farmaceutici per determinare il ruolo di specifiche molecole di interesse nel comportamento dei leucociti. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come monitorare la dinamica dei leucociti saturi nelle vene mesenteriche.

imaging-neutrophils-monocytes-mesenteric-veins-intravital-microscopy

Research

Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Descriviamo un protocollo di microscopia brightfield intravitale per la misurazione dinamica dei neutrofili, le interazioni delle cellule endoteliali durante il reclutamento dei neutrofili in risposta alla sorgente di un fattore chemiotattico dei neutrofili in vivo. Crawling dei neutrofili intraluminale, migrazione e chemiotassi transendoteliale nel tessuto muscolare del mouse cremastere vengono visualizzati con il tempo trascorso fotografia-video e monitorati con ImageJ.

Monitoraggio Crawling neutrofili intraluminale, migrazione e chemiotassi transendoteliale in tessuto al microscopio video intravitale

In questo video, dimostriamo la visualizzazione in tempo reale delle interazioni cellula del sangue-endoteliale nelle vene mesenteriali di un modello murino iniettato per via intraperitoneale con lipopolisaccaride.

Microscopia intravitale per analizzare le interazioni tra cellule del sangue ed endoteliali in un modello murino di infiammazione

Qui riportiamo una tecnica sperimentale di fluorescenza microscopia intravitale di visualizzare eterotipiche piastrine-neutrofili interazioni sul endotelio attivato durante l'infiammazione vascolare e la formazione di trombi nei topi vivi. Questa tecnologia microscopica sarà prezioso per studiare il meccanismo molecolare della malattia vascolare e per testare agenti farmacologici in condizioni fisiopatologiche.

In tempo reale di immagine degli eterotipica piastrine-neutrofili interazioni sull&#39;endotelio Attivato durante l&#39;infiammazione vascolare e la formazione di trombi in topi vivi

Questa applicazione semplificata della microscopia intravitale delle vene mesenterarie nei topi può essere utilizzata in diversi modelli di infiammazione per osservare le interazioni leucociti-endoteliali e piastrine-leucociti.

Interazioni intravitale Microscopia di leucociti-endoteliali e piastrine-leucociti in Mesenterial Vene Mice

Questo protocollo attuale impiega reporter fluorescenti, marcatura in vivo e tecniche di imaging intravitale per consentire il monitoraggio del processo dinamico di priming dei neutrofili negli animali viventi.

Imaging intravitale di neutrofili adescamento Utilizzando IL-1b Promoter-driven DsRed topi reporter

Il protocollo descrive un nuovo modello di camera a finestra del femore murino che può essere utilizzato per tracciare il movimento delle cellule nel midollo osseo femorale in vivo. La microscopia a fluorescenza multifotone intravitale viene utilizzata per visualizzare tre componenti del midollo osseo femorale (vascolarizzazione, matrice di collagene e neutrofili) nel tempo.

Femore finestra del modello Camera per<em&gt; In Vivo</em&gt; Monitoraggio delle cellule nel midollo osseo murino

I monociti sono mediatori importanti di arteriogenesi nel contesto della malattia arteriosa periferica. Utilizzando una matrice del tipo di membrana basale e la microscopia intravital, questo protocollo indaga l'angiogenesi di homing e tumore-relativa del monocito dopo l'iniezione del monocito nel modello murino di legatura dell'arteria femorale.

Microscopia intravital del monocito Homing e l'angiogenesi tumore-relativa in un modello murino della malattia arteriosa periferica

Descriviamo un metodo per visualizzare gli IEL con etichettatura GFP utilizzando l'imaging intravitale dell'intestino piccolo murino mediante microscopia confocale del disco rotante invertita. Questa tecnica consente il monitoraggio delle cellule vive all'interno della mucosa fino a 4 h e può essere utilizzata per studiare una varietà di interazioni immuno-epiteliali intestinali.

Imaging intravitale dei linfociti intraettali a Murine Small Intestine

Il reclutamento di leucociti e piastrine costituisce una componente essenziale necessaria per l'efficace crescita delle arterie collaterali durante l'arteriogenesi. La microscopia multifotonica è uno strumento efficiente per tracciare la dinamica cellulare con alta risoluzione spazio-temporale in vivo e meno fototossicità per studiare il reclutamento e lo stravaso dei leucociti durante l'arteriogenesi.

Multiphoton Intravital Imaging per il monitoraggio del reclutamento dei leucociti durante l'arteriogenesi in un modello murino di arti posteriori

La migrazione dei neutrofili si basa sul rapido e continuo rimodellamento della membrana plasmatica in risposta al chemioattrattivo e alle sue interazioni con il microambiente extracellulare. Qui descritta è una procedura basata sulla microscopia subcellulare intravitale per studiare la dinamica del rimodellamento della membrana nei neutrofili iniettati nell'orecchio di topi anestetizzati.

Imaging della migrazione dei neutrofili nella pelle del topo per studiare il rimodellamento della membrana subcellulare in condizioni fisiologiche

Questo protocollo presenta un metodo per indurre il danno da ischemia-riperfusione mesenterica e visualizzare le trappole extracellulari dei neutrofili (NET) nelle venule mesenteriche utilizzando la microscopia intravitale. Il flusso sanguigno nell'arteria mesenterica superiore è stato limitato per 1 ora, seguito da riperfusione, consentendo la quantificazione diretta dell'adesione leucocitaria e della NETosi.

Visualizzazione delle trappole extracellulari dei neutrofili nelle venule mesenteriche dopo danno da ischemia-riperfusione mesenterica tramite microscopia intravitale

Impara a monitorare neutrofili e monociti in vene mesenteriche mediante microscopia confocale intravivente su topi anestetizzati. Questo metodo consente di studiare la migrazione leucocitaria in condizioni di omeostasi e infiammazione.

Imaging neutrofili e monociti in mesenterica Veins intravitale Microscopia su topi anestetizzati in tempo reale

Esplora altri video