Imaging neutrofili e monociti in mesenterica Veins intravitale Microscopia su topi anestetizzati in tempo reale

L'obiettivo generale di questa procedura di microscopia confocale intravitale è monitorare la dinamica dei neutrofili e dei monociti nelle vene mesenteriche allo stato stazionario e in condizioni infiammatorie nei topi. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'immunologia, come ad esempio quali sono le basi molecolari della migrazione dei leucociti, del reclutamento e dell'interazione con l'endotelio vascolare. I principali vantaggi di questa tecnica sono la capacità di tracciare e analizzare il pattugliamento di monociti bassi LY 60 in condizioni di stato statistico e di seguire il reclutamento di monociti e neutrofili nello stesso vaso Dopo stimoli infiammatori locali che dimostrano la procedura sarà Stefanler il tecnico del laboratorio Per preparare una preparazione a singola cellula dal midollo osseo, Sterilizzare le zampe posteriori di un topo di 8-12 settimane con etanolo al 70%, quindi utilizzare un bisturi per raccogliere i femori e la tibia è quando tutte le ossa sono state scollegate.

Sciacquare le gambe con etanolo al 90% e trasferire le ossa in una capsula di coltura piena di PBS. Quindi, in un cappuccio di coltura, utilizzare il bisturi per pulire i femori e la tibia e per separarli all'articolazione del ginocchio. Successivamente, tagliare le estremità delle ossa e utilizzare una siringa da un millilitro costruita con terreno di preparazione dotato di un ago da 23 gauge per lavare il midollo da ciascun osso in un tubo conico da 50 millilitri.

Interrompere gli aggregati cellulari facendoli passare indietro attraverso la punta dell'ago, quindi portare il volume totale della sospensione cellulare fino a 25 millilitri con una preparazione fresca, centrifugare a metà le cellule, quindi risussare. Sospendi il palato in un millilitro di tampone di lisi dei globuli rossi e trasferisci le cellule in una provetta conica da 15 millilitri su ghiaccio. Dopo 30 secondi, interrompere la lisi con 10 millilitri di preparato. Medio.

Gira di nuovo le celle e Resus sospende il pellet. Altri due millilitri di terreno di preparazione per arricchire i neutrofili mediante selezione negativa. Per prima cosa, incubare le cellule del midollo osseo con 150 microlitri di cocktail di arricchimento di neutrofili di topo su ghiaccio per 10 minuti.

Al termine dell'incubazione a 10 millilitri di dmem libero da rosso fenolo. Capovolgere il tubo una volta e far girare le cellule. Risospendere il pellet in 1,75 millilitri di terreno di preparazione e trasferire le celle in un tubo a fondo tondo di polistirene da cinque millilitri.

Quindi incubare le cellule con 250 microlitri di cocktail di selezione di biotina con ghiaccio per 10 minuti. Al termine dell'incubazione, sospendiamo le particelle magnetiche dal kit di isolamento cellulare con 30 secondi di vortexing. Quindi incubare le cellule con 500 microlitri di particelle su ghiaccio per 10 minuti.

Al termine dell'incubazione, posizionare il tubo nel magnete. Dopo tre minuti, capovolgere il magnete in un nuovo tubo a fondo tondo in polistirene da cinque millilitri. Per raccogliere le celle non etichettate, posizionare il tubo di celle non etichettate nel magnete.

Dopo tre minuti, capovolgere il magnete in un tubo conico da 15 millilitri per trasferire le cellule non etichettate lasciando l'ultima goccia nel tubo. Quindi portare il volume fino a cinque millilitri con dm fresco privo di rosso fenolo. Ora aggiungi mezzo microlitro del colorante citoplasmatico appropriato, come l'arancione tracciatore di cellule usato qui, alle cellule a 37 gradi Celsius.

Dopo due minuti, a 37 gradi Celsius, lavare le cellule con 2,5 millilitri di terreno di preparazione e risospendere il pellet in un millilitro di terreno di preparazione in una provetta da 1,5 millilitri, contare le cellule e poi incubarle per cinque minuti a 37 gradi Celsius. Dopo aver fatto girare le cellule, sospendiamo il pellet in un millilitro di PBS seguito da un'altra centrifugazione mentre le celle girano. Utilizzare l'olio per fissare un vetrino coprioggetto da 35 millimetri a una piastra di coltura tissutale da 10 centimetri con un foro di 30 millimetri di diametro.

Quindi risospendere il pellet una volta da 10 a sette celle per 100 microlitri di PBS e posizionare le cellule sul ghiaccio il prima possibile dopo l'etichettatura. Iniettare le cellule neutrofile marcate per via endovenosa in un topo anestetizzato di età compresa tra 8 e 12 settimane CX tre CR e GFP e posizionare il mouse su un termoforo. Quindi applicare immediatamente l'unguento sugli occhi dell'animale e utilizzare le forbici per aprire la pelle addominale, esponendo il peritoneo, incidere il peritoneo con le forbici per esporre l'intestino.

Quindi somministrare 200 microlitri di PBS a 37 gradi Celsius nella cavità peritoneale e girare il topo a faccia in giù sul piatto di coltura tissutale per rimuovere l'intestino dalla cavità peritoneale con una leggera pressione. Quindi, utilizzando cotton fioc sterili, arrotolare con cura l'intestino sul vetrino coprioggetti per esporre i vasi mesenterici e immobilizzare il tessuto con pezzi di carta velina bagnati con PBS a 37 gradi Celsius per diminuire i movimenti derivanti dalla peristalsi. È molto importante prendersi il tempo necessario per immobilizzare con cura l'intestino con tessuti pesati PBS.

In caso contrario, i movimenti derivanti dal peristaltico durante l'acquisizione dell'immagine rovineranno l'esperimento. Successivamente, trasferire il piatto di coltura tissutale e il topo in una camera termostatica a 37 gradi Celsius su un tavolino di traccia personalizzato di un microscopio invertito e somministrare un secondo ciclo di anestetici per via intramuscolare alla zampa posteriore. Ora imposta i laser appropriati alla potenza più bassa necessaria per evitare la fototossicità indotta dal laser e lascia riposare il mouse per 30 minuti.

Quando l'animale si è ripreso, registrare il primo filmato per 30 minuti in condizioni di stato stazionario. Quindi, per avviare l'infiammazione dei vasi sanguigni, erogare una goccia da 20 microlitri di PBS contenente 100 microgrammi di TLR, due TLR, un agonista, PAM, tre CSK, quattro direttamente sui vasi visualizzati. Infine acquisire un secondo film avendo cura di controllare la messa a fuoco dopo l'aggiunta dell'agonista poiché l'infiammazione induce cambiamenti nella larghezza dell'endotelio, alterando la messa a fuoco dell'asse Z qui, le diverse fasi dell'elaborazione dell'immagine per il primo punto temporale di un film acquisito in condizioni di stato stazionario, come appena dimostrato, sono mostrate in questo filmato.

Il pattugliamento dei monocili verdi LASIK in condizioni di stato stazionario può essere visualizzato con neutrofili rossi osservati in circolazione nel flusso sanguigno. Qui. Lo stesso campo di interesse viene mostrato 90 minuti dopo l'aggiunta di PAM tre CSK quattro, con conseguente reclutamento massiccio di neutrofili e monociti sulla parete endoteliale, che i monociti scansionano meticolosamente utilizzando il software appropriato, i percorsi esatti dei monociti e dei neutrofili. Il pattugliamento dell'endotelio può essere monitorato prima e dopo l'inizio dell'infiammazione.

È importante notare che una perdita di messa a fuoco sull'asse Z o uno spostamento XY possono verificarsi come conseguenza di movimenti intestinali che rovinano l'esperimento. Questa tecnica può essere ulteriormente modificata utilizzando diversi modelli di topi geneticamente modificati o iniettando anticorpi bloccanti o farmaci per determinare il ruolo di specifiche molecole di interesse nel comportamento dei leucociti. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come monitorare la dinamica della saturazione dei leucociti nelle vene mesenteriche.