La quantificazione di intra-peritoneale del cancro ovarico metastasi

L'obiettivo generale di questo esperimento è determinare il carico tumorale relativo delle metastasi del carcinoma ovarico intra-peritoneale in un modello murino di xenotrapianto ortotopico singenico. Questo nuovo metodo per l'imaging e la quantificazione del carico tumorale relativo può aiutarci a rispondere a domande chiave nella regolazione delle metastasi del cancro ovarico. Il vantaggio fondamentale di questa tecnica è che, eliminando la miscelazione degli spettri fluorescenti, l'autofluorescenza tissutale viene rimossa dalle immagini, consentendo la misurazione del carico tumorale relativo standardizzato.

Questa tecnica fornisce informazioni sulle metastasi del cancro ovarico umano con implicazioni per il monitoraggio dell'efficacia delle terapie. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale perché stiamo accoppiando una solida tecnica di imaging con una procedura analitica per estrarre dati quantitativi dalle immagini. A dimostrare la procedura oggi sarà Yueying Liu, il responsabile del programma di laboratorio per lo Stack Lab.

Dopo 10 settimane di crescita delle cellule tumorali, posizionare il corpo di ciascun topo anestetizzato in un sistema di imaging ottico per piccoli animali, uno alla volta. Scansiona tutti i topi della coorte in ogni momento. Per osservare le cellule tumorali marcate in fluorescenza, eseguire un'acquisizione multispettrale per raccogliere un totale di cinque immagini.

Seleziona un'esposizione standard di 15 secondi, binning due a due, un campo visivo di 16 centimetri e uno stop F di 1,1. Successivamente, acquisisci un'immagine di riflettanza dell'intero animale utilizzando la luce bianca di un filtro di eccitazione aperto, un filtro di emissione aperto, un'esposizione standard di 0,2 secondi con binning due a due e un campo visivo di 16 centimetri, con uno stop F di 2,8. Dopo l'eutanasia, utilizzare le forbici da dissezione appuntite per tagliare la pelle anteriormente lungo la linea mediana ventrale del topo, dalla parte superiore delle cosce alla parte inferiore della gabbia toracica.

Separare delicatamente la pelle dal tessuto peritoneale, facendo attenzione a non perforare la parete peritoneale. Tagliate poi lateralmente, sia lungo la parte inferiore della gabbia toracica, sia lungo la parte superiore delle cosce, in modo da creare due lembi di pelle. Posizionare il mouse sul lato ventrale dello scanner, in modo che la cavità peritoneale sia rivolta verso il basso con i lembi cutanei aperti.

Scansiona il topo con i suoi organi in situ, utilizzando gli stessi parametri precedentemente utilizzati per il topo vivo. Ora, continua a sezionare il topo estraendo il fegato, l'omento, il pancreas, lo stomaco, il diaframma e l'intestino tenue e crasso utilizzando tecniche standard. Inoltre, rimuovere il peritoneo sinistro e destro, le ovaie, i reni, il mesentere e, infine, il cuscinetto adiposo.

Osservare, enumerare e registrare ciascuno dei tumori visibili sugli organi. Usa un calibro per misurare il diametro di ogni tumore. Designare i tumori che hanno un diametro inferiore a due millimetri come piccoli, tra due e cinque millimetri come medi e maggiori di cinque millimetri come grandi.

Quindi, posizionare gli organi sul modello di scansione degli organi, che si trova nella Figura Quattro del protocollo di testo allegato, e utilizzarlo per organizzare la posizione di ciascun organo durante la scansione successiva. Utilizzare PBS per mantenere gli organi umidi. Scansiona ogni foglio di organi utilizzando il sistema di imaging ottico per piccoli animali e i parametri precedentemente utilizzati.

Dopo la scansione, posizionare gli organi in formaldeide al 10% ed elaborarli per l'istologia utilizzando tecniche standard. Al fine di ridurre la quantità di autofluorescenza in ciascuna scansione multispettrale, caricare prima il file spettrale in vivo della proteina fluorescente rossa seguito dal file rosso in vivo del pavimento automatico nella finestra delle immagini non miscelate e selezionare un-mix. Quindi esporta i file dot bip in un formato dot tif non scalato a 16 bit e caricali nell'immagine J, andando su file, apri e quindi selezionando il file dot tif a 16 bit corretto.

Quindi, vai al menu immagine e seleziona Regola, quindi Contrasto luminosità e imposta il valore minimo visualizzato su zero e il valore massimo visualizzato su più 35353. Quindi, di nuovo nel menu immagine, vai a cercare tabelle e seleziona rosso caldo. Vari modelli animali richiedono livelli di luminosità diversi, ma è importante mantenere la luminosità costante durante un determinato studio.

Utilizzando lo strumento di selezione a mano libera, disegna una regione di selezione di interesse a forma libera attorno a ciascun organo. La regione di interesse in forma libera dovrebbe essere disegnata vicino ai bordi dell'organo. Quindi, digitare control e M per utilizzare lo strumento di misurazione per calcolare la superficie di ciascun organo.

Registrare questi dati in un foglio di calcolo. Con l'area di interesse disegnata attorno a ciascun organo, fare clic con il pulsante destro del mouse e selezionare duplica per includere solo l'organo. Quindi, in immagine, vai su regola, quindi su soglia e imposta il livello di soglia inferiore su più 1, 200 e il livello di soglia superiore su più 1, 700.

Inoltre, controlla lo sfondo scuro, quindi seleziona OK. In questo modo verranno selezionate solo le regioni più luminose. Le immagini potrebbero richiedere la manipolazione manuale dei cursori di soglia nell'immagine J in modo che le aree precedentemente più luminose vengano selezionate per la fase di analisi, come mostrato sopra.

Diversi modelli di malattia richiederanno vincoli di soglia diversi, ma è importante mantenere i livelli di soglia coerenti in un determinato studio. In Analizza selezionare Analizza particelle e modificare le dimensioni del pixel al quadrato da 10 a infinito. Scegliere di visualizzare i contorni, quindi selezionare per selezionare Visualizza solo i risultati, quindi fare clic su OK.

Questo misurerà sia le aree che le densità integrate grezze delle regioni luminose ritenute tumori. Registrare i valori dell'area superficiale e della densità grezza integrata di ciascuna selezione tumorale insieme nello stesso foglio di calcolo contenente le aree superficiali degli organi. Quindi, in Analizza, seleziona Strumenti e vai alla barra di calibrazione.

Aggiungere una barra della scala di calibrazione alle immagini degli organi. I montaggi possono contenere un numero maggiore o minore di organi, a seconda di un determinato studio. Successivamente, sotto file, vai su salva con nome e salva il montaggio sia come punto tif che come punto jpeg.

Quindi, apri il file dot jpeg degli organi e vai al menu di inserimento per aggiungere una casella di testo a ciascuna immagine. Aggiungi etichette di organi creando una casella di testo sotto ciascuna delle tre file di organi. Apri ciascuno dei file dot tif a 16 bit delle scansioni di tutto il corpo nell'immagine J in ordine di numero del mouse.

Quindi, vai al menu immagine e seleziona Regola, quindi Contrasto luminosità. Impostare il valore minimo visualizzato su zero e il valore massimo visualizzato su più 35353. Quindi, torna al menu immagine e per cercare le tabelle, quindi seleziona rosso caldo.

Una volta completato, salva il montaggio sia come file dot tif che come file dot jpeg. La linea cellulare di carcinoma ovarico murino ID8 che viene iniettata nei topi 10 settimane prima dell'imaging emette fluorescenza nel canale rosso e continua a farlo durante la crescita. L'imaging dal vivo con un sistema di imaging ottico per piccoli animali è in grado di visualizzare le cellule ID8 in espansione nel topo e fornisce un approccio più accurato rispetto alla semplice pesatura del topo per valutare il carico tumorale.

Dopo l'eutanasia e la rimozione dello strato ventrale della pelle, gli organi intatti possono essere visualizzati in modo più dettagliato. Tuttavia, i singoli organi posizionati sul modello di scansione dell'organo mostrano chiaramente il carico tumorale in ciascun organo. Il carico tumorale nell'omento e nel pancreas, nelle ovaie e nel mesentere del topo mostrato a sinistra è molto maggiore di quegli stessi organi nel topo mostrato a destra.

L'osservazione del carico tumorale differenziale è confermata quantitativamente sia in termini di area di servizio tumorale che di intensità del segnale tumorale. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere utilizzata per visualizzare fino a 18 topi vivi all'ora. La dissezione e l'imaging ex vivo dei singoli organi richiedono circa 20 minuti per campione.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la risonanza magnetica quantitativa per affrontare ipotesi come l'impatto dell'obesità sulle metastasi del cancro ovarico, come mostrato nel nostro articolo di ricerca sul cancro del 2015.