Name: Identificazione di ossido di metallo nanoparticelle in campioni istologici da avanzato Mapping Darkfield Microscopy e iperspettrale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: Scopri l'identificazione di nanoparticelle di ossido di metallo in campioni istologici tramite microscopia darkfield avanzata e imaging iperspettrale. Questo metodo rapido e non distruttivo supera le tecniche convenzionali.

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Gli autori ringraziano Günter Oberdörster, DVM, PhD e Alison Elder, PhD (Università di Rochester) e Mary Frame, PhD (Stony Brook University) per le collaborazioni di ricerca sugli animali che hanno portato a campioni di tessuto per l'analisi. Inoltre, gli autori ringraziano: Christina Rotondi (Albany Medical College Histology Core); Rani Sellers, DVM, PhD and Barbara Cannella, PhD (Albert Einstein College of Medicine Histology and Comparative Pathology Facility); Leonardo Bezerra e Ahlam Abuawad (membri del team di ricerca Brenner); e Leslie Krauss, Byron Cheatham ed Elyse Johnson (CytoViva). Questo lavoro è stato in parte sostenuto dalla sovvenzione CDC-NIOSH OH-009990-01A1 e dal NanoHealth and Safety Center, Stato di New York, assegnata a S.B.

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<li>Sondi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silver+nanoparticles+as+antimicrobial+agent%3A+a+case+study+on+E+coli+as+a+model+for+Gram+negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Colloid+Interface+Sc%22%5BJournal%5D)">Silver nanoparticles as antimicrobial agent: a case study on E coli as a model for Gram negative bacteria.</a> J Colloid Interface Sc. 275 (1), 177-182 (2004).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Per i campioni di tessuto che sono stati sottoposti a colorazione istologica convenzionale, l&#39;identificazione e l&#39;analisi di metalli nanoparticelle di ossido possono essere realizzati attraverso una combinazione di EDFM, mappatura HSI, e tecniche di analisi di immagine. Mentre vi è la flessibilità nella preparazione dei campioni per l&#39;esame istologico o immunoistochimica (ad esempio, utilizzando tessuti fissati o congelati; tipo di macchia), è importante che i campioni sono sezionate ad uno spessore di 5-10 micron per la visualizzazione ottimale. I campioni utilizzati qui sono stati fissati in formalina e incluso in paraffina prima di sezionamento con un microtomo rotativo di 6 micron di spessore, montati su vetrini per microscopio, macchiato con ematossilina eosina e coprioggetto. Tessuti della pelle suina da un cutaneo collaborazione ex vivo penetrazione di tossicologia sono stati utilizzati per questo studio. I tessuti sono stati esposti a nanoparticelle di ossido di metallo (allumina, silice, cerio) in sospensioni acquose. Rilevazione della regione (s) di interesse (eleme alto contrastonti) con EDFM è un primo passo importante che facilita la successiva mappatura e l&#39;analisi HSI. Campioni di controllo positivi e negativi devono essere esposte e analizzati in primo luogo per creare una libreria spettrale per riferimento. Gli spettri raccolti dal controllo positivo sono esportati in una libreria spettrale controllo positivo. Quindi, tutti gli spettri dalle immagini di controllo negativo sono sottratti dalla biblioteca spettrale del controllo positivo per migliorare la specificità (ridurre i falsi positivi). La libreria spettrale filtrato risultante è considerato il RSL che serve per l&#39;analisi di materiali di interesse. Tutti i campioni di tessuto subiscono lo stesso processo di imaging e vengono mappate contro il RSL. L&#39;immagine risultante conterrà solo le aree con elementi di interesse su uno sfondo nero. Questa immagine potrebbe quindi essere analizzato con ImageJ utilizzando le sue funzioni di soglia e di analisi di particelle per ottenere l&#39;area di particelle mappati per campo. I dati numerici ottenuti da ImageJ può essere esportazionecato di un foglio di calcolo per ulteriori analisi. È importante considerare che come campioni biologici sono intrinsecamente diversi l&#39;uno dall&#39;altro, e metodi di colorazione possono influenzare visualizzazione tramite EDFM e HSI, le impostazioni di esposizione devono essere determinati conformemente a quanto produce la migliore immagine ad alto contrasto per un tipo specifico di campione. Sebbene la riduzione di falsi positivi può essere raggiunto attraverso la filtrazione di librerie spettrali, è fondamentale avere controlli negativi affidabili che hanno evitato la contaminazione con l&#39;elemento di interesse, come spettri corrispondente a tale contaminazione potrebbe potenzialmente essere filtrata dalla libreria spettrale del controllo positivo , aumentando i tassi di falsi negativi. Inoltre, la gamma di intensità spettro che è rilevabile con il software di imaging iperspettrale non può superare il limite del software particolare (per questo studio, cioè 16.000 unità): aree con un elevato numero di particelle accumulate che producono spintensità ectral superiori al limite di intensità sono lasciati fuori della biblioteca spettrale, a causa del rischio di aumentare il numero di falsi negativi. Mentre il sistema HSI conferisce molti vantaggi rispetto ai metodi tradizionali, ci sono alcuni svantaggi e limitazioni da considerare. Una è che la grande quantità di dati ottici raccolti possono richiedere potenza di calcolo notevole. Un altro è che HSI può essere ad alta intensità di tempo, in particolare nelle fasi iniziali, quando si creano librerie spettrali di riferimento. Inoltre, il tempo di imaging può richiedere diversi minuti per l&#39;acquisizione di immagini, il che rende più lento di semplice di imaging in campo oscuro; tuttavia, è ancora più veloce di eseguire la preparazione del campione e la visualizzazione al microscopio elettronico. Inoltre, i sistemi complessi possono comportare molteplici spettri caratteristici, che richiedono lo sviluppo di controlli altamente specializzati e rendono la creazione di librerie di riferimento, universali standardizzate difficili 26. Infine, la tecnologiarisultati nique a risoluzione inferiore rispetto alle tecniche probe- o microscopia elettronica, come la microscopia a forza atomica o microscopia elettronica a trasmissione, che possono risolvere i singoli atomi. Risoluzione di questa tecnica è limitata a causa della sua natura fotonica, che impedisce di essere uno strumento di alta precisione per misurare dimensioni delle particelle a livello nanometrico o per localizzare con precisione materiali ad un livello sub-micron. Mentre la tecnica può essere in grado di individuare particelle entro certi compartimenti o organelli cellulari maggiore di 1 micron (come nuclei delle cellule), organelli piccole o caratteristiche sono difficili da visualizzare accuratamente con questo metodo. Da notare anche, data la sua risoluzione spaziale, questo metodo non può distinguere tra singole nanoparticelle e agglomerati 11. Altre considerazioni includono: alcuni materiali (come i metalli nobili) hanno molto più elevata riflettanza e profili spettrali distinti, che possono renderli più facilmente analyze e mappa spettralmente con questo strumento. Altri, come gli ossidi metallici semi-esaminati in questo studio e nanomateriali a base di carbonio 24, 27, può essere più difficile a causa della loro composizione elementare, la forma e seconda matrice. In due studi di inalazione murini di Mercer et al., Un sistema simile a quello impiegato in questo studio è stato usato al fine di individuare i nanotubi di carbonio nei polmoni e negli organi secondari in base al loro notevolmente alto contrasto con i tessuti circostanti. Tuttavia, la mappatura iperspettrale non è stata dimostrata in uno studio, probabilmente perché la forma unica di fibre di carbonio era un tratto sufficiente per l&#39;identificazione. Un&#39;altra considerazione riguarda specificamente ai tessuti: dal deposito di nanoparticelle di interesse di organi specifici attraverso normali processi biofisici è imprevedibile (e spesso si oggetto di studio), la determinazione di un controllo positivo applicabile può essere difficile e richiede la considerazione di come la generazione del controllo mIRITTO influenzare lo stato di un materiale di interesse. Ad esempio, se una libreria spettrale è creata da nanoparticelle cristalline di interesse, può essere difficile per mappare la libreria di quelle stesse nanoparticelle in tessuti o cellule a causa di cambiamenti negli spettri derivanti da alterazione della particella (ad esempio, per effetto del cambiamento pH, la dissoluzione, agglomerato, legame con le proteine) e il microambiente generale o matrice. Infine, la tecnica è limitata nella sua natura semi-quantitativa: può essere solo quantitativa come altre tecniche di microscopia bidimensionale di risoluzione simile, che significa che non può essere facilmente utilizzato per eseguire operazioni quali caratterizzano onere organo totale di un materiale. Nel complesso, EDFM e HSI offre numerosi vantaggi rispetto alle tecniche di imaging nanomaterial e caratterizzazione convenzionali, quali TEM, HAADF e DIC. EDFM / HSI permette per l&#39;acquisizione e l&#39;analisi delle immagini più veloce, che consente di risparmiare tempo e costi rispetto a più conven intensivaTecniche nali. Inoltre, la preparazione del campione per EDFM / HSI è tipicamente sia minima e non distruttivo, che consente di risparmiare tempo e permette anche per analisi più flessibile di un dato campione in quanto può essere utilizzato per altre tecniche. Inoltre, HSI è versatile, consentendo analisi dei materiali nanoscala di molte composizioni e in una varietà di matrici. Il team di ricerca sta lavorando per perfezionare il metodo descritto qui per altri materiali e tipi di campione, compresa una valutazione approfondita della specificità della tecnologia. Un passo successivo critico sotto inchiesta da parte del gruppo di ricerca è la convalida di queste tecniche contro gold standard tradizionali (ad esempio, Raman, TEM, SEM) per i materiali e tipi di tessuto di interesse.

Come nanomateriali sono sempre più utilizzati in una varietà di settori e applicazioni, vi è la necessità per nanoscala di imaging e caratterizzazione metodi che sono più rapidi, economico e conveniente di modalità tradizionali, come la microscopia elettronica. Per visualizzare nanoparticelle (NP) interazioni con le cellule, i tessuti e sistemi viventi, sono state impiegate molte tecniche ottiche, tra cui contrasto interferenziale differenziale (DIC) Microscopia 1 e approcci sul campo evanescenti, come riflessione interna totale (TIR) ​​o Vicino- microscopia a scansione campo ottico (NSOM) 2,3. Tuttavia, questi sono approcci analitici di fascia alta, fuori dalla portata della maggior parte dei laboratori non specializzati 4. La microscopia elettronica, compreso microscopia elettronica a trasmissione (TEM), è stato utilizzato anche per studiare l&#39;interazione con le cellule NP 5,6,7,8. Angolo alto anulare campo oscuro (HAADF) microscopia elettronica a scansione trasmissione è stato utilizzato per studiare l&#39;interazione di NPcon i virus 9. La microscopia confocale è un&#39;altra tecnica popolare usato per studiare le interazioni NP-cellula 10. Negli ultimi anni, l&#39;imaging iperspettrale (HSI) tecniche basate campo scuro-sono stati utilizzati come strumento di analisi promettente per lo studio nanoparticelle in matrici biologiche 11. Sistemi HSI generano una rappresentazione tridimensionale di dati spaziali e spettrali, noto come un ipercubo o DataCube 12. La mappa spaziale di variazione spettrale viene utilizzato per l&#39;identificazione dei materiali. Profili spettrali di materiali noti possono essere generati e utilizzati come librerie di riferimento per il confronto con campioni sconosciuti. Uno dei principali vantaggi con sistemi HSI è la sua capacità di combinare l&#39;imaging con spettroscopia, così da stabilire la posizione e distribuzione delle NP sconosciuti in vivo o ex vivo e collegandoli a un&#39;altra particella di riferimento noto, composizione simile. Ci sono diversi vantaggi dil&#39;utilizzo di sistemi HSI su tecniche di imaging convenzionali: è richiesta una minima preparazione del campione; preparazione del campione è in genere non distruttivo in natura; l&#39;acquisizione delle immagini e l&#39;analisi è più veloce; la tecnica è conveniente 13; e la distribuzione spaziale e l&#39;analisi di composti di composizione mista e / o in matrici complesse è più facilmente realizzabile 14. Per ricerche nanomateriali coinvolgono campioni preziosi, una delle considerazioni più importanti è la disponibilità di un metodo di imaging non distruttivo, che consente la possibilità di esaminare ripetutamente campioni di uno o più metodi. Ripetuti o più analisi possono desiderare di sviluppare set di dati globali che non sarebbero disponibili da un unico metodo. A questo proposito, studiando le sue proprietà ottiche è il modo più sicuro per analizzare il campione. Utilizzando un microscopio potenziato darkfield (EDFM) e sistema HSI per studiare la risposta ottica del campione - cioè Reflectance, ma anche di assorbanza e trasmittanza - l&#39;identificazione e la caratterizzazione caratteristica può essere effettuata 15. I potenziali endpoint caratterizzazione includono una valutazione della dimensione relativa e la forma di nanoparticelle o agglomerati e distribuzione di nanoparticelle all&#39;interno di un campione. In questo articolo, descriviamo metodi di mappatura specificamente per le nanoparticelle di ossido di metallo nel tessuto post mortem utilizzando un sistema HSI basato su un algoritmo partita pixel spettrale indicato come un mappatore angolo spettrale (SAM). Abbiamo scelto questa particolare applicazione, perché ha il potenziale per integrare attuale e futuro nella ricerca nanotossicologia vivo, in cui i modelli animali sono utilizzati per valutare le implicazioni sulla salute dell&#39;esposizione ai nanomateriali ingegnerizzati. L&#39;applicazione di questo metodo potrebbe anche informare ricerca di somministrazione di farmaci su scala nanometrica che utilizza modelli di tessuto o animali. In particolare, l&#39;assorbimento di nanoparticelle, distribuzione, metabolismo e l&#39;escrezione tutto organs e tessuti possono essere indagati con questo sistema. Un&#39;ampia varietà di applicazioni sono in fase di studio per l&#39;uso nella ricerca biomedica 11. Questo metodo potrebbe essere utilizzato per la valutazione di diversi campioni biologici (ad esempio vari tipi di tessuti, campioni di lavaggio broncoalveolare, e strisci di sangue), che sono stati esposti alle nanoparticelle di una varietà di composizioni elementari 16-19. Inoltre, questo metodo è utile per studiare nanoparticelle biodistribuzione in vivo e in vitro, che è pertinente per studi drug delivery nanoscala 11. Oltre campioni biologici, EDFM e HSI possono essere utilizzati per valutare nanoparticelle in campioni ambientali, come acqua di scarico 20. Valutazione dell&#39;esposizione professionale può essere facilitata mediante l&#39;uso di questa tecnica e, in quanto può essere utilizzato per valutare l&#39;efficacia dei dispositivi di protezione individuale per la prevenzione di penetrazione delle nanoparticelle. Inoltre, la ricerca team sta attualmente sviluppando un EDFM simile e il protocollo HSI per la valutazione dei campioni dei media filtranti di nanoparticelle raccolti da valutazioni di esposizione professionale. Mentre preparazione di questi diversi tipi di campioni per EDFM e HSI può variare, è importante che siano preparati in modo tale che essi possono essere facilmente visualizzate dal sistema ottico. In genere, il campione deve essere preparato come se fosse essere visualizzato tramite la microscopia in campo chiaro tradizionale. Ci sono diversi sistemi di imaging iperspettrale disponibili in commercio 11.

<table><tbody><tr><td>CytoViva 150 Unit (condensatore)</td><td>CytoViva (Auburn, AL)</td><td></td><td>montato sul microscopio Olympus BX43</td></tr><tr><td>Microscopio Olympus BX43 - Slot per analizzatore - HSI con obiettivi in aria 10x e 40x e obiettivo a immersione in olio 100X</td><td>ottenuto tramite CytoViva (Auburn, AL)</td><td></td> <td>per l'uso con il condensatore CytoViva 150</td></tr><tr><td>Dagexcel-M Digital Firewire Camera - Raffreddata; include il software</td> <td>Exponent 7ottenuto tramite la fotocamera per campo scuro potenziata CytoViva (Auburn, AL)</td><td></td> <td>e il software</td></tr><tr><td>CytoViva Hyperspectral Imaging System 1.4; include la telecamera iperspettrale Pixelfly, il controller di stadio XY, il software di imaging iperspettrale ENVI</td> ottenuto tramite <td>la telecamera iperspettrale</td><td>CytoViva (Auburn, AL)</td><td></td> e</tr><tr><td>il software per microscopio in vetro pulito in camera bianca (vetrini B)</td><td>Schott NEXTERION</td><td>1025087</td><td>Detriti e artefatti ridotti rispetto ai vetrini per microscopio in vetro convenzionali per un imaging ottimale</td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti per microscopio puliti in camera bianca (#1,0; 22 mm x 22 mm x&nbsp; 1,45 mm)</td><td>Schott NEXTERION</td><td>ha ridotto su misura</td><td>detriti e artefatti rispetto ai vetrini coprioggetti convenzionali per un imaging ottimale</td></tr><tr><td>Olio da immersione per microscopia di tipo A</td><td>Fisher Scientific</td><td>12368B</td><td>fornitori multipli</td></tr><tr><td>70% di isopropanolo in acqua</td><td></td><td></td><td>fornitori multipli</td></tr><tr><td>Software ImageJ National</td><td>Institutes of Health (NIH)</td><td></td> <td>software open source gratuito download online</td></tr><tr><td>nanoparticelle di ossido di metallo</td><td>fornite al team di ricerca da partner</td><td></td> industriali <td>nanoparticelle di allumina, silice e ceria in sospensioni acquose. A causa di un accordo di non divulgazione tra gli autori e i partner industriali, non è possibile divulgare ulteriori informazioni sul prodotto.</td></tr></tbody></table>

identificazione di ossido di metallo nanoparticelle in campioni istologici da avanzato mapping darkfield microscopy e iperspettrale

Identification of Metal Oxide Nanoparticles in Histological Samples by Enhanced Darkfield Microscopy and Hyperspectral Mapping

I nanomateriali sono sempre più diffusi nell'industria, nella produzione e nella ricerca biomedica. La necessità di strumenti e tecniche che aiutino l'identificazione, la localizzazione e la caratterizzazione di materiali su scala nanometrica in campioni biologici è in aumento. I metodi attualmente disponibili, come la microscopia elettronica, tendono ad essere ad alta intensità di risorse, rendendo il loro uso proibitivo per gran parte della comunità di ricerca. La microscopia in campo scuro potenziata, integrata con un sistema di imaging iperspettrale, può fornire una soluzione a questo collo di bottiglia, consentendo una caratterizzazione rapida e meno costosa delle nanoparticelle nei campioni istologici. Questo metodo consente l'imaging su scala nanometrica ad alto contrasto e l'identificazione dei nanomateriali. Per questa tecnica, i campioni di tessuto istologico vengono preparati come per la microscopia basata sulla luce. In primo luogo, i campioni di controllo positivi vengono analizzati per generare gli spettri di riferimento che consentiranno il rilevamento di un materiale di interesse nel campione. Vengono analizzati anche i controlli negativi privi del materiale di interesse al fine di migliorare la specificità (ridurre i falsi positivi). I campioni possono quindi essere riprodotti e analizzati utilizzando metodi e software per la microscopia iperspettrale o confrontati con questi spettri di riferimento al fine di fornire mappe della posizione dei materiali di interesse in un campione. La tecnica è particolarmente adatta per materiali con spettri di riflettanza molto unici, come i metalli nobili, ma è applicabile anche ad altri materiali, come gli ossidi semimetallici. Questa tecnica fornisce informazioni che sono difficili da acquisire da campioni istologici senza l'uso di tecniche di microscopia elettronica, che possono fornire una maggiore sensibilità e risoluzione, ma sono molto più dispendiose in termini di risorse e tempo rispetto alla microscopia ottica.

Microscopia Hyperspectral è utile per la sua capacità di identificare i materiali in un modo simile a spettrofotometria. Come indicato nella Figura 1, ogni materiale ha diversi spettri caratteristici ed una forma complessiva della sua riflettanza, che è unica. Inoltre, la Figura 1 illustra la natura della matrice-dipendente dei profili spettrali: i profili spettrali per ciascuna delle tre ossidi metallici in campioni istologici (pannello superiore) sono diversi dai profili spettrali per ciascuna delle tre ossidi metallici in sospensione acquosa ( pannello inferiore). Mappando i profili spettrali caratteristici per campioni sconosciuti nella stessa matrice, la tecnica è utile per determinare la presenza o l&#39;assenza di un materiale, e può anche confrontare semi-quantitativamente quantità relative di materiale in campioni. Le librerie di riferimento spettrali creati da campioni di pelle di controllo positivo sono appropriati per la mappatura a sperimentalecampioni di pelle. Come si vede nella figura 2, le biblioteche di spettri di riferimento map bene ai corrispondenti controlli positivi e non mappano i corrispondenti controlli negativi. Il vantaggio più significativo della tecnica è la sua capacità di rilevare bassi livelli di materiali di interesse in campioni, nonché per distinguerli dai contaminanti. . Per esempio, i singoli nanotubi possono essere osservati nei polmoni durante l&#39;inalazione di dosi di 40 mg in un 20-30 g rat 25. Figura 3 dimostra in campioni istologici di pelle: mentre alcune particelle sono prontamente evidenti nell&#39;immagine ottica darkfield (colonna 2), altri vengono rilevati utilizzando l&#39;imaging iperspettrale (colonna 3) che potrebbe essere stato perso con il microscopio a campo chiaro (colonna 1) o altri metodi. L&#39;uso di campo oscuro HSI serve anche a migliorare la specificità sopra semplice microscopio campo chiaro. Queste immagini possono poi essere oggetto di forme più quantitative di analisi, nl&#39;analisi delle particelle otably via ImageJ. Microscopia a campo scuro migliorata ha diverse applicazioni, anche in assenza di immagini iperspettrale. Il primo è la sua capacità di generare di alta qualità, immagini ad alto contrasto. Ciò è dimostrato dal figura 3, in cui le particelle di interesse sono facilmente identificabili rispetto alle loro controparti brightfield. Queste immagini possono anche essere oggetto di analisi quantitativa delle particelle, ma in assenza di mappatura iperspettrale, cautela è necessaria per evitare di confondere una particella contaminante da una particella di interesse. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53317/53317fig1.jpg" /> Librerie Figura 1. Riferimento spettrali (matrice di tessuto) rispetto alle biblioteche spettrali (nanoparticelle in sospensione). Questo dato dimostra l&#39;importanza di generare una biblioteca di riferimento spettrale da nanomaterials di interesse nella stessa matrice come campioni sperimentali. La prima riga mostra la libreria spettrale di riferimento (RSL) per ogni materiale in questo studio (allumina, silice e ossido di cerio). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53317/53317fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Questo RSL è stato creato con il metodo descritto in questo protocollo, dove i campioni di tessuto di controllo positivo sono stati filtrati contro campioni di tessuto di controllo negativo. La seconda riga mostra librerie spettrali (SL) creati dalle nanoparticelle di interesse in sospensione liquida su un vetrino. Per allumina, un picco bimodale a lunghezze d&#39;onda di 500 e 650 è stato trovato nel RSL, mentre un picco più curva e meno distintivo è stato visto in allumina NP sospensione SL a circa 600. Per silice, un picco a una lunghezza d&#39;onda di circa 650 era presente nel RSL, mentre un picco più curva e meno distintivo è stato visto nella sospensione di silice NP SL a around 600. Per Ceria, un picco bimodale è stato trovato a lunghezze d&#39;onda di 520 e 620 nel RSL, mentre un picco di meno distintivo è stato visto nel Ceria NP sospensione SL a circa 560. Ciò suggerisce che la matrice in cui le nanoparticelle sono incorporati crea un cambiamento negli spettri che può essere considerevole quando si selezionano i comandi per creare la SL per esperimento come specifica. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53317/53317fig2.jpg" /> Figura 2. Riferimento librerie spettrali (matrice di tessuto) mappati sul controllo positivo e il controllo negativo tessuto cutaneo suina. Questa cifra serve come conferma dei RSL in modo appropriato per la mappatura di campioni sperimentali, dal fatto che ogni RSL (colonna di sinistra) mappa bene al suo corrispondente controllo positivo (colonna centrale), e non la mappa della sua corrispondente controllo negativo (colonna di destra). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53317/53317fig2large.jpg" target="_blank">Si prega di clicca h</a>ere per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53317/53317fig3.jpg" /> Figura 3. iperspettrale mappatura sperimentale tessuto cutaneo suina esposta alle nanoparticelle di ossido di metallo. Le righe da cima a fondo corrispondono a diversi strati della pelle, da superficiale a strato più profondo: epidermide, derma e tessuto sottocutaneo, rispettivamente. La prima riga mostra lo strato corneo dell&#39;epidermide da un campione di pelle che è stato esposto a NP allumina in sospensione; la seconda fila è stato esposto alla silice NP in sospensione; e la terza fila di Ceria NP in sospensione. Ciascuna colonna rappresenta la stessa zona della pelle ripreso con tecniche diverse. La prima colonna corrisponde alla microscopia in campo chiaro (40X mag .; scala bar = 50 micron), dove è stato amplificato l&#39;area racchiusa in un quadrato rosso (100X mag; barra della scala = 10 micron) con una maggiore microscopia in campo oscuro (FESM) nella seconda colonna, dove frecce bianche sono indicando l&#39;alto contrasto NP. La terza colonna è stato ottenuto con una fotocamera iperspettrale (HSI), che mostra gli stessi NP ad alto contrasto (frecce bianche). Immagini EDFM e HSI sono state prese a ingrandimento 100X; barra della scala = 10 micron. La quarta colonna mostra l&#39;immagine HSI mappata contro il rispettivo RSL per ciascun gruppo di esposizione, dove NP allumina sono mostrati in verde, le NP di silice in rosso, e ceria NP in giallo, rispettivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53317/53317fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

La microscopia in campo scuro avanzata e l'imaging iperspettrale con mappatura spettrale consentono lo screening, la localizzazione e l'identificazione di materiali su scala nanometrica in campioni istologici con velocità e precisione migliorate rispetto ai metodi tradizionali. L'obiettivo di questo articolo è quello di fornire metodi per l'imaging in campo scuro e la mappatura iperspettrale di nanoparticelle di ossidi metallici in campioni istologici.

Identificazione di ossido di metallo nanoparticelle in campioni istologici da avanzato Mapping Darkfield Microscopy e iperspettrale

Nanomaterials are increasingly prevalent throughout industry, manufacturing, and biomedical research. The need for tools and techniques that aid in the ...

L'obiettivo generale di questa procedura è identificare nanoparticelle di ossido metallico in campioni istologici mediante microscopia in campo oscuro e mappatura iperspettrale. Questo viene realizzato innanzitutto identificando una regione di interesse in un campione di controllo positivo contenente nanoparticelle e acquisendo un'immagine in campo oscuro. Il secondo passaggio consiste nel creare un'immagine iperspettrale o un cubo di dati della regione di interesse utilizzando la fotocamera iperspettrale.Successivamente, viene creata una libreria spettrale di riferimento dal cubo di dati del controllo positivo, che viene filtrato rispetto a un controllo negativo per rimuovere eventuali falsi positivi. L'ultimo passaggio consiste nell'utilizzare la libreria spettrale di riferimento per effettuare il confronto con campioni sperimentali, al fine di identificare e localizzare nanoparticelle della stessa composizione. In definitiva, la microscopia in campo oscuro migliorata e il mapping iperspettrale vengono utilizzati per identificare nanoparticelle di ossidi metallici in campioni istologici in modo più rapido e con minori richieste di risorse rispetto ad altre tecniche, come la microscopia elettronica.Questo metodo offre diversi vantaggi rispetto alle tecniche convenzionali di imaging e caratterizzazione dei nanomateriali, come la microscopia elettronica. La preparazione del campione è tipicamente minima e non distruttiva. L'acquisizione e l'analisi delle immagini richiedono meno tempo e costi, e possono essere applicate all'imaging delle nanoparticelle in una varietà di matrici.Le persone conoscevano il metodo, ma a volte incontravano difficoltà poiché la creazione di campioni di controllo positivo adeguati e di librerie spettrali di riferimento è al contempo impegnativa e dispendiosa in termini di tempo. Tuttavia, una volta completati questi passaggi iniziali, i campioni sperimentali possono essere valutati abbastanza rapidamente. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla penetrazione cutanea delle nanoparticelle, può essere applicato anche ad altri campioni biologici come lavaggi broncoalveolari e strisci di sangue, nonché a campioni non biologici, come filtri utilizzati nelle valutazioni dell'esposizione occupazionale.Dimostrerò questa tecnica insieme a Plar Sosa, uno studente di medicina del mio laboratorio. Iniziare collegando e accendendo la sorgente luminosa, il controllore dello stage, la telecamera ottica, la telecamera iperspettrale e il sistema informatico. Quindi sollevare lo stage e il condensatore in posizione operativa e applicare con attenzione da tre a cinque gocce di olio di immersione di tipo A sulla lente del condensatore. Se si formano bolle, rimuovere l'olio e riapplicarlo sulla lente.Successivamente, posizionare il campione sulla piastra e sollevare lentamente il condensatore finché l'olio di immersione non entra in contatto con la parte inferiore del vetrino. Questo sarà evidente attraverso l'anello di illuminazione che si intensifica rapidamente nel punto in cui l'olio tocca il vetrino. Con il condensatore in posizione, passare all'obiettivo 10 x, quindi mettere a fuoco e allineare il condensatore per massimizzare la luminosità; se necessario, regolare le manopole di allineamento del condensatore per centrare il punto luminoso.Aprire il software di imaging ottico. Mettere a fuoco il campione utilizzando la manopola di messa a fuoco fine dell'obiettivo. Quindi individuare una regione di interesse.Regolare messa a fuoco del condensatore secondo necessità per equilibrare l'illuminazione. Fare clic sulla scheda delle impostazioni nella barra del menu e quindi sul pulsante di acquisizione dell'immagine. Per l'evento di acquisizione.Selezionare il formato dell'immagine desiderato e assegnare un nome file all'immagine. Inoltre, selezionare il valore predefinito di time lapse e infine fare clic su OK. Successivamente, andare al menu dell'esposizione e selezionare le impostazioni di esposizione che producono l'immagine con il contrasto più elevato.Qui, il livello è impostato allo 0,0%. Il guadagno è impostato a 2,8 decibel e la velocità dell'otturatore a 56 millisecondi. Acquisire l'immagine cliccando sul pulsante dell'immagine nella barra del menu. Cambiare l'obiettivo a 40x e 100x.Acquisendo immagini a ingrandimenti più elevati, assicurarsi che la guida luminosa sia indirizzata alla telecamera iperspettrale, quindi aprire il software di acquisizione iperspettrale per l'acquisizione dei cubi di dati HSI nel software: aprire il microscopio iperspettrale nella barra del menu e selezionare i controlli del microscopio HSI. Impostare qui l'ingrandimento dell'obiettivo e il percorso di sicurezza. Successivamente, modificare l'area di acquisizione nelle impostazioni e cambiare il numero di linee.In questo studio abbiamo utilizzato 720 per impostare il tempo di esposizione. Qui abbiamo utilizzato 0,25 secondi. Lasciare tutto il resto ai valori predefiniti e fare clic su anteprima HSI per visualizzare l'immagine.Osservare il grafico di intensità risultante che rappresenta l'intensità della lunghezza d'onda più elevata mentre l'utente si sposta lungo l'asse x al centro del campo visivo della telecamera. Spostare il cursore per generare un contorno accurato del grafico. Ciò farà apparire un indicatore numerico di intensità sulla sinistra.Concentrare l'immagine in base a questa anteprima regolando la messa a fuoco fine dell'obiettivo per definire meglio i picchi nell'immagine. Successivamente, ottimizzare l'intensità della luce regolando la luminosità della sorgente o la messa a fuoco del condensatore, oppure annullare l'anteprima e regolare il tempo di esposizione nel software. Fare clic su acquisisci e osservare l'apertura di quattro nuove finestre con i nomi disponibili.Elenco delle bande. Zoom numero uno. Appaiono la barra di scorrimento numero uno e la banda RGB numero uno.Massimizza la finestra del canale RGB principale poiché questo è il cubo di dati, che verrà utilizzato per tutti i riferimenti futuri. Salvare questo cubo di dati come file TIFF e fare clic su OK. Fare clic con il tasto destro sulla finestra dell'immagine del cubo di dati e quindi fare clic con il tasto sinistro su Profilo Z spettrale.Quando appare a sinistra la finestra pop-up del profilo spettrale, fare clic sui pixel di interesse sulla struttura tridimensionale dei dati. I più luminosi sono quelli che possono essere identificati con certezza come rappresentativi del materiale di interesse. Nel menu di analisi delle particelle, selezionare lo strumento filtro particelle per identificare le particelle presenti nella struttura tridimensionale dei dati.Nella nuova finestra popup impostata, il valore massimo spettrale deve superare il valore del fondo, in modo da essere più alto dei pixel di fondo, ma più basso rispetto ai materiali di interesse. Il valore massimo valido è 16.000. Nella finestra dello strumento di revisione del filtro particolato, fare clic su seleziona tutto.Quindi fare clic su esporta nella libreria spettrale e assegnare un nome alla propria libreria spettrale. Dopo aver selezionato un campione da utilizzare come controllo negativo, acquisire diversi cubi di dati dal campione. Utilizzando la camera iperspettrale, è richiesto almeno un cubo, ma è possibile acquisirne di più.Per aumentare la selettività con il cubo dati di controllo negativo aperto, fare clic su "filter spectral library" nel menu "analysis" situato sulla barra degli strumenti principale del programma, quindi fare clic su "open new file" e selezionare la libreria spettrale creata in precedenza per il controllo positivo come file di input; fare clic su "okay". Nella finestra "filter cyto viva spectral library", fare clic su "image" e scegliere il nome del file di output per la libreria spettrale di riferimento, quindi fare clic su "okay".Successivamente, fare clic sul nome del file del cubo di dati del controllo negativo come immagine sorgente. Il software analizzerà la libreria spettrale e rimuoverà ogni spettro che corrisponde a uno spettro del cubo di dati del controllo negativo. Ottenere i cubi di dati dai campioni sperimentali con il cubo di dati sperimentale aperto.Fare clic sul menu spettrale nella sottosezione metodi di mappatura. Aprire il classificatore ad angolo spettrale. Selezionare il nome del cubo di dati sperimentali nella finestra a comparsa e fare clic su OK. Se non sono elencati nomi di file, fare clic su apri nuovo file e scegliere il cubo di dati sperimentali.Quindi fare clic su OK nella finestra pop-up denominata End Member collection, SAM, e fare clic su Importa nella barra del menu. Selezionare quindi dal file della libreria spettrale. Aprire la libreria spettrale di riferimento creata in precedenza e fare clic su OK.Nella nuova finestra popup denominata Input Spectral Library, fare clic su seleziona tutti gli elementi, quindi fare clic su okay. Successivamente, fare clic con il tasto destro su colore e selezionare. Applicare i colori predefiniti a tutti gli elementi selezionando prima seleziona tutti e poi applica; quindi scegliere il nome del file di output e fare clic su okay.Aprire il menu di sovrapposizione nella finestra del cubo dati e selezionare classificazione. Quindi passare al nome del file di output e fare clic su OK. Nel menu della finestra dello strumento di classificazione interattiva, aprire il menu delle opzioni e selezionare unisci le classi per creare uno schema cromatico unificato.Per semplificare l'analisi dei dati mediante altri software, selezionare uno spettro singolo dall'elenco della classe base. Quindi selezionare tutte le classi tranne quelle non classificate per unirle alla classe base. Successivamente, fare clic su OK.Successivamente, fare clic sul colore di base selezionato e tutti gli spettri corrispondenti verranno visualizzati in quel colore. Per ottenere un'immagine a colori che mostri gli spettri corrispondenti su uno sfondo nero, fare clic sulla casella dei colori non classificati, che è nera per impostazione predefinita. Il vantaggio più significativo della tecnica è la sua capacità di identificare nanoparticelle di ossido metallico in campioni istologici mediante microscopia in campo oscuro e mappatura iperspettrale. Queste immagini illustrano tale processo utilizzando campioni istologici di pelle.Sebbene alcune particelle siano chiaramente visibili nell'immagine in campo scuro, ulteriori particelle vengono rilevate mediante imaging iperspettrale. Qui è mostrato un tessuto cutaneo suino nello strato dell'epidermide, esposto a nanoparticelle Illumina. È stato trovato un aggregato di nanoparticelle con alto contrasto depositato sullo strato corneo nel derma, esposto a nanoparticelle di silice.Si possono osservare numerosi nanoparticelle ad alto contrasto depositate nel tessuto connettivo. Infine, nel tessuto sottocutaneo, esposto alle nanoparticelle di Syria, si possono vedere numerose nanoparticelle ad alto contrasto disperse depositate lungo gli adipociti, con identificazione delle nanoparticelle mediante questo metodo.In altri campioni di tessuto come polmone, fegato, milza, reni e linfonodi è possibile. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire un'analisi delle immagini per rispondere a ulteriori domande, come il conteggio delle particelle e la loro localizzazione. Determinate considerazioni e limitazioni, come la necessità di controlli altamente specializzati e i limiti nella risoluzione dell'imaging fotonico, devono essere valutate in confronto a quelle dei metodi convenzionali.Quando si selezionano le tecniche analitiche più appropriate per indagare specifiche domande di ricerca, abbiamo scelto di dimostrare questa particolare applicazione perché ha il potenziale di integrare le attuali e future ricerche in nanotossicologia. Può inoltre fornire informazioni utili per la ricerca relativa all'assorbimento, alla distribuzione, al metabolismo e all'escrezione delle nanoparticelle negli organi e nei tessuti.

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Identificazione di ossido di metallo nanoparticelle in campioni istologici da avanzato Mapping Darkfield Microscopy e iperspettrale (Video) | JoVE Journal

Identificazione di ossido di metallo nanoparticelle in campioni istologici da avanzato Mapping Darkfield Microscopy e iperspettrale

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