Identificazione di ossido di metallo nanoparticelle in campioni istologici da avanzato Mapping Darkfield Microscopy e iperspettrale

L'obiettivo generale di questa procedura è identificare le nanoparticelle di ossidi metallici in campioni istologici mediante microscopia a campo scuro e mappatura iperspettrale. Ciò si ottiene identificando prima una regione di interesse in un campione di controllo positivo contenente nanoparticelle e catturando un'immagine in campo scuro. Il secondo passo consiste nel creare un'immagine iperspettrale o un cubo di dati della regione di interesse utilizzando la fotocamera iperspettrale.

Successivamente, viene creata una libreria spettrale di riferimento dal cubo di dati di controllo positivo, che viene filtrata rispetto a un controllo negativo per rimuovere eventuali falsi positivi. Il passo finale consiste nell'utilizzare la libreria spettrale di riferimento per mappare i campioni sperimentali per identificare e localizzare le nanoparticelle della stessa composizione. In definitiva, la microscopia in campo oscuro potenziata e la mappatura iperspettrale vengono utilizzate per identificare le nanoparticelle di ossidi metallici nei campioni istologici in modo più rapido e meno dispendioso in termini di risorse rispetto ad altre tecniche come la microscopia elettronica.

Questo metodo offre diversi vantaggi rispetto alle tecniche convenzionali di imaging e caratterizzazione dei nanomateriali, come la microscopia elettronica. In questo caso, la preparazione del campione è in genere minima e non distruttiva. L'acquisizione e l'analisi delle immagini richiedono meno tempo e costi e possono essere applicate per l'imaging di nanoparticelle in una varietà di matrici.

Le persone sapevano che il metodolo a volte faticava perché la creazione di campioni di controllo positivi appropriati e librerie spettrali di riferimento è impegnativa e richiede tempo. Ma una volta completate queste fasi iniziali, i campioni sperimentali possono essere valutati abbastanza rapidamente. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla penetrazione cutanea delle nanoparticelle, può essere applicato anche ad altri campioni biologici come il lavaggio broncoalveolare e gli strisci di sangue, nonché a campioni non biologici, come i filtri utilizzati nelle valutazioni dell'esposizione professionale.

A dimostrare questa tecnica sarà Plar Sosa, uno studente di medicina del mio laboratorio Begin collegando e accendendo la sorgente luminosa, il controller di scena, la telecamera ottica, la telecamera iperspettrale e il sistema informatico. Quindi sollevare il tavolino e il condensatore in posizione operativa e applicare con cautela da tre a cinque gocce di olio da immersione di tipo A sulla lente del condensatore. Se si formano delle bolle, rimuovere l'olio e riapplicarlo sulla lente.

Quindi, posizionare il campione sul tavolino e sollevare lentamente il condensatore fino a quando l'olio da immersione non entra in contatto con la parte inferiore del vetrino. Ciò sarà evidente attraverso l'anello di illuminazione che si illumina rapidamente nel punto in cui l'olio entra in contatto con il vetrino. Con il condensatore in posizione, passare all'obiettivo 10 x e quindi mettere a fuoco e allineare il condensatore per massimizzare la luminosità, se necessario, regolare le manopole di allineamento del condensatore per centrare il punto luminoso.

Aprire il software di imaging ottico. Mettere a fuoco il campione utilizzando la manopola di messa a fuoco dell'obiettivo. Quindi trova una regione di interesse.

Regolare la messa a fuoco del condensatore secondo necessità per bilanciare l'illuminazione. Fare clic sulla scheda delle impostazioni nella barra dei menu e fare clic sul pulsante di acquisizione dell'immagine. Per l'evento di acquisizione.

Selezionare il formato immagine desiderato e assegnare un nome file all'immagine. Inoltre, seleziona il valore time lapse predefinito e infine fai clic su OK. Quindi, vai al menu dell'esposizione e seleziona le impostazioni di esposizione che creano l'immagine con il contrasto più elevato.

Qui, il livello è impostato su 0,0%Il guadagno è impostato su 2,8 decibel e la velocità dell'otturatore è impostata su 56 millisecondi secondi. Cattura l'immagine facendo clic sul pulsante dell'immagine nella barra dei menu. Cambia l'obiettivo a 40 x e 100 x.

Acquisizione di immagini a ingrandimenti più elevati, assicurarsi che la guida di luce sia diretta verso la fotocamera iperspettrale, quindi aprire il software di imaging iperspettrale per l'acquisizione dei cubi di dati HSI nel software, aprire il microscopio iperspettrale nella barra dei menu e selezionare i controlli del microscopio HSI. Qui impostare l'ingrandimento dell'obiettivo e il percorso sicuro. Quindi, modifica l'acquisizione dell'area nelle impostazioni e modifica il numero di linee.

In questo studio abbiamo utilizzato 720 per impostare il tempo di esposizione. Qui abbiamo usato 0,25 secondi. Lascia tutto il resto ai valori predefiniti e fai clic su anteprima HSI per visualizzare l'immagine.

Osservare il grafico dell'intensità risultante che rappresenta l'intensità della lunghezza d'onda più alta mentre l'utente si sposta lungo l'asse x del centro del campo della telecamera. Spostare il cursore per generare un contorno accurato del grafico. Ciò farà apparire un indicatore numerico di intensità sulla sinistra.

Mettere a fuoco l'immagine in base a questa anteprima regolando la messa a fuoco fine dell'obiettivo per rendere più nitidi i picchi in questa immagine. Quindi, ottimizza l'intensità della luce regolando la luminosità della sorgente, la messa a fuoco del condensatore o annulla l'anteprima e regola il tempo di esposizione nel software. Fare clic su Acquisisci e osservare come quattro nuove finestre con i nomi disponibili.

Elenco delle band. Zoom numero uno. Appare la banda RGB numero uno, scroll e numero uno.

Ingrandisci la finestra della banda RGB numero uno poiché questo è il cubo di dati, che verrà utilizzato per tutti i riferimenti futuri. A destra? Fare clic su questo cubo di dati, salvarlo come file tiff e fare clic su OK. Fare clic con il pulsante destro del mouse nella finestra dell'immagine del cubo di dati e fare clic con il pulsante sinistro del mouse sullo spettro del profilo Z.

Quando la finestra pop-up del profilo spettrale viene visualizzata a sinistra, fare clic sui pixel di interesse sulla destinazione del cubo di dati. I più brillanti sono quelli che possono essere identificati con sicurezza come rappresentanti il materiale di interesse. Nel menu di analisi delle particelle, selezionare lo strumento filtro particelle per identificare le particelle presenti nel cubo di dati.

Nella nuova finestra popup impostata, il massimo spettrale deve superare il valore, quindi è superiore ai pixel di sfondo, ma inferiore ai materiali di interesse. Il numero massimo di dati validi è 16.000. Nella finestra dello strumento di revisione del filtro antiparticello, fare clic su seleziona tutto.

Quindi fare clic su Esporta nella libreria spettrale e assegnare il nome alla libreria spettrale. Dopo aver selezionato un campione da utilizzare come controllo negativo, ottenere diversi cubi di dati dal campione. Utilizzando la fotocamera iperspettrale, è necessario almeno uno, ma è possibile catturarne di più.

Per aumentare la selettività con il cubo di dati di controllo negativo aperto, fare clic su filtra libreria spettrale Nel menu di analisi situato nella barra degli strumenti principale del programma, fare clic su Apri nuovo file e selezionare la libreria spettrale creata in precedenza per il controllo positivo come file di input, fare clic su OK. Nella finestra della libreria spettrale del filtro cyto viva. Fare clic sull'immagine e scegliere il nome del file di output per la libreria spettrale di riferimento, quindi fare clic su OK.

Quindi, fai clic sul nome del file del tuo cubo di dati di controllo negativo come immagine di origine. Il software analizzerà la libreria spettrale e rimuoverà ogni spettro che corrisponde a qualsiasi spettro del cubo di dati di controllo negativo. Ottenere cubi di dati dai campioni sperimentali con il cubo di dati sperimentale aperto.

Fare clic sul menu spettrale nel sottomenu dei metodi di mappatura Aprire il mappatore dell'angolo spettrale. Selezionare il nome del cubo di dati sperimentale nella finestra popup e fare clic su OK. Se non è elencato alcun nome di file, fare clic su Apri nuovo file e scegliere il cubo di dati sperimentale.

Quindi fare clic su OK nella finestra pop-up denominata Raccolta membri finali, SAM, fare clic su Importa nella barra dei menu. Quindi seleziona dal file della libreria spettrale. Aprire la libreria spettrale di riferimento creata in precedenza e fare clic su OK.

Nella nuova finestra popup denominata Input Spectral Library, fare clic su seleziona tutti gli elementi, quindi fare clic su OK. Quindi fare clic con il pulsante destro del mouse sul colore e selezionare. Applica i colori predefiniti a tutti, fai clic su Seleziona tutto seguito da Applica, quindi scegli il nome del file di output e fai clic su OK.

Aprire il menu di sovrapposizione nella finestra del cubo di dati e selezionare la classificazione. Quindi vai al nome del file di output e fai clic su OK. Nel menu interattivo della finestra degli strumenti di classe, apri il menu delle opzioni e seleziona le classi di unione per creare una combinazione di colori unificata.

Per facilitare l'analisi dei dati utilizzando altri software, selezionare un singolo spettro dall'elenco della classe base. Quindi seleziona tutte le classi tranne non classificate per unirle alla base. Quindi fare clic su OK.

Quindi, fai clic sul colore di base selezionato e tutti gli spettri corrispondenti verranno mostrati in quel colore. Per ottenere un'immagine amatica che mostrerà gli spettri corrispondenti su uno sfondo nero, fare clic sulla casella dei colori non classificati, che è nera Per impostazione predefinita, il vantaggio più significativo della tecnica è la sua capacità di identificare le nanoparticelle di ossido di metallo nei campioni istologici mediante microscopia a campo scuro e mappatura iperspettrale. Queste immagini dimostrano questo processo utilizzando campioni istologici di pelle.

Mentre alcune particelle sono facilmente evidenti nel campo oscuro, l'immagine ottica, altre particelle vengono rilevate utilizzando l'imaging iperspettrale. Qui è mostrato il tessuto cutaneo suino nello strato dell'epidermide, che è stato esposto alle nanoparticelle Illumina. Un cluster di nanoparticelle ad alto contrasto è stato trovato depositato sopra la cornea dello strato nello strato dermico, che è stato esposto a nanoparticelle di silice.

Si possono vedere più nanoparticelle ad alto contrasto depositate sul tessuto connettivo. Infine, nel tessuto sottocutaneo, che è stato esposto alle nanoparticelle della Siria. Più nanoparticelle disperse ad alto contrasto possono essere viste depositate lungo l'identificazione delle nanoparticelle degli adipociti utilizzando questo metodo.

In altri campioni di tessuto come polmone, fegato, milza, reni e linfonodi è possibile. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire l'analisi delle immagini per rispondere a ulteriori domande come il conteggio e la posizione delle particelle. Alcune considerazioni e svantaggi, come la necessità di controlli altamente specializzati e le limitazioni sulla risoluzione dell'imaging fotonico, devono essere soppesate con quelle dei metodi convenzionali.

Nella selezione delle tecniche analitiche più appropriate per indagare su specifiche domande di ricerca, abbiamo scelto di dimostrare questa particolare applicazione perché ha il potenziale per integrare la ricerca nanotossicologica attuale e futura. Può anche informare la ricerca sull'assorbimento, la distribuzione, il metabolismo e l'escrezione delle nanoparticelle in organi e tessuti.