Name: La convalida di un modello di topo per Disrupt LINC Complessi in modo specifico-Cell (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Scopri un modello di topo transgenico per lo studio dei complessi LINC nel posizionamento nucleare. Questo metodo permette l'espressione inducibile mirata nelle cellule di Purkinje cerebellari.

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Gli autori ringraziano il personale del nucleo Morfologia e Imaging, del nucleo Genetica Molecolare (Dipartimento di Oftalmologia e Scienze Visive) e del mouse Genetica Nucleo presso la Washington University di St. Louis School of Medicine. Gli autori sono supportati dal piccolo programma di sovvenzioni dal Centro McDonnell per Cellulare e Neurobiologia Molecolare, il Centro Speranza per disordini neurologici, il National Eye Institute (# R01EY022632 a DH), un Istituto Nazionale di Eye Centro Nucleo Grant (# P30EY002687) e un sovvenzione illimitata di ricerca per prevenire la cecità al Dipartimento di Oftalmologia e Scienze Visive.

Etica Dichiarazione: procedure che coinvolgono soggetti animali sono stati approvati dalla cura e l&#39;uso Comitato istituzionale animali (IACUC) presso la Washington University di St. Louis. 1. Allevamento Mouse e genotipizzazione <ol><li> Breed Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) topi con Tg (PCP2-Cre) per produrre topi Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) 19,20. Nota: Mentre il resto di questo protocollo concentra sull&#39;uso della linea Tg (PCP2-Cre) topo per restringere espressione EGFP-KASH2 alle cellule di Purkinje nel cervelletto, una procedura simile può essere seguita con qualsiasi altra Tg (Cre) mouse ( Figura 2A). </li><li> Eseguire genotipizzazione per individuare i cuccioli che ospitano sia transgeni EGFP e Cre come descritto in precedenza 19. </li></ol> 2. Preparazione dei Materiali per la dissezione e tessuto Collection <ol><li> Preparare 100 ml di 30% di saccarosio in PBS (30 g di saccarosio / 100 ml di PBS 1x) e conservare a -20 ° C. Il giorno del tessuto harvesting, disgelo e carico ~ 30-35 ml di soluzione di saccarosio in una siringa da 35 ml per perfusioni transcardial. </li><li> Preparare 40 ml di 4% PFA in PBS (10 ml 16% paraformaldeide e 30 ml PBS). Carico ~ 30-35 ml di 4% PFA in una siringa da 35 ml per perfusioni transcardial. </li><li> Riempire una piastra di coltura tissutale 10 centimetri con 10 ml di PBS per la dissezione dei tessuti. </li><li> Preparare un cocktail di ketamina / xilazina costituito da 16 mg / ml di ketamina e 3 mg / ml xilazina. </li><li> Preparare una soluzione di etanolo al 70% per la dissezione. </li></ol> 3. Dissection e tessuto Collection <ol><li> Usando una siringa da 1 ml, 500 ml di iniettare il cocktail ketamina / xylazina per 25 grammi di peso corporeo ed attendere ~ 15 min. In alternativa, utilizzare un altro metodo di sedazione istituzionalmente riconosciuto che è appropriato per il sistema biologico di interesse. </li><li> Su sedazione, pizzicare delicatamente la zampa posteriore per confermare la mancanza di risposta al dolore, riporre tutte le zampe su un vassoio di polistirolo con il lato dorsale delil mouse verso il basso. </li><li> Spruzzare la addome con 70% etanolo e fare un&#39;incisione dal basso addome alla sommità della gabbia toracica per accedere al cuore. </li><li> Effettuare una piccola incisione nell&#39;atrio destro del cuore e inserire la siringa contenente la soluzione di saccarosio al 30% nel ventricolo sinistro del cuore. </li><li> Profumato la soluzione ad una velocità di ~ 2-5 ml per min. Quando è vuoto, rimuovere la siringa e ripetere con la soluzione PFA 4%. </li><li> Sblocca il mouse dal vassoio di polistirolo e decapitarlo per accedere al cervello. </li><li> Togliere la pelle intorno alla testa dell&#39;animale con pinze e forbici. Fare un buco nella parte posteriore del cranio con un ago e rimuovere con attenzione il cranio con forbici e pinze dissezione. </li><li> Una volta che il cervello è chiaramente accessibile, utilizzare pinze per rimuovere il cervelletto e metterlo in PBS. Bisect cervelletto nel piano sagittale con un bisturi e trasferire la soluzione di saccarosio al 30% per una notte a 4 ° C. Nota: Per prepararesono sezioni di paraffina, fissano il cervelletto notte a 4 ° C in PFA 4% prima di incorporamento dei tessuti e sezionamento. </li></ol> 4. Tissue Processing e sezionamento <ol><li> Preparare una sospensione di ghiaccio secco e butano 2-metil. Consentire la temperatura del bagno si stabilizzi per 5 min. </li><li> Riempire un cryomold con OCT e mettere la metà del cervelletto bipartita nello stampo. </li><li> Utilizzando un microscopio da dissezione e una coppia di pinze posizione cervelletto modo che la superficie bisecata (vicino alla linea mediana del cervelletto) è rivolto verso l&#39;alto. </li><li> Trasferire il cryomold all&#39;impasto ghiaccio secco per 5 minuti fino a quando il composto ottobre ha formato una solida matrice bianco intorno il campione di tessuto. Nota: I campioni congelati possono essere conservati a -20 ° C, se necessario. </li><li> Etichetta pretrattate diapositive poli-lisina per la raccolta sezioni di tessuto e preparare il criostato secondo le istruzioni del produttore per raccogliere 15 micron sezioni del Cerebellum. Per raccogliere sezioni contattare attentamente la sezione PTOM il lato rivestito poli-lisina della slitta. Per mantenere l&#39;orientamento della sezione, non ruotare la slitta durante questa fase. </li><li> Sezioni di tessuto Conservare a -20 ° C fino a procedere con la colorazione e l&#39;imaging. </li></ol> 5. La colorazione e imaging di Cervelletto Sezioni <ol><li> Preparare le seguenti soluzioni prima della colorazione dei tessuti: ~ 50 ml di PBS ~ 5-10 ml di PFA 4% in PBS ~ 10-20 ml di Triton X-100 0,5% siero asino, 10% in PBS </li><li> Sezioni cerebellari disgelo. È importante sottolineare che ridurre al minimo la loro esposizione a qualsiasi fonte di luce continua e intensa per evitare sbiadimento di EGFP. </li><li> Con una penna barriera idrofobica, disegnare un rettangolo intorno alle sezioni di tessuto. </li><li> Post-fissare le sezioni con 4% PFA per 5 min. Usi abbastanza liquido da coprire l&#39;intera area delimitata dalla barriera idrofoba (di solito ~ 500 microlitri). Utilizzare un aspirapolvere o pipetta, rispostare il fissativo essere particolarmente attenti a non disturbare i sezioni di tessuto. </li><li> Con una pipetta, applicare delicatamente PBS sul vetrino senza disturbare le sezioni di tessuto. Dopo 5 min utilizzare il vuoto o pipetta per rimuovere con attenzione il liquido. Ripetere la PBS sciacquare un totale di tre volte. </li><li> Usando una pipetta, applicare con cura la diluizione appropriata di anticorpi primari (3 ml calbindin e / o anticorpi Nesprin2 per 900 ml di soluzione di) nello 0,5% Triton X-100, il 10% di siero asino in PBS. Incubare per un&#39;ora a temperatura ambiente al buio. Nota: EGFP-KASH2 sarà visibile mediante microscopia a fluorescenza diretta su sezioni congelate, e non è necessario utilizzare un anticorpo anti-EGFP. Tuttavia, se sono stati preparati sezioni di paraffina, l&#39;imaging di EGFP-KASH2 richiede immunolocalizzazione con un anticorpo anti-EGFP. </li><li> Rimuovere la soluzione di anticorpi e risciacquare con PBS per tre volte. </li><li> Preparare 1: 1.000 diluizioni di anticorpi secondari Alexa-Fluor in 0,5% Triton X-100,10% di siero asino in PBS e conservare al buio. </li><li> Rimuovere delicatamente la PBS risciacquo finale e applicare la diluizione anticorpo secondario per un&#39;ora al buio. </li><li> Rimuovere la soluzione anticorpo secondario, sciacquare e lavare la sezione tre volte. Se necessario, applicare una colorazione nucleare, come DAPI (~ 300nm), durante la prima applicazione PBS. </li><li> Rimuovere completamente la soluzione di PBS da tutto il tessuto e posto ~ 5-7 ml di mezzo di montaggio sulla sezione di tessuto. Collocare un vetrino di vetro sopra la sezione di tessuto e ritirate ~ 15-30 minuti a temperatura ambiente al buio. </li><li> Utilizzare un microscopio a fluorescenza dotato i filtri appropriati per visualizzare EGFP e qualsiasi altre lunghezze d&#39;onda appropriate per gli anticorpi secondari usati nelle fasi 5.8 / 5.9. A fette cerebellare, utilizzare un obiettivo 20X per visualizzare cerchi nucleari EGFP-KASH2. </li></ol>

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<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syne-1+and+Syne-2+play+crucial+roles+in+myonuclear+anchorage+and+motor+neuron+innervation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Syne-1 and Syne-2 play crucial roles in myonuclear anchorage and motor neuron innervation.</a> Development. 134, 901-908 (2007).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nesprin+1+is+critical+for+nuclear+positioning+and+anchorage%5BTitle%5D)+AND+%22Human+molecular+genetics%22%5BJournal%5D)">Nesprin 1 is critical for nuclear positioning and anchorage.</a> Human molecular genetics. 19, 329-341 (2010).</li>
<li>Stewart-Hutchinson, P. J., Hale, C. M., Wirtz, D., Hodzic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+requirements+for+the+assembly+of+LINC+complexes+and+their+function+in+cellular+mechanical+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Structural requirements for the assembly of LINC complexes and their function in cellular mechanical stiffness.</a> Experimental cell research. 314, 1892-1905 (2008).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUN1%2F2+and+Syne%2FNesprin-1%2F2+complexes+connect+centrosome+to+the+nucleus+during+neurogenesis+and+neuronal+migration+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">SUN1/2 and Syne/Nesprin-1/2 complexes connect centrosome to the nucleus during neurogenesis and neuronal migration in mice.</a> Neuron. 64, 173-187 (2009).</li>
<li>Razafsky, D., Hodzic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+and+tissue-specific+disruption+of+LINC+complexes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Temporal and tissue-specific disruption of LINC complexes in vivo.</a> Genesis. 52, 359-365 (2014).</li>
<li>Razafsky, D., Hodzic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+variant+of+Nesprin1+giant+devoid+of+KASH+domain+underlies+the+molecular+etiology+of+autosomal+recessive+cerebellar+ataxia+type+I%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+disease%22%5BJournal%5D)">A variant of Nesprin1 giant devoid of KASH domain underlies the molecular etiology of autosomal recessive cerebellar ataxia type I.</a> Neurobiology of disease. 78, 57-67 (2015).</li>
<li>Razafsky, D., Blecher, N., Markov, A., Stewart-Hutchinson, P. J., Hodzic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LINC+complexes+mediate+the+positioning+of+cone+photoreceptor+nuclei+in+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">LINC complexes mediate the positioning of cone photoreceptor nuclei in mouse retina.</a> PloS one. 7, e47180(2012).</li>
<li>Razafsky, D. S., Ward, C. L., Kolb, T., Hodzic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+regulation+of+linkers+of+the+nucleoskeleton+to+the+cytoskeleton+during+mouse+postnatal+retinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">Developmental regulation of linkers of the nucleoskeleton to the cytoskeleton during mouse postnatal retinogenesis.</a> Nucleus. 4, 399-409 (2013).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La fase più critica per studiare con successo il ruolo di complessi LINC in vivo utilizzando la (/ EGFP-KASH2 CAG-LacZ) modello Tg è quello di individuare una linea di topi Cre adatto (s). Infatti, se Cre è attiva in altri tipi di cellule coinvolte in percorsi simili, può complicare l&#39;interpretazione dei risultati. Quindi, è importante esaminare cellule vicine, come mostrato qui negli strati cellulari e molecolari granuli del cervelletto (Figura 2B). Analogamente, per massimizzare eventuali...

L&#39;involucro nucleare (NE) separa nucleoplasma dal citoplasma. Esso è composto da una membrana nucleare interna ed esterna (INM e ONM, rispettivamente) che collegano a pori nucleari. Il lume delineato da due membrane si chiama lo spazio perinucleare (PNS). Il ONM è un&#39;estensione del reticolo endoplasmatico rugoso (ER) e l&#39;INM aderisce alla lamina nucleare, un reticolo di nucleare tipo V filamenti intermedi rappresentato da A e B lamine di tipo 1,2. Linker del nucleoscheletro e citoscheletro (LINC) sono complessi macromolecolari assemblee che attraversano l&#39;intero involucro nucleare collegare fisicamente l&#39;interno del nucleo di filamenti citoscheletrici e motori molecolari (Figura 1A). Sono costituiti da interazioni tra motivi evolutivamente conservati che caratterizzano due famiglie di proteine ​​transmembrana integranti del NE: Sun (SAD1 / Unc84) proteine ​​e Nesprins (nucleare Envelope SPectRINS). Nei mammiferi, Sun1 e Sun2 are transmembrana proteine ​​della INM la cui regione nucleoplasmic N-terminale interagisce direttamente con A e B lamine di tipo 3-5. Sull&#39;altro lato della INM, all&#39;interno del PNS, proteine ​​Sun Harbor un tratto evolutivo conservata di ~ 150 amminoacidi C-terminale chiamato dominio SUN. Domini SUN interagiscono direttamente con il evolutivo conservata KASH (Klarsicht / Anc-1, Syne omologia) dominio, la firma molecolare di Nesprins. Domini KASH consistono di un tratto di ~ 30 C-terminale amminoacidi che sporge nel PNS seguito da un dominio transmembrana 6. Almeno quattro geni distinti Nesprin (Nesprin1-4) codificano KASH contenenti proteine ​​che localizzano al NE 7. Le regioni citoplasmatici di Nesprins, il cui variare taglie da ~ 50kDa (Nesprin4) a un sorprendente 1.000 kDa (Nesprin1 gigante), contengono spectrina multiplo ripete così come i motivi specifici che consente loro interazione con componenti del citoscheletro, come l&#39;actina, plectina e motori molecolari 8- 13. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Studi di vertebrati e invertebrati hanno mostrato che / motori molecolari Lamin Sole / Nesprin / costituiscono un &quot;asse&quot; evolutivamente conservata controllare la migrazione nucleare e di ancoraggio. Diversi knock-out (KO) modelli murini di componenti complessi LINC sono stati descritti e sono stati strumentali nel fornire un quadro per capire il ruolo delle proteine ​​Sole e Nesprin a NE durante lo sviluppo dei mammiferi 9,14,15. Tuttavia, questi modelli presentano diversi svantaggi significativi, più in particolare: 1) difficoltà nell&#39;interpretare fenotipi dovuti alla cella effetti non autonomi, 2) difficoltà nel distinguere i contributi fenotipiche di Kash contenenti vs. KASH-meno Nesprin isoforme 16, 3) il la ridondanza funzionale delle proteine ​​Sole e Nesprin al NE in numerosi tipi di cellule richiede sistemi di allevamento complessi per inattivare tutte le interazioni SUN-Kash in topi 17 e 4) la letalità perinatale di topi deficienti per la KASH-dominio di entrambiNesprins1 e 2 preclude l&#39;analisi dei fenotipi adulti 18. Questo protocollo descrive un modello di topo romanzo progettata per distruggere tutte le interazioni SUN-KASH in vivo, in una cella modo autonomo e evolutivamente regolata, bypassando così molti degli inconvenienti sopra delineati. Questo / modello murino basato LOX-Cre si basa su due concetti importanti: 1) il dominio KASH di qualsiasi proteina Nesprin noto è sufficiente per indirizzare EGFP a NE in sistemi di colture cellulari e 2) i domini SUN interagire promiscuamente con i domini Kash, quindi sovraespressione di qualsiasi dominio KASH saturerà tutti i domini SUN endogeni e inattivare complessi LINC in modo negativamente dominante 17 (Figura 1B). Questo protocollo descrive la raccolta dei tessuti e fasi di lavorazione utilizzate per confermare l&#39;interruzione di tutte le interazioni SUN-Kash in cellule di Purkinje cerebellari.

<table><tbody><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Gibco</td><td>14200-075</td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldeide Soluzione</td><td>Microscopia Elettronica Scienze</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>OCT Composto</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini di adesione</td><td>StatLab</td><td>M1000W</td><td></td></tr><tr><td>Siero d'asino</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>ImmuEdge Pen</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Calbindina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C9848</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-EGFP</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo</td><td></td><td></td> anti-Nesprin2 <td>Precedentemente descritto in Ref. 21</td></tr><tr><td>Montaggio fluorescente Media</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>2-metilbutano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>O3551</td><td></td></tr></tbody></table>

la convalida di un modello di topo per disrupt linc complessi in modo specifico-cell

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

La migrazione nucleare e l'ancoraggio all'interno dei tessuti in via di sviluppo e adulti si basano fortemente su grandi assemblaggi di proteine macromolecolari chiamati LInkers of the Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC complexes). Questi scaffold proteici attraversano l'involucro nucleare e collegano l'interno del nucleo ai componenti del citoscheletro citoplasmatico circostante. I complessi LINC sono costituiti da due famiglie di proteine conservate evolutivamente, le proteine Sun e le Nesprins che ospitano motivi di firma molecolare C-terminale chiamati domini SUN e KASH, rispettivamente. Le proteine solari sono proteine transmembrana della membrana nucleare interna il cui dominio nucleoplasmatico N-terminale interagisce con la lamina nucleare mentre i loro domini C-terminali SUN sporgono nello spazio perinucleare e interagiscono con il dominio KASH delle Nesprins. Le isoforme canoniche di Nesprin hanno un N-terminale di dimensioni variabili che si proietta nel citoplasma e interagisce con i componenti del citoscheletro. Questo protocollo descrive la validazione di una strategia di topo transgenico dominante-negativo che interrompe le interazioni endogene SUN/KASH in modo specifico per tipo di cellula. Il nostro approccio si basa sul sistema Cre/Lox che bypassa molti inconvenienti come la letalità perinatale e i fenotipi cellulari non autonomi che sono associati ai modelli germinali di inattivazione del complesso LINC. Per questo motivo, questo modello fornisce uno strumento utile per comprendere il ruolo dei complessi LINC durante lo sviluppo e l'omeostasi in una vasta gamma di tessuti.

Questo protocollo illustra l&#39;utilità del (/ EGFP-KASH2 CAG-LacZ) modello di topo Tg di limitare l&#39;espressione EGFP-KASH2 alle cellule di Purkinje cerebellari utilizzando Tg (PCP2-Cre) topi. Nel Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) prole, la griglia di lettura aperta LacZ / V5 è asportato in P6 dalla ricombinasi Cre determinando così l&#39;espressione di EGFP-KASH2 specificamente mirato al Purkinje cellule (Figura 2A). Come previsto, EGFP-KASH2 è rivolto a membrana nucleare come indicato dal ...

Le proteine dell'involucro nucleare svolgono un ruolo centrale in molti processi biologici di base e sono state implicate in una varietà di malattie umane. Questo protocollo descrive un nuovo modello murino basato su Cre/Lox che consente il controllo spazio-temporale della rottura dei complessi LINC.

La convalida di un modello di topo per Disrupt LINC Complessi in modo specifico-Cell

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è illustrare l'utilità di un modello murino transgenico, che consente l'espressione inducibile e mirata di una cache EGFP fluorescente etichettata, due peptide in vivo, e la conseguente alterazione dei complessi link endogeni. In questo esperimento, l'espressione della cache due etichettata con fluorescenza sarà indirizzata alle cellule di Purkinje del cervelletto. Questo approccio genetico può rispondere a domande fondamentali sul ruolo dei complessi link nel posizionamento nucleare all'interno di diversi tessuti.L'espressione indotta e mirata di E-G-F-P-K due presenta diversi vantaggi. Primo, richiede un singolo schema di incrocio tra topi cay e qualsiasi ceppo cruise esistente. Secondo, questo approccio aggira la letalità perinatale osservata nei modelli murini di mutazioni germinali nei componenti del complesso link.Infine, questo metodo permette di studiare la fisiologia dei complessi di collegamento all'interno di cellule o tessuti specifici in vivo. Chloe Potter, un membro del laboratorio, vi mostrerà i diversi passaggi necessari per visualizzare E-G-F-P-K due nelle cellule di Purkinje cerebellari.Per iniziare, incrociare topi clac Z con topi PCP due CRE per produrre topi PCP due CAG C due come descritto in pubblicazioni precedenti. Una volta nati i cuccioli risultanti, eseguire il genotipaggio. Per identificare quelli che portano entrambi i transgeni EGFP e Cree come descritto in precedenza, preparare 50 millilitri di una soluzione al 30% di saccarosio in PBS e conservarla a meno 20 gradi Celsius fino al giorno del prelievo dei tessuti all'età appropriata. Eseguire una perfusione transcardiaca dei topi sotto anestesia al fine di preparare il tessuto cerebrale per la dissezione come descritto nel protocollo scritto, quindi posizionare il cervello dissezionato in una piastra da coltura tissutale da 10 centimetri contenente 10 millilitri di PBS e separare il cervelletto dai emisferi cerebrali.Successivamente, utilizzare un bisturi per dissezionare il cervelletto nel piano sagittale e trasferire le sezioni in una soluzione di saccarosio al 30% conservandole a quattro gradi Celsius durante la notte. Preparare una sospensione di anidride carbonica solida e metilbutano. Lasciare che la temperatura del bagno raggiunga l'equilibrio per cinque minuti.Successivamente, riempire uno stampo criogenico con composto OCT e posizionare una metà del cervelletto dissezionato nello stampo utilizzando un microscopio stereoscopico e una pinzetta. Orientare il cervelletto in modo che la superficie dissezionata, situata vicino alla linea mediana del cervelletto, sia rivolta verso l'alto nello stampo. Trasferire quindi lo stampo criogenico nella sospensione di ghiaccio secco per cinque minuti, fino a quando il composto OCT non abbia formato una matrice solida di colore bianco attorno al campione di tessuto.Conservare il campione inclusato a meno 20 gradi Celsius fino al momento dell'utilizzo. Etichettare i vetrini pretrattati con polilisina per raccogliere le sezioni di tessuto e montare il blocco di tessuto cerebellare sul portatessuti con OCT fresco. Una volta che il blocco è saldamente attaccato, montare il portatessuti e tagliare fette di 40 micrometri per rimuovere l'eccesso di OCT fino a raggiungere il tessuto.Impostare lo spessore a 15 micrometri e raccogliere le sezioni mettendo delicatamente a contatto la sezione in OCT con il lato del vetrino rivestito di polilisina. Conservare le sezioni di tessuto a meno 20 gradi Celsius fino al momento della colorazione e dell'acquisizione delle immagini. Quando si è pronti per proseguire, scongelare le sezioni cerebellari al buio per prevenire lo sbiadimento delle proteine fluorescenti.Utilizzando una penna con barriera idrofoba, disegnare un rettangolo attorno al perimetro delle sezioni di tessuto. Aggiungere circa 500 microlitri di paraformaldeide al 4% sulle sezioni per cinque minuti al fine di fissare ulteriormente il tessuto. Successivamente, utilizzare un vuoto per aspirare il fissativo, avendo particolare cura di non disturbare le sezioni di tessuto con una pipetta.Applicare delicatamente PBS sul vetrino senza disturbare le sezioni di tessuto. Dopo cinque minuti, utilizzare la pipetta con aspiratore per rimuovere con attenzione il liquido; ripetere il risciacquo con PBS per un totale di tre volte. Successivamente, aggiungere circa 500 microlitri di soluzione bloccante sui vetrini e incubare per 10 minuti.Rimuovere e quindi sostituire la soluzione di bloccaggio con la stessa soluzione contenente diluizioni da 1 a 300 degli anticorpi cal binding o nesin due. Successivamente, rimuovere la soluzione anticorpale e sciacquare i vetrini con PBS per 3 volte. Incubare i vetrini per un'ora a temperatura ambiente al buio.Successivamente, preparare una diluizione da uno a 1000 di anti-US Alexa floor 5 94 per i vetrini marcati per il legame bovino e di anti Alexa Fluor 5 94 per i vetrini marcati per Nesprin due nella soluzione di blocco e conservare le soluzioni al buio fino al momento dell'uso. Rimuovere delicatamente l'ultima centrifugazione con PBS e coprire le sezioni con gli anticorpi secondari diluiti per un'ora al buio. Al termine dell'incubazione, rimuovere la soluzione di anticorpo secondario.Quindi applicare un colorante nucleare come DPI a 300 nanomolar in PBS per cinque minuti. Successivamente, risciacquare le sezioni due volte in PBS. Rimuovere quanta più soluzione PBS possibile e coprire la sezione di tessuto con una goccia di mezzo di montaggio.Posizionare un coprioggetto in vetro sulla sezione di tessuto evitando bolle d'aria e lasciare in posa per 15-30 minuti a temperatura ambiente al buio. Successivamente, utilizzare un microscopio a fluorescenza per visualizzare la colorazione con anticorpi e le proteine fluorescenti. Per sezioni del cervelletto, utilizzare un obiettivo da 20 x o da 40 x.Per visualizzare i due involucri nucleari di E-G-F-P-C mostrati qui, E-G-F-P-C due può essere direttamente visualizzato in sezioni del cervelletto nel canale Fitzy. Inoltre, la colocalizzazione di EGFP con l'anticorpo anti-cow, che etichetta specificamente le cellule di Purkinje, conferma che l'espressione di E-G-F-P-C due è confinata alle cellule di Purkinje all'interno delle cellule di Purkinje. EGFP cache due è indirizzato all'involucro nucleare, come indicato dai modelli positivi per EGFP simili a un involucro osservati attorno al nucleo.In questo esempio, l'espressione di EGFP cache due è stata rilevata in oltre il 70% delle cellule Perkin positive al legame con la proteina da latte. EGFP cache due sposta la nesprina endogena dall'involucro nucleare attraverso la saturazione dei domini sun disponibili. Di conseguenza, NESIN due endogeno viene spostato dall'involucro nucleare delle cellule Perkin che esprimono EGFP cache due.Le cellule Perkin che non esprimono E-G-F-P-C due mantengono NESIN due endogeno all'involucro nucleare, come previsto nel controllo interno, che non esprime la ricombinasi CRE e mostra NESIN due all'involucro nucleare dell'intera popolazione di cellule bikini Una. Sono quindi disponibili blocchi di tessuto CT. E-G-F-P-K due può essere visualizzato in circa quattro ore.Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare che il grado di fissazione con PFF e/o le condizioni di inclusione possono influenzare drasticamente l'antigenicità del vostro epitopo. È quindi molto importante determinare le condizioni di fissazione ottimali che preservano il vostro epitopo specifico. Dopo aver visto questo video, dovreste avere una buona comprensione di come utilizzare il modello murino transgenico CK due per indirizzare l'espressione di VGFP cashew a tessuti specifici.

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