La convalida di un modello di topo per Disrupt LINC Complessi in modo specifico-Cell

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di illustrare l'utilità di un modello murino transgenico, consentendo l'espressione inducibile e mirata di una cache EGFP marcata in fluorescenza, due peptidi in vivo e la conseguente rottura di complessi di collegamento endogeno. In questo esperimento, l'espressione della cache marcata in fluorescenza due sarà mirata alle cellule di Perkin cerebellari. Questo approccio genetico può affrontare questioni chiave sul ruolo dei complessi di collegamento nel posizionamento nucleare all'interno della maggior parte dei tessuti.

L'espressione inducibile e mirata di E-G-F-P-K two ha diversi vantaggi. In primo luogo, richiede un unico schema di allevamento di topi isolotti con qualsiasi ceppo da crociera esistente. In secondo luogo, questo approccio bypassa la linearità perinatale osservata nei modelli murini di mutazioni germinali dei componenti del complesso di collegamento.

Infine, questo metodo permette di studiare la fisiologia dei complessi di legame all'interno di specifiche cellule o tessuti. In vivo. Chloe Potter, un membro del laboratorio, ti mostrerà i diversi passaggi necessari per visualizzare E-G-F-P-K due nelle cellule G di Burkin cerebellari.

Per iniziare, allevare topi clac Z con PCP, due topi CRE per produrre PCP, due topi CAG, C, due come descritto nelle pubblicazioni precedenti. Quando nascono i cuccioli risultanti, eseguire la genotipizzazione. Per identificare coloro che ospitano sia EGFP che Cree Transgenes come precedentemente descritto, preparare 50 millilitri di una soluzione di saccarosio al 30% in PBS e conservarla a 20 gradi Celsius negativi fino al giorno del prelievo tissutale all'età appropriata, eseguire una perfusione transcardio dei topi in anestesia al fine di preparare il tessuto cerebrale per la dissezione come descritto nel protocollo scritto, posizionare il cervello sezionato in una piastra di coltura tissutale di 10 centimetri con 10 millilitri di PBS e separare il cervelletto dal cervelletto.

Quindi, usa un bisturi per sezionare il cervelletto sul piano sagittale e trasferisci le sezioni in una soluzione di saccarosio al 30% e conservala a quattro gradi Celsius durante la notte. Preparare un impasto di ghiaccio secco e due metilbutano. Lasciare che la temperatura del bagno si equilibri per cinque minuti.

Quindi, riempi uno stampo criogenico con un composto OCT e posiziona metà del cervelletto sezionato nello stampo usando un microscopio da dissezione e un paio di pinze. Posizionare il cervelletto in modo che la superficie bi sezionata che si trova vicino alla linea mediana del cervelletto sia rivolta verso l'alto nello stampo. Quindi trasferire lo stampo criogenico nell'impasto oculare secco per cinque minuti fino a quando il composto OCT non ha formato una matrice bianca solida attorno al campione di tessuto.

Conservare il campione incorporato a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius fino al momento del bisogno. Etichettare i vetrini in polilisina pretrattata per la raccolta di sezioni di tessuto e montare il blocco di tessuti cerebellari sul supporto del tessuto con OCT fresco. Una volta che il blocco è saldamente attaccato, montare il supporto per fazzoletti e radere fette di 40 micrometri per rimuovere l'OCT in eccesso fino a raggiungere il tessuto.

Impostare lo spessore a 15 micrometri e raccogliere le sezioni toccando attentamente la sezione OCT con il lato rivestito in polilisina del vetrino. Conservare le sezioni di tessuto a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius fino a procedere con la colorazione e l'imaging. Quando sei pronto per continuare, scongela le sezioni cerebellari al buio per evitare lo sbiadimento delle proteine fluorescenti.

Usando una penna barriera idrofobica, disegna un rettangolo attorno al perimetro delle sezioni di tessuto. Aggiungere circa 500 microlitri di aldeide paraforme al 4% alle sezioni per cinque minuti per postfissare il tessuto. Aspirare il fissativo con un aspiratore con particolare attenzione a non disturbare le sezioni di tessuto con una pipetta.

Applicare delicatamente il PBS sul vetrino senza disturbare le sezioni di tessuto. Dopo cinque minuti, utilizzare la pipetta sottovuoto per rimuovere con cura il liquido, ripetere il risciacquo PBS per un totale di tre volte. Successivamente, aggiungere circa 500 microlitri di soluzione bloccante ai vetrini e incubarli per 10 minuti.

Rimuovere e quindi sostituire la soluzione bloccante con la stessa soluzione contenente da una a 300 diluizioni di anticorpi che legano il cal o di anticorpi nesina due. Quindi rimuovere la soluzione anticorpale e sciacquare i vetrini con PB S3 volte. Incubare i vetrini per un'ora a temperatura ambiente al buio.

Successivamente, preparare una diluizione da 1 a 1000 di anti-US Alexa floor 5 94 per i vetrini etichettati con legatura della mucca e anti Alexa Fluor 5 94 per i due vetrini etichettati Nesprin nella soluzione bloccante e conservare le soluzioni al buio fino a quando non sono necessarie. Rimuovere delicatamente il risciacquo finale con PBS e coprire le sezioni con gli anticorpi secondari diluiti per un'ora al buio. Dopo l'incubazione, rimuovere la soluzione di anticorpi secondari.

Quindi applicare una colorazione nucleare come DPI a 300 nanomolari in PBS per cinque minuti. Successivamente, sciacquare le sezioni altre due volte in PBS. Rimuovere quanta più soluzione di PBS possibile e coprire la sezione di tessuto con una goccia di terreno di montaggio.

Posizionare un vetrino coprioggetto sopra la sezione del tessuto evitando bolle d'aria e mettere da parte per 15-30 minuti a temperatura ambiente al buio. Quindi utilizzare un microscopio fluorescente per visualizzare la colorazione degli anticorpi e le proteine fluorescenti. Per le fette cerebellari, utilizzare un obiettivo 20x o 40x.

Per visualizzare i due cerchi nucleari di E-G-F-P-C come mostrato qui, E-G-F-P-C due può essere visualizzato direttamente in fette cerebellari nel canale di Fitzy. Inoltre, la colocalizzazione di EGFP con il legame della mucca, che marcano specificamente le cellule di Perkin, conferma che l'espressione di E-G-F-P-C two è confinata alle cellule di Perkin all'interno delle cellule di Perkin. La cache EGFP due è mirata all'involucro nucleare, come indicato dai modelli simili a RIM positivi di EGFP osservati intorno al nucleo.

In questo esempio, l'espressione della cache 2 di EGFP è stata rilevata in oltre il 70% delle cellule di Perkin positive al legame della mucca. La cache EGFP due sposta la nesprin endogena dall'involucro nucleare attraverso la saturazione dei domini solari disponibili. Di conseguenza, la NESINA 2 endogena viene spostata dall'involucro nucleare delle cellule di Perkin che esprimono la cache EGFP 2.

Mentre le cellule di Perkin che non esprimono E-G-F-P-C due conservano la nesina endogena due nell'involucro nucleare come previsto interale di controllo, che non esprimono CRE ricombinasi mostrano NESINA due nell'involucro nucleare dell'intera popolazione di cellule bikini uno. Quindi sono disponibili blocchi TC di tessuti. E-G-F-P-K due può essere visualizzato in circa quattro ore.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che l'entità della fissazione PFF e/o le condizioni di inclusione possono influenzare drasticamente l'antigenicità dell'epitopo. È quindi molto importante determinare le condizioni di fissazione ottimali che preservano il tuo epitopo specifico. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare il modello murino transgenico CK two per indirizzare l'espressione dell'anacardio VGFP a tessuti specifici.