Name: Preparazione e fotoacustico Analisi dei veicoli cellulari contenenti oro Nanorods (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Impara a preparare veicoli cellulari con nanorods d'oro per l'imaging fotoacustico del cancro. Questo metodo sfrutta i macrofagi associati ai tumori per migliorare la consegna mirata e la stabilità degli agenti di contrasto.

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Questo lavoro è stato parzialmente supportato dalla Regione Toscana e della Comunità Europea all&#39;interno della cornice della bolla ERANET + Progetti LUS e BI-TRE.

Nota: Tutte le concentrazioni di nanotubi d&#39;oro sono espressi in termini di molarità nominali Au. Per il confronto con altre opere, di notare che 1 M Au corrisponde approssimativamente a 20 micron nanotubi d&#39;oro, nel nostro caso. 1. Preparazione di cationici oro Nanorods Nota: Il metodo inizia con la sintesi di bromuro cetrimonio (CTAB) nanorods oro -capped dalla riduzione autocatalitica di HAuCl4 con acido ascorbico, secondo il protocollo introdotto da Nikoobakht et al 25 e adattato secondo Ratto et al 26... Poi questi nanorods oro sono modificate in modo da ottenere più biocompatibilità e affinità per le membrane plasmatiche, dalla combinazione di polietilenglicole trefoli 10, 11, 27, 28 e composti di ammonio quaternario 22. <ol><li> Purificare 24 ml nanotubi d&#39;oro CTAB-capped a concentration di 450 pM Au da due cicli di centrifugazione (12.000 xg, 30 min) e decantazione. Assicurarsi che il rapporto tra volume morto al volume iniziale è di circa 1/200 o inferiore per tutte le fasi di centrifugazione di questo protocollo. Utilizzare 500 pM acquosa CTAB come soluzione di lavaggio e infine trasferire le particelle in 6 ml 100 mM tampone acetato a pH 5, contenente 500 mM CTAB e 0,005% (v / v) polisorbato 20. </li><li> Aggiungere 30 microlitri 10 mM acquosa alfa-metossi-omega-mercapto-poli (etilene glicole) (MW ~ 5000) e lasciare reagire per 30 min a 37 ° C. </li><li> Aggiungere 30 ml 100 mM (11-Mercaptoundecyl) - N, N, N bromuro -trimethylammonium in dimetilsolfossido e lasciare a riposo per 24 ore a 37 ° C. </li><li> Successivamente, aggiungere 18 ml 0,005% (v / v) polisorbato 20 in acqua e purificare queste particelle da quattro cicli di centrifugazione (12.000 xg, 30 min) e decantazione. Utilizzare 0,005% (v / v) polisorbato 20 in acqua come soluzione di lavaggio e infine trasferire le particelle in 2,4 ml di PBS sterile a pH7.4. La concentrazione nominale finale di oro è di 4,5 mm. </li></ol> 2. Caricamento di murini macrofagi con oro Nanorods <ol><li> Utilizzare la / linea cellulare macrofagica monociti J774a.1 e DMEM supplementato con 10% di siero fetale bovino, 1 mM glutammina, 100 unità / ml di penicillina e 100 ug / ml di streptomicina come mezzo di coltura. Piastra 5 x 10 5 cellule in quattro piastre di Petri di 60 mm di diametro e consentire loro di crescere per 24 ore, in modo da essere subconfluenti al momento del distacco (vedi punto 2.2). <ol><li> In tutto il protocollo, di mantenere le cellule in condizioni di coltura standard (37 ° C, 5% di CO 2, aria 95% e il 100% di umidità relativa). Utilizzare una cappa a flusso laminare e dispositivi di protezione adeguati per manipolare le cellule. </li></ol></li><li> Dopo 24 ore, caricare le cellule con nanotubi d&#39;oro cationici e prepararli per essere incorporato in film chitosano: <ol><li> Per consentire alle particelle di essere assunti dalle cellule, aggiungere una aliquota di 4,5mM Au nanotubi d&#39;oro cationico in soluzione in ciascuno piastra di Petri, in modo da raggiungere una concentrazione finale di 100 micron Au. Lasciare le piastre di Petri in incubazione per 24 ore. </li><li> Successivamente, osservare le cellule al microscopio ottico per confermare le loro buone condizioni e il caricamento. Le cellule devono esibire loro normale morfologia e un certo numero di vescicole intracellulari scuri. Staccare le cellule con un raschietto, unire quelli da due piastre di Petri, al fine di ottenere una quantità adeguata di cellule per i seguenti passi (almeno 2 x 10 6 cellule), e centrifugare loro (120 xg, 6 min) per eliminare qualsiasi eccesso di nanotubi d&#39;oro cationici. Il pellet cellulare dovrebbe apparire quasi nero. </li><li> Sospendere il pellet in 2 ml di PBS e contare le cellule mediante l&#39;uso di una camera di Bürker. Centrifugare una sospensione contenente 2 x 10 6 cellule (120 xg, 6 min) e fissare il pellet in 2 ml di 3,6% (w / v) di formaldeide in PBS per dieci minuti a temperatura ambiente. Infine, lavare questo pellet tre volte da centrifugation (120 xg, 6 min) per rimuovere il fissativo. Usa PBS come soluzione di lavaggio. </li></ol></li></ol> 3. Radicamento dei macrofagi in Chitosano Cinema Nota: Le proprietà peculiari del chitosano 26, 27, 28, 29 sono sfruttati per la produzione di fantasmi biomimetici contenenti macrofagi colorati con nanotubi d&#39;oro cationici. Rispetto ad altri idrogel come agarosio, chitosano permette film che sono molto più forte e più sottile, che è fondamentale per la microscopia PA 6. La fabbricazione di questi fantasmi viene effettuata secondo precedenti protocolli 29, 30, 31 con alcune modifiche come prescritto nelle seguenti 30. <ol><li> Preparare una acidificata (pH 4,5, ottenuto mediante aggiunta di acido acetico) e viscosa 3% (w / v) a basso peso molecolare chitosano (MW medio 120 kDa) soluzione, mescolare bene elasciate omogeneizzare per 24 ore a 40 ° C. </li><li> Avanti, mescolare macrofagi murini contenenti nanotubi d&#39;oro cationico (2 x 10 6 celle) con 500 ml di soluzione di chitosano. </li><li> Per ottenere ~ 50 micron di spessore fantasmi, versare 250 mg del composto in 1,91 cm 2 stampi polistirolo e lasciarli sotto flusso di azoto per 24 ore. Successivamente, trattare questi campioni con 500 microlitri 1 M NaOH, per indurre reticolazione, e sciacquare con 10 ml di acqua ultrapura. </li></ol> 4. Prova di stabilità di conversione Fotoacustica Nota: La stabilità della conversione PA è indagato per mezzo di esperimenti di PA con la configurazione fatta in casa, che è descritto in rif 6. <ol><li> Sospendere un film chitosano contenente macrofagi in acqua deionizzata, per esempio mediante l&#39;uso di un supporto di plastica immerso in una capsula di Petri, in modo da mantenere una distanza di ~ 5 mm dal fondo della piastra. Mettere questo piatto su un palco XY micrometricaal fine di controllare la posizione del campione. </li><li> Primo un fascio laser con ~ 5 durata nsec impulsi in risonanza con la banda plasmonica longitudinale dei nanotubi oro (ad esempio, da un oscillatore parametrico ottico pompato dalla terza armonica di un Nd Q-switched: YAG con lunghezza d&#39;onda di 400 - 2,500 durata dell&#39;impulso nm e 5 nsec) perpendicolare alla superficie del film con un diametro dello spot ~ 300 micron. <ol><li> Inserire un attenuatore di fronte all&#39;uscita del laser per sintonizzare la fluenza laser e utilizzare un divisore di fascio di concentrare parte del fascio laser per un contatore di energia (per esempio, un rilevatore piroelettrico) e monitorare fluttuazioni di fluenza. Mantenere la fluenza ottica sotto ~ 1 mJ / cm 2 per impulso durante l&#39;allineamento. Utilizzare appropriata occhiali di sicurezza laser ogni volta che il laser è acceso. </li></ol></li><li> Dip un trasduttore ad ultrasuoni (gamma di frequenza di 1 - 20 MHz) nella piastra Petri ~ 2 millimetri fuori della superficie della pellicola e regolarne la posizione utilizzando definizioni micrometricie fasi di rotazione per massimizzare il segnale PA emesso dal film. </li><li> Determinare un influenza sonda F LO che non danneggia il campione 6: <ol><li> Irradiare un punto a caso del campione ad una fluenza circa 1 mJ / cm 2 per impulso per almeno 500 impulsi. Per ogni impulso, acquisire il segnale PA corrispondente dal trasduttore ultrasonico e fluenza laser dal contatore di energia con un oscilloscopio. Assegnare un nome alla fluenza media come prova F LO. </li><li> Calcolare l&#39;intensità del segnale PA come ampiezza picco-picco in funzione del numero di impulsi. Per controbilanciare le fluttuazioni di intensità laser, normalizzare l&#39;ampiezza di ciascun segnale PA al rapporto tra la propria fluenza a processo F LO. Analizzare l&#39;andamento dell&#39;intensità normalizzato PA in funzione del numero di impulsi e verificare la stabilità nel tempo. </li><li> Nel caso di instabilità, ripetere i punti 4.4.1 a 4.4.3 con un valore inferiore di F LO <sup&gt; trial. Nel caso di stabilità, ripeterli con un valore di processo F LO maggiore di circa 10%, fino manifestarsi di una perdita di stabilità. Impostare la sonda fluenza F LO come il secondo valore più alto di tentativi F LO che assicura stabilità. </li></ol></li><li> Misurare una soglia fluenza rimodellamento: <ol><li> Scegliere un altro punto a caso del campione e la sonda un&#39;intensità media PA (I LO a) superiore a 500 impulsi a F LO. </li><li> Impostare un fluenza nominale superiore a F LO e fornire 50 impulsi. Nome loro influenza media come F exc. </li><li> Sonda un&#39;intensità media PA (I LO b) più di 500 impulsi a F LO ancora una volta. Calcolare il rapporto R = I LO b / I LO a. Un valore di R al di sotto dell&#39;unità testimonia un cambiamento irreversibile delle proprietà ottiche del campione. </li><li> Utilizzare il palco micrometrica XY per spostare il film e cambiare il point del campione a caso. Ripetere i punti 4.5.1 a 4.5.4 con diversi valori di F esc, in modo da prendere un paio di valori di R sotto, intorno e sopra l&#39;unità. 15 punti sono ragionevoli. </li><li> Plot R in funzione di F exc e identificare la soglia rimodellamento fluenza F th come tale valore quando R inizia a differire da quello oltre incertezza statistica. 6 </li></ol></li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

La nozione di indirizzare i macrofagi associati al tumore sta emergendo come un concetto potente per combattere il cancro 34, 35, 36. Qui, invece della loro distruzione, queste cellule vengono reclutati come veicoli cellulari per portare nanotubi d&#39;oro in un tumore, dallo sfruttamento del loro tropismo. Questa prospettiva richiede una progettazione attenta delle particelle, la loro integrazione nelle cellule e la loro caratterizzazione. Abbiamo trovato che la fo...

Negli ultimi dieci anni, varie particelle plasmoniche, come nanotubi d&#39;oro, nanoshells e nanocages, hanno ricevuto una notevole attenzione per le applicazioni in ottica biomedica 1, 2, 3, 4. In contrasto con nanosfere oro standard, queste particelle filtrate risuonano nella finestra vicino infrarosso (NIR) che prevede più profonda penetrazione ottica attraverso il corpo e alto contrasto ottico sui componenti endogene 1. Questa caratteristica ha destato l&#39;interesse per applicazioni innovative, come il fotoacustico (PA) imaging e l&#39;ablazione fototermica di cancro. Tuttavia, diversi problemi frenano la penetrazione clinica di queste particelle. Per esempio, la loro attivazione ottica tende ad indurre il loro surriscaldamento e modificare le loro forme funzionali verso profili più sferiche, che controlla una fotoinstabilità 5, 6, 7, 8 </sup&gt;, 9. Un altro problema che domina il dibattito scientifico è la loro consegna sistemica in tumori. In particolare, nanotubi d&#39;oro si combinano dimensioni che sono l&#39;ideale per pervadere tumori che mostrano una maggiore permeabilità e ritenzione e la facilità di coniugazione con sonde specifiche di marcatori maligni. Pertanto, la loro preparazione per iniezione diretta nel flusso sanguigno è percepito come un regime fattibile 10, 11, 12, 13. Comunque, questa via rimane problematica, con la maggior parte delle particelle diventando catturati dai fagociti mononucleati 10, 11, 12. Inoltre, un&#39;altra preoccupazione è la stabilità ottica e biochimica delle particelle dopo la circolazione attraverso il corpo 14. Quando le particelle perdono la loro stabilità colloidale e di aggregazione, le loro caratteristiche plasmoniche e dinamiche di trasferimento di calore possono soffrire di accoppiamento plasmoniche 15, </sup&gt; 16, 17 e cross-surriscaldamento 18. Più recentemente, l&#39;idea di sfruttare il tropismo di macrofagi associati al tumore è emerso come un&#39;alternativa intelligente 19, 20, 21. Queste celle contengono una innata capacità di rilevare e pervadere i tumori con elevata specificità. Pertanto, una prospettiva potrebbe essere quella di isolare queste cellule da un paziente, caricarli con nanotubi d&#39;oro in vitro e poi iniettare di nuovo nel paziente, con l&#39;intento di usarli come veicoli cellulari responsabili della consegna. Un altro vantaggio sarebbe quello di ottenere un maggiore controllo sulla stabilità ottica e biochimico delle particelle, in quanto la loro interfaccia biologica sarebbe costruita in vitro. Ancora, le prestazioni di questi veicoli cellulari come agenti di contrasto ottici hanno bisogno di una analisi critica. In questo lavoro, si descrive la preparazione e criticità di Cellulveicoli ar contenenti nanotubi d&#39;oro per la formazione immagine PA di cancro. Nanorods oro PEG sono modificati con composti di ammonio quaternario 22, al fine di ottenere un profilo cationico che si prevede di promuovere le loro interazioni con membrane plasmatiche 23, 24. Queste particelle subiscono l&#39;assorbimento efficiente e aspecifica dalla maggior parte dei tipi cellulari, si spera senza interferire molto con le loro funzioni biologiche. macrofagi murini sono caricati con un massimo di ben 200, 000 nanotubi d&#39;oro cationici per cella, che diventano trovino all&#39;interno di vescicole endocytic stretti. Questa configurazione dovrebbe sorgere preoccupazione, a causa della minaccia di accoppiamento plasmoniche e cross-surriscaldamento all&#39;interno di queste vescicole. Pertanto, i macrofagi sono incorporati in idrogel biopolimerico che imitano i tessuti biologici, per verificare che la maggior parte della stabilità della conversione PA delle particelle è trattenuto nel trasferimento dal mezzo di crescita per le vescicole endocitiche. effectivcriteri di valutazione e sono elaborati al fine di misurare la stabilità della conversione PA in condizioni di immediato interesse per l&#39;imaging PA. Una soglia rimodellare è impostato per lo insorgenza di instabilità ottica dopo un treno di 50 impulsi laser con la frequenza di ripetizione tipica di 10 Hz. Siamo certi che questi risultati possono fornire lo slancio per lo sviluppo di nuove strategie per fornire particelle plasmoniche ai tumori.

<table><tbody><tr><td>Esadeciltrimetilammonio bromuro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6269</td><td>Per sintetizzare nanobarre d'oro Cloruro</td></tr><tr><td>d'oro (III) triidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>520918</td><td>Per sintetizzare nanobarre d'oro</td></tr><tr><td>Nitrato d'argento</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6506</td><td>Per sintetizzare nanobarre d'oro</td></tr><tr><td>Acido L-ascorbico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5960</td><td>Per sintetizzare nanobarre d'oro</td></tr><tr><td>Boroidruro di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Per sintetizzare nanosemi d'oro</td></tr><tr><td>MeO-PEG-SH</td><td>Iris Biotech PEG1171</td><td></td><td>Per PEGylare nanorod d'oro. Peso molecolare circa 5.000 Da.</td></tr><tr><td>Acido acetico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320099</td><td>Per PEGilare nanobarre d'oro e solubilizzare chitosano</td></tr><tr><td>Acetato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8750</td><td>Per PEGylate gold nanorods</td></tr> <tr><td>(11-Mercaptoundecyl)-N,N-trimethylammonium bromide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>733305</td><td>Per modificare nanorod d'oro con composti di ammonio quaternario</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276855</td><td>Per solubilizzare (11-mercaptoundecil)-N,N,N-trimetilammonio</td></tr><tr><td>bromuro Polisorbato 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287</td><td>Per centrifugare nanobarre d'oro PEGilate</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lonza</td><td>BE17-516F</td><td>Per sospendere nanobarre d'oro prima dell'incubazione con le cellule e per trattare i pellet delle cellule</td></tr><tr><td>J774a.1</td><td>ATCC</td><td>TIB-67</td><td>Linea cellulare murina monocita/macrofago</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Lonza</td><td>BE12-707F</td><td>Terreno di coltura cellulare</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Lonza</td><td>DE14-801F</td><td>Da aggiungere al terreno di coltura cellulare</td></tr><tr><td>L-glutammina</td><td>Lonza</td><td>BE17-605E</td><td>Da aggiungere al terreno di coltura cellulare</td></tr><tr><td>Penicillina/streptomicina</td><td>Lonza</td><td>DE17-602E</td><td>Da aggiungere al terreno di coltura cellulare</td></tr><tr><td>Piastra di Petri</td><td>NEST</td><td>705001</td><td>Coltura cellulare piatto</td></tr><tr><td>Raschietto cellulare</td><td>EuroClone</td><td>ES7018</td><td>Per staccare le cellule</td></tr><tr><td>Formaldeide</td><td>Fluka</td><td>47630</td><td>Per fissare le cellule</td></tr><tr><td>Chitosano, a basso peso molecolare</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>448869</td><td>deacetilato al 75-85%. Peso molecolare circa 120.000 Da.</td></tr><tr><td>Idrossiide di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>306576</td><td>Per insolubilizzare il chitosano e generare l'idrogel</td></tr><tr><td>Piastre di coltura cellulare in polistirene</td><td>NEST</td><td>702011</td><td>Utilizzato come stampi per fabbricare idrogel di chitosano</td></tr><tr><td>Oscillatore parametrico ottico pompato dalla terza armonica di un laser Nd:YAG Q-switched</td><td>Continuum, Santa Clara, USA</td><td>OPO surelite plus</td><td>Fonte di eccitazione ottica per test fotoacustici</td></tr><tr><td>Rivelatore piroelettrico&nbsp;</td><td>Gentec, Quebec, Canada</td><td>QE8SP</td><td>Per monitorare la fluenza ottica per test fotoacustici</td></tr><tr><td>Idrofono ad ago preamplificato</td><td>Precision Acoustic, Dorset, Regno Unito</td><td>Modello con diametro del sensore di 1 mm e gamma di frequenza 1-20 MHz</td><td>Per misurare i segnali fotoacustici</td></tr></tbody></table>

preparazione e fotoacustico analisi dei veicoli cellulari contenenti oro nanorods

Preparation and Photoacoustic Analysis of Cellular Vehicles Containing Gold Nanorods

nanorods oro sono attraenti per una gamma di applicazioni biomediche, quali l&#39;ablazione fototermica e di imaging fotoacustico di cancro, grazie alla loro assorbanza ottica intensa nella finestra vicino infrarosso, bassa citotossicità e potenziale per casa in tumori. Tuttavia, la loro consegna ai tumori rimane ancora un problema. Un approccio innovativo consiste dello sfruttamento del tropismo di macrofagi associati al tumore che può essere caricato con nanotubi oro in vitro. Qui, descriviamo la preparazione e l&#39;ispezione dei veicoli fotoacustica cellulari contenenti nanotubi d&#39;oro. nanorods oro PEG sono modificati con composti di ammonio quaternario, per ottenere un profilo cationico. A contatto con macrofagi murini in piatti ordinari Petri, queste particelle si trovano a subire massiccia diffusione in vescicole endocytic. Poi queste cellule sono incorporati in idrogel biopolimerico, che vengono utilizzati per verificare che la stabilità della conversione fotoacusticadelle particelle viene mantenuto il loro inserimento in veicoli cellulari. Siamo certi che questi risultati possono fornire nuovi spunti per lo sviluppo di nuove strategie per fornire particelle plasmoniche ai tumori.

Qui, la fattibilità di veicoli cellulari contenenti nanotubi d&#39;oro per la formazione immagine PA del cancro è mostrato insieme a risultati tipici di protocollo. Le immagini TEM in figura 1 mostra il solito aspetto delle particelle dopo il punto 1 e dei loro veicoli cellulari dopo il punto 2. La preparazione delle particelle e delle cellule per l&#39;imaging TEM è descritto altrove 17. nanotubi d...

Mostriamo la preparazione e affrontiamo la fattibilità di veicoli cellulari contenenti nanobarre d'oro per l'imaging fotoacustico del cancro.

Preparazione e fotoacustico Analisi dei veicoli cellulari contenenti oro Nanorods

Gold nanorods are attractive for a range of biomedical applications, such as the photothermal ablation and the photoacoustic imaging of cancer, thanks to ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è utilizzare veicoli cellulari contenenti nanobastoncini d'oro come strategia innovativa per consegnare particelle plasmoniche ai tumori. Il nostro protocollo può aiutare a rispondere a domande fondamentali riguardo lo sviluppo di approcci fotoacustici e fototermici per l'imaging e il trattamento del cancro mediante l'uso di agenti di contrasto esogeni. Questo metodo si basa sul tropismo dei microfagi associati al tumore per consegnare particelle plasmoniche ai tumori.L'idea consiste nell'isolare queste cellule da un paziente, caricarle con particelle plasmoniche in vitro e quindi reiniettarle nel loro ospite con l'obiettivo di utilizzarle come contenitori per gli estrogeni. Uno dei vantaggi di questo approccio è la possibilità di ottenere un maggiore controllo sulla stabilità ottica e biochimica delle particelle, poiché l'interfaccia biologica viene completamente assemblata in vitro. Per iniziare, purificare sei millilitri di nanobastoni d'oro rivestiti con cetrimonio a una concentrazione di oro di 450 micromolare, mediante due centrifugazioni, seguite da decantazione e lavaggio in bromuro di cetrimonio acquoso 500 micromolare.Quindi, aggiungere 1,5 millilitri di tampone acetato 100 millimolare con bromuro di cetrimonio e polisorbato 20 nel contenitore contenente il pellet di particelle d'oro. Successivamente, aggiungere 7,5 microlitri di alfa-Metossi-omega-mercapto polietilene glicole 10 millimolare in acqua e lasciare reagire per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Poi, aggiungere 7,5 microlitri di bromuro di mercaptoundecil trimetilammonio 100 millimolare in dimetilsulfossido.Successivamente, lasciare riposare la reazione per 24 ore a 37 gradi Celsius. Dopo 24 ore, aggiungere 4,5 millilitri di polisorbato 20 allo 0,005% in acqua. Ora, utilizzando questa soluzione di polisorbato 20 leggera, purificare le particelle mediante quattro cicli di centrifugazione e decantazione.Infine, trasferire le particelle in 600 microlitri di soluzione salina tamponata al fosfato sterile. La concentrazione nominale dell'oro dovrebbe ora essere 4,5 millimolare. Per preparare le cellule, seminare due piastre da 60 millimetri con mezzo milione di cellule monocitiche macrofagiche in mezzo di coltura di Dulbecco modificato (DMEM) integrato e coltivarle per 24 ore.Dopo 24 ore, sostituire il mezzo cellulare con mezzo fresco, integrato con le nanobacchette d'oro cationiche preparate per una concentrazione finale di 100 micromolare di oro e soluzione in ogni piastra di Petri. Proseguire quindi l'incubazione per altre 24 ore. Il giorno successivo, esaminare le cellule al microscopio.Dovrebbero presentare una morfologia normale e numerose vescicole intracellulari scure. Se l'aspetto delle cellule è buono, lavarle con mezzo fresco, staccarle utilizzando una spatola e unire le cellule provenienti da due piastre per ottenere almeno due milioni di cellule in un unico campione. Centrifugare ora i campioni a 120 G per 6 minuti per rimuovere qualsiasi eccesso di nanobastoncini d'oro catodici.Eliminare i soprannatanti. I pellet cellulari dovrebbero apparire quasi neri. Sospendere i pellet in due millilitri di soluzione salina fosfato tamponata e contare le cellule utilizzando una camera di Neubauer.Quindi, mescolare le sospensioni contenenti due milioni di cellule e centrifugare a 120 G per sei minuti. Riportare i pellet in due millilitri di formaldeide al 3,6% in soluzione salina tamponata al fosfato e lasciare fissare le cellule per 10 minuti a temperatura ambiente. Infine, rimuovere il fissativo mediante tre lavaggi con soluzione salina tamponata al fosfato.Un giorno prima di iniziare questa procedura, preparare 500 microlitri di una soluzione acida di chitosano a basso peso molecolare al 3% in peso/volume. Raggiungere un pH di 4,5 aggiungendo acido acetico. Per mescolare completamente la soluzione, lasciarla omogeneizzare per 24 ore a 40 gradi Celsius.Il giorno successivo, mescolare i macrofagi murini preparati con le nanobastoncini d'oro con tutti i 500 microlitri di soluzione di chitosano. Per ottenere fantocci spessi 50 micron, versare 250 milligrammi della miscela in stampi di polistirene di 1,9 centimetri quadrati. Lasciare i campioni a riposo sotto cappa per 24 ore.Il giorno successivo, trattare i campioni con 500 microlitri di idrossido di sodio acquoso 1 molare, al fine di indurre il legame incrociato, e risciacquarli con 10 millilitri di acqua ultrapura. Analizzare la stabilità della conversione fotoacustica mediante un microscopio fotoacustico personalizzato, dotato di un oscillatore parametrico ottico, un attenuatore per regolare il flusso ottico e un trasduttore ad ultrasuoni. Iniziare sospendendo il film di chitosano contenente i macrofagi in acqua deionizzata, utilizzando un supporto in plastica immerso in un serbatoio d'acqua.Determinare un flusso di prova che non danneggi il campione e che produca un'emissione fotoacustica con un rapporto segnale-rumore sufficiente. Impostare un flusso di prova e i parametri di acquisizione. Per ogni impulso proveniente dal laser, acquisire il corrispondente segnale fotoacustico dal trasduttore a ultrasuoni.Calcolare il rapporto tra l'intensità fotoacustica e il flusso laser per ogni impulso. Analizzarne l'andamento in funzione del numero di impulsi e verificarne la stabilità nel tempo. In caso di instabilità, ripetere questa misurazione con un flusso di prova inferiore.Nel caso di stabilit&agrave;, la densit&agrave; di flusso di prova pu&ograve; essere utilizzata come densit&agrave; di flusso sonda, a condizione che la sua emissione fotoacustica presenti un rapporto segnale-rumore adeguato. Successivamente, misurare una densit&agrave; di flusso soglia per la riconformazione. Scegliere un punto casuale del campione, impostare il laser sulla densit&agrave; di flusso sonda e misurare un'intensit&agrave; fotoacustica media, A, su 500 impulsi.Successivamente, aumentare la fluenza nominale al di sopra della fluenza della sonda ed erogare 50 impulsi. Denominare la loro fluenza media come F eccitazione. Riportare il laser alla fluenza della sonda e ripetere la misurazione, calcolando l'intensità media fotoacustica, B, su 500 impulsi.Ora, calcolare il rapporto R tra B e A. Un valore di R inferiore all'unità indica che si è verificato un cambiamento irreversibile nelle proprietà ottiche del campione. Successivamente, utilizzare lo stage micrometrico per spostare il film e modificare in modo casuale il punto di misurazione del campione. Quindi, ripetere la misurazione di R per diversi valori di eccitazione F, in modo da ottenere alcuni valori di R intorno e al di sotto dell'unità.Una raccolta di dati di circa 15 punti R è ragionevole. Successivamente, tracciare R in funzione dell'eccitazione F e identificare la soglia di ripristino come quella fluenza al di sopra della quale R si discosta dall'unità senza incertezze. Tipicamente, i nanobastoni cationici d'oro subiscono un accumulo massiccio nei macrofagi, che mantengono la loro morfologia normale.Si osserva che le particelle sono confinate all'interno di vescicole endocitiche ristrette. Successivamente nel processo, l'inclusione nell'idrogel di chitosano non sembra influenzare la morfologia cellulare. Le cellule sono ben disperse in tutto il campione, come osservato mediante micrografia.I controlli dei film di chitosano contenenti nanobastoncini d'oro senza cellule sono omogenei. Le bande plasmoniche dei nanobastoncini d'oro sono preservate nei loro veicoli cellulari. Effetti come l'accoppiamento plasmonico o un diverso assorbimento delle particelle in base a dimensioni e forma non hanno svolto un ruolo sostanziale in questi protocolli.Dopo aver raccolto i dati, l'andamento di R in funzione dell'eccitazione di F fornisce un'indicazione dei dati e dell'analisi necessaria per determinare la soglia di F. In questo caso, la soglia di F è risultata essere di circa 11 millijoule per centimetro quadrato. Le misurazioni fotoacustiche si sono rivelate altamente accurate, con un rapporto segnale-rumore superiore a 20 su 500 impulsi.Il nostro protocollo è innovativo rispetto ai metodi esistenti per quanto riguarda la progettazione delle particelle e lo studio della loro fotostabilità. La modifica di nanobastoncini d'oro pegilati con cationi ammonio quaternari garantisce un'elevata efficienza di assorbimento cellulare mantenendo al contempo la stabilità colloidale. La misurazione della stabilità della conversione fotoacustica, definita mediante la soglia di ripristino della forma, è quantitativa e riproducibile.Poiché queste particelle sono destinate a essere utilizzate come agenti di contrasto per l'imaging fotoacustico, una sonda fotoacustica è l'ideale per testarne le caratteristiche funzionali. I veicoli cellulari di particelle plasmoniche risultano visibili come agenti di contrasto per l'imaging fotoacustico. La loro fotostabilità è identica a quella delle particelle plasmoniche libere.L'obiettivo del nostro lavoro attuale è la fisiologia di queste cellule, con particolare attenzione alla loro vitalità e attività chemiotattica.

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Bioingegneria

Abbiamo sintetizzato nanostars oro a forma di stella d'argento con un metodo semi mediata della crescita. Il diametro del nanostars varia da 200 a 300 nm e il numero di punte variano da 7 a 10. Le nanoparticelle hanno una vasta modalità di risonanza plasmonica di superficie centrato nel vicino infrarosso.

Sintesi Nanostar oro con un metodo d&#39;argento crescita Seed Mediated

In questo video, descriviamo la tecnica di microscopia a campo scuro (DFM) combinata con l'analisi di tracciamento a singola particella (SPT) per monitorare l'interazione delle nanobarre d'oro plasmoniche con la membrana cellulare di una specifica linea cellulare di interesse. L'analisi combinata DFM e SPT consente la visualizzazione del movimento dei nanorod attraverso la membrana cellulare con un'elevata risoluzione spaziotemporale.

Microscopia in campo scuro per visualizzare la dinamica diffusionale di nanorod sulla membrana cellulare

Segnaliamo su tecniche per micropattern nanoporosi film sottili di oro tramite la stampa stencil e fotolitografia, così come i metodi di cellule di coltura, su modelli di microfabbricati. Inoltre, si descrivono metodi di analisi di immagine per caratterizzare morfologia del materiale e le cellule in coltura mediante scansione elettronica e tecniche di microscopia a fluorescenza.

Microfabrication di Patterns Oro nanoporosi per Cell-materiali Interaction Studies

Questo protocollo delinea come utilizzare il riscaldamento transitorio associato all'assorbimento ottico delle nanobarre d'oro per stimolare la differenziazione e l'attività intracellulare del calcio nelle cellule neuronali. Questi risultati aprono potenzialmente nuove applicazioni nelle protesi neurali e negli studi fondamentali nelle neuroscienze.

Oro nanorod-assistito stimolazione ottica di cellule neuronali

Descriviamo un metodo semplice per la produzione altamente stabili gruppi oligomerici di nanoparticelle di oro attraverso la riduzione di acido cloroaurico (HAuCl4) con tiocianato di sodio (NaSCN). I oligoclusters hanno una distribuzione granulometrica ristretta e possono essere prodotti con una vasta gamma di dimensioni e cappotti superficie.

Un metodo semplice per la dimensione sintesi controllata di stabili oligomeriche Grappoli di oro nanoparticelle in condizioni ambientali

Questo protocollo descrive un metodo di preparazione semplice per nanoparticelle di oro integrato liposomi foto-reattivo con i materiali disponibili commercialmente. Viene inoltre illustrato come misurare il processo di cavitazione di microbolle dei liposomi sintetizzati sul trattamento di laser pulsato.

Sintesi di nanoparticelle d&#39;oro liposomi Integrated Photo-reattiva e la misurazione del loro microbolle cavitazione su impulso laser di eccitazione

Questo documento descrive un protocollo per la sintesi di nanotubi oro, basato sull'utilizzo di idrochinone come agente riducente, più i vari meccanismi di controllo loro dimensioni e proporzioni.

Idrochinone Based Sintesi di oro Nanorods

Descriviamo un metodo di sintesi biocompatibile nanoparticelle d'oro di 10 nm, funzionalizzate di glicole di polietilene rivestimento sulla superficie. Queste particelle possono essere usate in vitro e in vivo per la consegna di terapeutica a scala nanometrica cellulare ed extracellulare spazi che sono difficilmente accessibili con dimensioni delle nanoparticelle convenzionali.

Sintesi di particelle d'oro rivestite di polimeri 10-nm funzionalizzate per il Targeting di endotelio e Drug Delivery

Plasmoniche nanorod oro possono essere intrappolati in liquidi e ruotato a frequenze kHz utilizzando pinzette ottiche polarizzata circolarmente. L'introduzione di strumenti per l'analisi dinamica browniano e luce scatteringspectroscopy conduce ad un potente sistema di ricerca e applicazione in numerosi campi della scienza.

Costruzione e funzionamento di un sistema motore basato su luce oro Nanorod Rotary

Viene descritto un metodo affidabile e facilmente riproducibile per la preparazione di nanocluster in oro fotoluminescenti funzionalmente e quasi infrarossi e il loro rilevamento diretto all'interno delle cellule HeLa mediante citometria di flusso e microscopia a scansione laser confocale.

Sintesi di nanocluster d'oro a emissione di infrarossi nel vicino infrarosso per applicazioni biologiche

Qui, mostriamo l'uso della tradizionale microscopia a campo scuro per monitorare la dinamica delle nanorodi d'oro (AuNR) sulla membrana cellulare. La posizione e l'orientamento dei singoli AuR vengono rilevati utilizzando ImageJ e MATLAB, e gli stati diffusivi degli AuR sono caratterizzati da un'analisi di tracciamento di singole particelle.

Visualizzazione della dinamica di diffusione dei nanorodi d'oro sulla membrana cellulare utilizzando la microscopia a campo scuro a nanoparticella singola

Impara a preparare veicoli cellulari con nanorods d'oro per l'imaging fotoacustico del cancro. Questo metodo sfrutta i macrofagi associati ai tumori per migliorare la consegna mirata e la stabilità degli agenti di contrasto.

Preparazione e fotoacustico Analisi dei veicoli cellulari contenenti oro Nanorods

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