Valutazione del polmone metastasi in mouse mammarie tumorali modelle da Quantitative Real-time PCR

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di rilevare la quantità di uno specifico MRNA dalle cellule tumorali nel polmone, come metodo per analizzare le metastasi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è una misura quantitativa delle metastasi. Per eseguire una dissezione del tumore polmonare, dopo aver soppresso un topo utilizzando una dose letale di isofluoro secondo il protocollo di testo, posizionare il topo su una tavola di schiuma sulla schiena con gli arti divaricati e utilizzare perni di dissezione per fissarlo alla tavola.

Dopo aver usato l'etanolo per spruzzare il topo, usa una pinza per afferrare la parte inferiore dell'animale al centro e, con le forbici, taglia verso l'alto verso il collo attraverso la pelle, facendo attenzione a non perforare la cavità peritoneale del topo. Ora, afferra il peritoneo all'estremità inferiore dell'animale e inizia a tagliare verso l'alto verso la base del collo. Tagliare con cura lungo i lati sinistro e destro della gabbia toracica, facendo attenzione a non recidere i vasi sanguigni che potrebbero sanguinare nella cavità toracica.

Rimuovere le costole tagliando a sinistra e a destra, attraverso il diaframma e le parti superiori della gabbia toracica. Quindi, usando una pinza, afferrare la trachea del topo e tirare in avanti, quindi utilizzare le forbici da dissezione per recidere la trachea prima di rimuovere i polmoni dal topo. Usa il PBS per lavare delicatamente il tessuto polmonare.

Quindi, dopo una valutazione macroscopica del tessuto polmonare secondo il protocollo di testo, se i polmoni devono essere analizzati immediatamente, procedere all'isolamento dell'RNA. Per isolare l'RNA dal tessuto, inizia omogeneizzando il tessuto utilizzando uno dei metodi elencati nel protocollo di testo. Preparare il tampone di lisi da un kit di isolamento dell'RNA e aggiungere 20 microlitri di captoetanolo tumorale a ciascun millilitro di tampone di lisi.

Risospendere ogni 30 grammi di tessuto in 300 microlitri di tampone di lisi e, con un sonicatore impostato al 30% di ampiezza, sonicare il tessuto per 10 secondi. Aggiungere 10 microlitri di protinasi K a 590 microlitri di tampone TE e aggiungere 600 microlitri di tampone a 300 microlitri di tessuto sonicato. Incubare a temperatura ambiente per 10 minuti.

Quindi, centrifugare i campioni a una velocità maggiore o uguale a 13.000 volte G per 10 minuti per rimuovere i detriti. Quindi trasferire il surnatante in nuove provette. Aggiungere 450 microlitri di etanolo ogni 900 microlitri di surnatante per far precipitare l'RNA.

Quindi trasferire 700 microlitri della miscela di etanolo lisato in una colonna di RNA. Ruotare di nuovo a una velocità maggiore o uguale a 13.000 volte G per un minuto per legare l'RNA alla colonna. Quindi scartare i rifiuti liquidi e aggiungere il surnatante rimanente alla colonna e centrifugare di nuovo.

Quindi, aggiungere 350 microlitri di tampone di lavaggio uno nella parte superiore della colonna e centrifugare i campioni per 30 secondi. Eliminare i rifiuti liquidi e sostituire la colonna nel tubo. Preparare la DNasi mescolando cinque unità di DNasi un enzima con cinque microlitri di tampone DNasi 10X e 40 microlitri di acqua priva di DNasi RNasi per ogni campione.

Aggiungere 50 microlitri di miscela di DNasi a ciascuna colonna e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti. Quindi aggiungere 350 microlitri di tampone di lavaggio uno alle colonne e centrifugare i campioni per 30 secondi. Dopo aver scartato la soluzione di scarto, aggiungere 600 microlitri di tampone di lavaggio due e centrifugare per altri 30 secondi.

Scartare il liquido prima di aggiungere 250 microlitri di tampone di lavaggio due, quindi centrifugare per due minuti. Trasferire la colonna in una nuova provetta di raccolta e aggiungere da 50 a 100 microlitri di acqua priva di RNasi DNasi alla colonna. Dopo l'incubazione per un minuto, centrifugare per un minuto.

Eseguire nuovamente l'eluato raccolto attraverso la colonna per aumentare la resa dell'RNA. Per un uso immediato, conservare i campioni sul ghiaccio. Per un uso successivo, congelare a scatto su ghiaccio secco o azoto liquido e conservare a meno 80 gradi Celsius fino al momento del bisogno.

Utilizzando uno spettrofotometro, quantificare l'RNA. Quindi, in provette o piastre sterili per PCR prive di RNasi DNasi, utilizzare da 0,5 a 2 microgrammi di RNA totale per preparare la miscela di reazione per la prima transintesi, come mostrato in questa tabella. Mescolare, centrifugare delicatamente e programmare una macchina PCR standard utilizzando il programma mostrato qui.

Al termine della reazione, utilizzare acqua sterile priva di nucleasi per diluire la reazione finita al volume desiderato. Per eseguire la PCR in tempo reale, utilizzare un C DNA di controllo positivo, come HER2 umano, per impostare una curva standard per ciascun set di primer preparando da una a quattro diluizioni seriali del C DNA per generare cinque standard. Successivamente, calcola il numero di campioni totali, che dovrebbe includere la curva standard e i campioni sperimentali.

Quindi, in provette sterili prive di RNasi DNasi, preparare una master mix per ogni gene sperimentale di interesse, nonché un controllo interno, come il gapdh. Preparare una piastra di prova contenente un microlitro di C DNasi per ogni campione standard o sperimentale. Assegnare almeno un campione di DNA C per pozzetto, per ogni sonda di innesco.

Aggiungere 19 microlitri di mastermix per pozzetto, per ogni sonda di primer. Questo esperimento di bioluminescenza dimostra che i polmoni di topo trattati con ACT1, che ha come bersaglio la proteina di giunzione gap Connexin 43, appaiono negativi per l'attività della luciferasi, suggerendo l'assenza di cellule tumorali nel tessuto. Tuttavia, l'analisi delle sezioni H & E del tessuto polmonare mostra micrometastasi che non sono state illuminate dalla luciferasi, suggerendo che l'imaging della luciferasi non è abbastanza sensibile per rilevare un basso numero di cellule tumorali.

Di seguito sono riportati i risultati di un esperimento qRT-PCR, utilizzando una sonda specifica per HER2, per rilevare le cellule tumorali umane HER2 più JIMT1 nel tessuto polmonare da cellule originariamente trapiantate nel cuscinetto adiposo della memoria del topo. Sebbene non siano state osservate metastasi grossolanamente visibili su nessuno dei polmoni, in due degli 11 campioni, la qRT-PCR ha rilevato metastasi. In questa figura, è stata preparata un'analisi della curva standard per determinare i livelli relativi di HER2 normalizzati al gapdh polmonare di topo in una serie di numeri cellulari.

I risultati indicano che la qRT-PCR, utilizzando la sonda HER2, era abbastanza sensibile da rilevare i livelli di HER2 in appena 10 cellule. Infine, questa analisi di regressione mostra il numero relativo di cellule in ciascun campione polmonare, compresi i controlli positivi e negativi. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in sei-otto ore, se eseguita correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di usare precauzioni per mantenere l'integrità dell'RNA durante l'isolamento dell'RNA e la reazione di trascrittasi inversa. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come rilevare le metastasi nell'intero tessuto polmonare, mediante PCR quantitativa in tempo reale.