JoVE Science Education

Advanced Biology

Developmental Biology

Pluripotenza indotta

JoVE Science Education
Developmental Biology

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

JoVE Science Education Developmental Biology

Induced Pluripotency

2.8: Embryonic Stem Cell Culture and Differentiation

2.10: An Introduction to Organogenesis

25,721 Views

•

08:58 min

•

April 30, 2023

Overview

Le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) sono cellule somatiche che sono state geneticamente riprogrammate per formare cellule staminali indifferenziate. Come le cellule staminali embrionali, le iPSC possono essere coltivate in condizioni di coltura che promuovono la differenziazione in diversi tipi di cellule. Pertanto, le iPSC possono fornire una fonte potenzialmente illimitata di qualsiasi tipo di cellula umana, che è un importante passo avanti nel campo della medicina rigenerativa. Tuttavia, sono ancora necessarie ulteriori ricerche sulla derivazione e la differenziazione delle iPSC per utilizzare effettivamente queste cellule nella pratica clinica.

Questo video introduce prima i principi fondamentali alla base della riprogrammazione cellulare, e poi dimostra un protocollo per la generazione di iPSC da fibroblasti embrionali di topo differenziati. Infine, discuterà diversi esperimenti in cui gli scienziati stanno migliorando o applicando tecniche di generazione iPSC.

Procedure

Le cellule staminali pluripotenti indotte, come le cellule staminali embrionali umane, possono differenziarsi in quasi tutte le cellule del corpo e quindi sono molto promettenti nel campo della medicina rigenerativa.

Le cellule staminali embrionali umane, o hESC, sono ottenute da embrioni preimpianto, mentre le cellule somatiche completamente differenziate vengono utilizzate per generare cellule staminali pluripotenti indotte, che sono anche denominate iPSC.

In questo video, imparerai a conoscere i principi di base alla base della generazione di iPSC, un protocollo passo-passo per indurre la pluripotenza nelle cellule differenziate e alcune delle molte applicazioni e modifiche a valle di questo protocollo.

Iniziamo discutendo i principi alla base della generazione di iPSC da tipi di cellule somatiche.

Le cellule differenziate, come le cellule della pelle o i neuroni, sono quelle il cui destino è deciso. Si impegnano a svolgere una particolare funzione. D’altra parte, le cellule staminali pluripotenti sono quelle il cui destino è indeciso e possono differenziarsi in qualsiasi tipo di cellula.

Il processo di cambiamento dell’identità di una cellula già differenziata in uno stato pluripotente è chiamato riprogrammazione cellulare. Ciò comporta la modifica del modello di espressione genica nella cellula, perché il numero e i tipi di proteine prodotte da una cellula svolgono un ruolo importante nella definizione dell’identità di una cellula.

Uno dei modi per indurre la riprogrammazione cellulare è indurre l’espressione di alcuni fattori di trascrizione. I fattori di trascrizione sono proteine che si legano a sequenze regolatorie all’interno di un gene. Alcune di queste sequenze sono chiamate “promotori” e quindi promuovono la trascrizione di un gene. Alcuni fattori di trascrizione possono influenzare l’espressione di numerosi geni, il che ha un enorme impatto sull’identità cellulare.

I quattro fattori di trascrizione classici che hanno dimostrato di indurre la pluripotenza sono Oct4, Sox2, cMyc e Klf4. Questi fattori sono anche noti come fattori Yamanaka, dal nome del ricercatore che ha scoperto i loro effetti di riprogrammazione.

Più metodi possono essere utilizzati per indurre l’espressione di questi fattori di trascrizione. Il metodo più comune ed efficiente è l’uso di un virus modificato per fornire i geni del fattore di trascrizione nel nucleo, dove si integreranno nel genoma.

In questo metodo, i geni che codificano per i quattro fattori Yamanaka sono confezionati individualmente in diversi retrovirus e aggiunti a cellule differenziate. Quando le cellule sono esposte a virus modificati, una piccola frazione di cellule differenziate viene infettata da tutti e quattro i virus che trasportano il fattore di trascrizione. Iniziano a dedifferenziarsi fino a formare grandi gruppi sferici di cellule staminali pluripotenti. La formazione di cluster aiuta le iPSC a creare un microambiente simile alle cellule staminali in vivo e quindi ad aiutarle a mantenere la loro pluripotenza.

Dal momento che ora comprendi i principi di base alla base della generazione di iPSC, passiamo attraverso un protocollo generale per indurre la pluripotenza nei fibroblasti embrionali di topo, o MEF, utilizzando un sistema di trasduzione virale.

Prima di iniziare questa procedura, si noti che i virus possono infettare le cellule del corpo, quindi seguire le linee guida di sicurezza è estremamente importante.

Per iniziare il processo di trasfezione, il terreno di coltura viene rimosso da una piastra contenente un’alta densità di MEF e le cellule vengono lavate con una soluzione tampone. Successivamente, viene aggiunta una soluzione contenente un enzima che degrada le proteine, come la tripsina, per sollevare le cellule dal fondo del piatto. Il terreno di coltura viene quindi aggiunto alla piastra e le cellule staccate vengono trasferite in un tubo centrifugo.

Dopo la centrifugazione, il pellet viene ri-sospeso nel terreno di coltura. Successivamente, le cellule vengono contate e la concentrazione viene regolata in modo che un numero ottimale di cellule possa essere infettato dal virus il giorno successivo. Incubare le cellule durante la notte.

Dopo che le cellule si sono depositate sul loro nuovo piatto, i vecchi media vengono sostituiti da mezzi freschi e i virus ingegnerizzati contenenti i fattori di trascrizione desiderati vengono aggiunti alla piastra. Le cellule vengono quindi incubate con i virus per un tempo sufficiente a consentire l’infezione. Dopo l’incubazione, il mezzo contenente virus liberi viene rimosso e sostituito con un mezzo di cellule staminali embrionali fresche.

Per 2-3 settimane dopo la trasformazione, le cellule devono essere coltivate a 37° in un incubatore e i mezzi di coltura devono essere sostituiti quotidianamente.

Dopo questo periodo di tempo, le colonie di iPSC che sembrano simili alle colonie di cellule staminali embrionali dovrebbero diventare abbastanza grandi da essere raccolte. Le colonie possono essere trasferite in un piatto fresco contenente terreno con fattori di crescita appropriati e lasciate crescere ulteriormente. Al fine di confermare la pluripotenza, una parte della popolazione cellulare è macchiata con marcatori di pluripotenza.

Ora che hai visto come generare iPSC da celle differenziate, diamo un’occhiata ad alcune applicazioni a valle e modifiche di questo metodo molto utile.

Una caratteristica importante delle iPSC è che possono essere utilizzate per generare quasi tutte le cellule del corpo. Questo esempio mostra la generazione di cellule del muscolo cardiaco, chiamate cardiomiociti, da iPSC. Per fare ciò, le iPSC vengono trasferite in placche non aderenti che consentono loro di formare corpi embrioidi, che sono aggregati di cellule staminali pluripotenti. I corpi embrioidi vengono coltivati in un mezzo specializzato contenente siero e acido ascorbico, che migliora la differenziazione cardiaca. La differenziazione di successo può essere facilmente osservata quando alcune cellule iniziano a battere.

Poiché le iPSC possono potenzialmente differenziarsi in qualsiasi tipo di cellula, possono anche formare un intero organismo, come un topo. Questo può essere fatto usando un test chiamato complementazione tetraploide. In primo luogo, un embrione tetraploide, un embrione contenente quattro serie di cromosomi, si forma fondendo insieme due cellule di un embrione precoce utilizzando un campo elettrico. L’embrione tetraploide è autorizzato a svilupparsi allo stadio di blastocisti. Le iPSC vengono quindi iniettate nella blastocisti, che viene poi trapiantata in una femmina ricevente per la gestazione. Le cellule tetraploidi sono in grado di formare solo strutture extraembrionali come la placenta, quindi gli animali risultanti da questo metodo sono derivati interamente dalle iPSC.

Alcuni ricercatori modificano la procedura di riprogrammazione per rendere più efficiente il processo di identificazione delle cellule riprogrammate con successo. Ad esempio, in questo esperimento i MEF con la capacità di esprimere proteine fluorescenti verdi sotto l’influenza del promotore Oct4 hanno aiutato i ricercatori a identificare facilmente le cellule che hanno acquisito pluripotenza.

Hai appena visto il video di JoVE sulla generazione di cellule staminali pluripotenti indotte. Questo video ha esaminato i principi alla base di questa procedura e un protocollo passo-passo per generare iPSC da cellule differenziate. Abbiamo anche esaminato come questo metodo potrebbe essere applicato o modificato per esperimenti in laboratorio.

La scoperta delle iPSC ha avuto un enorme impatto sul campo della biologia delle cellule staminali, poiché ha un enorme potenziale per lo sviluppo di terapie che possono essere impiegate per trattare i disturbi degenerativi. Sebbene siano stati fatti molti progressi con le iPSC, l’ostacolo che deve ancora essere superato è il rischio associato di cancro. Le attuali procedure di riprogrammazione hanno il potenziale per provocare una crescita cellulare non regolata che può provocare il cancro. Pertanto, sono necessarie ulteriori ricerche per utilizzare effettivamente le iPSC clinicamente. Come sempre, grazie per aver guardato!

Transcript

Induced pluripotent stem cells, like human embryonic stem cells, can differentiate into almost any cell in the body, and therefore hold great promise in the field of regenerative medicine.

Human embryonic stem cells, or hESCs, are obtained from pre-implantation embryos, whereas fully differentiated somatic cells are used to generate induced pluripotent stem cells, which are also referred to as iPSCs.

In this video, you are going to learn about the basic principles behind generating iPSCs, a step-by-step protocol to induce pluripotency in differentiated cells, and some of the many downstream applications and modifications of this protocol.

Let’s begin by discussing the principles behind generation of iPSCs from somatic cell types.

Differentiated cells, like skin cells or neurons, are the ones whose fate is decided. They are committed to perform a particular function. On the other hand, pluripotent stem cells are the ones whose fate is undecided, and they can differentiate into any type of cell.

The process of changing the identity of an already differentiated cell to a pluripotent state is termed cellular reprogramming. This involves changing the pattern of gene expression in the cell, because the number and types of proteins produced by a cell play a major role in defining a cell’s identity.

One of the ways to induce cellular reprogramming is by inducing the expression of certain transcription factors. Transcription factors are proteins that bind to regulatory sequences within a gene. Some of these sequences are called “promoters,” and therefore promote transcription of a gene. A few transcription factors can influence the expression of numerous genes, which has a huge impact on cell identity.

The four classical transcription factors that have been demonstrated to induce pluripotency are Oct4, Sox2, cMyc, and Klf4. These factors are also known as Yamanaka factors, after the researcher who discovered their reprogramming effects.

Multiple methods can be used to induce expression of these transcription factors. The most common and efficient method is the use of a modified virus to deliver the transcription factor genes into the nucleus, where they will integrate into the genome.

In this method, the genes encoding the four Yamanaka factors are individually packaged into different retroviruses and added to differentiated cells. When the cells are exposed to modified viruses, a small fraction of differentiated cells become infected with all four transcription factor-carrying viruses. They begin to dedifferentiate until large spherical clusters of pluripotent stem cells are formed. The cluster formation helps iPSCs to create a microenvironment that is similar to in vivo stem cells, and therefore assist them in maintaining their pluripotency.

Since you now understand the basic principles behind the generation of iPSCs, let’s go through a general protocol for inducing pluripotency in mouse embryonic fibroblasts, or MEFs, using a viral transduction system.

Before starting this procedure, note that viruses can infect the cells in your body, so following safety guidelines is extremely important.

To begin the transfection process, the culture medium is removed from a plate containing a high density of MEFs, and the cells are washed with buffer solution. Next, a solution containing a protein-degrading enzyme, like trypsin, is added to lift the cells from the bottom of the dish. Culture medium is then added to the plate, and the detached cells are transferred to a centrifuge tube.

Following centrifugation, the pellet is re-suspended in the culture medium. Next, the cells are counted and the concentration is adjusted so that an optimal number of cells can be infected with virus the next day. Incubate the cells overnight.

After the cells have settled onto their new dish, old media is replaced by fresh media, and engineered viruses containing the desired transcription factors are added to the plate. The cells are then incubated with the viruses for sufficient time to allow infection to take place. After incubation, the medium containing free viruses is removed and replaced with fresh embryonic stem cell medium.

For 2-3 weeks following transformation, the cells should be grown at 37° in an incubator, and the culture media should be replaced daily.

After this time period, iPSC colonies that look similar to embryonic stem cell colonies should become large enough to be picked up. The colonies can be transferred to a fresh plate containing medium with appropriate growth factors, and allowed to grow further. In order to confirm pluripotency, a portion of the cell population is stained with pluripotency markers.

Now that you’ve seen how to generate iPSCs from differentiated cells, let’s look at some downstream applications and modifications of this highly useful method.

An important feature of iPSCs is that they can be used to generate almost any cell in the body. This example shows generation of heart muscle cells, called cardiomyocytes, from iPSCs. In order to do that, the iPSCs are transferred to non-adherent plates that allow them to form embryoid bodies, which are aggregates of pluripotent stem cells. The embryoid bodies are cultured in specialized medium containing serum and ascorbic acid, which enhances cardiac differentiation. Successful differentiation can be easily observed when some cells start to beat.

Since iPSCs can potentially differentiate into any cell type, they can also form an entire organism, like a mouse. This can be done using an assay called tetraploid complementation. First, a tetraploid embryo, an embryo containing four sets of chromosomes, is formed by fusing two cells of an early embryo together using an electric field. The tetraploid embryo is allowed to develop to the blastocyst stage. iPSCs are then injected into the blastocyst, which is then transplanted into a recipient female for gestation. The tetraploid cells are only able to form extraembryonic structures like the placenta, so animals resulting from this method are derived entirely from iPSCs.

Some researchers modify the reprogramming procedure to make the process of identifying successfully reprogrammed cells more efficient. For example, in this experiment MEFs with the ability to express green fluorescent protein under the influence of the Oct4 promoter helped researchers to easily identify cells that have acquired pluripotency.

You’ve just watched JoVE’s video on generating induced pluripotent stem cells. This video reviewed the principles behind this procedure, and a step-by-step protocol to generate iPSCs from differentiated cells. We also reviewed how this method could be applied or modified for in-lab experiments.

The discovery of iPSCs has had a huge impact on the field of stem cell biology, since it has an enormous potential for developing therapies that can be employed to treat degenerative disorders. Although much progress has been made with iPSCs, the hurdle that still needs to be crossed is the associated risk of cancer. The current reprogramming procedures have the potential to result in unregulated cell growth that may result in cancer. Therefore, more research is required to actually use iPSCs clinically. As always, thanks for watching!

Tags

Valore vuoto Problema