Name: Fluorescenza e bioluminescenza di subcellulare Ca 2+ In Aged neuroni dellippocampo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 24 s
Description: Scopri l'imaging di fluorescenza e bioluminescenza per studiare il calcio citosolico e mitocondriale in colture a lungo termine di neuroni ippocampali di ratto. Questa tecnica aiuta a comprendere il rimodellamento del calcio nell'invecchiamento neuronale.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato sostenuto dal Ministero dell'Economìa y competitividad (BFU2012-37146) e dalla Junta de Castilla y Leòn (BIO103/VA45/11, VA145U13 e BIO/VA33/13), Spagna. MCR è stato sostenuto dalla Junta de Castilla y Leòn (Spagna) e dal Fondo sociale europeo. Ringraziamo il compianto Dr. Philippe Brûlet (1947-2013) per il plasmide mitocondriale GFP Aequorin .

Etica Dichiarazione: procedure che coinvolgono soggetti animali sono stati trattati secondo protocolli approvati dalla struttura alloggiativa animale Valladolid University in accordo con la Convenzione europea 123 / Consiglio d&#39;Europa e la direttiva 86/609 / CEE. 1. Breve e Lungo Periodo Cultura di ratto neuroni dell&#39;ippocampo <ol><li> Preparazione di poli-D-lisina rivestito, 12 coprioggetto mm vetro. <ol><li> Sterilizzare 12 mm di diametro vetrini in etanolo per almeno 24 ore. Lasciarli asciugare in condizioni sterili. </li><li> Distribuire i coprioggetti su una striscia di parafilm in una capsula di Petri. Coprire la superficie di ogni coprioggetto con 200 ml di 1 mg / ml di poli-D-lisina. Consenti il ​​trattamento O / N. </li><li> Il giorno dopo, lavare i coprioggetti con doppio acqua sterile distillata ogni 15 minuti per 90 minuti in condizioni di sterilità. </li><li> Riempire un piatto a quattro ben multidish con 500 ml di Neurobasal cultura medio per pozzetto. Neurobasal cultura medio dovrebbe essere integrata conSiero fetale bovino 10%, 2% B27, 1 mg / ml di gentamicina e 2 mM L-glutammina. </li><li> Mettere i coprioggetti nella piastra multidish. Mantenerli in un umidificata 37 ° C e 5% di CO 2 incubatore fino al momento dell&#39;uso. </li></ol></li><li> Isolamento di neuroni dell&#39;ippocampo di ratti neonati. <ol><li> Preparare 1,8 ml di soluzione di papaina (direttamente acquistato) in un flaconcino (20 ml / ml) in condizioni sterili: Per ottenere una concentrazione finale di 20 ml / ml aggiungere circa 40 microlitri papaina in 1,8 ml di Hank di più il 0,6% di BSA (ml devono essere calcolate a seconda delle condizioni del fornitore). Hank 0,6% BSA viene preparato miscelando 85 ml di HBSS media con 15 ml di albumina sierica bovina 4% (BSA, preparata risolvendo 4 g di BSA in 100 ml HBSS). Preparare in una cappa sterile. </li><li> Incubare la papaina in Hank più 0,6% BSA per 30 min a 37 ° C prima dell&#39;uso. Filtrare la soluzione con un filtro da 0,22 micron prima dell&#39;uso. </li><li> Preparare F-12 di media di Ham con l&#39;aggiunta di DulbeccoModificato Media polvere dell&#39;Aquila (13,5 g per l) in 900 ml di acqua distillata sterile doppio. Quindi aggiungere 6 g HEPES e 336 mg NaHCO3 e regolare il pH a 7,42 con NaOH 4 N. Aggiungere acqua sterile per ottenere una soluzione 1 L e filtrata utilizzando un polietersulfone 0.20 micron (PES) bottiglia filtro superiore. Portare questo processo in una cappa sterile. Infine saturare la soluzione con CO 2 in condizioni sterili prima dell&#39;uso. Soluzioni Conservare a 4 ° C e usarli refrigerata. </li><li> Eutanasia neonato (P0) cuccioli di ratto per decapitazione e lavare la testa in sterili medio HBS. Aprire il cranio con l&#39;aiuto di forbici sterili. Estrarre il cervello con una spatola e lavare rapidamente in F-12 di media di Ham. </li><li> Effettuare un taglio diagonale con l&#39;aiuto di un bisturi in ciascun emisfero (Figura 1B), e portarlo ad una piastra di Petri contenente F-12 di Ham medie. </li><li> Meningi Scartare con attenzione con l&#39;aiuto di pinze dissezione e sotto una lente di ingrandimento. </li> &lt;li&gt; Identificare l&#39;ippocampo in un luogo caratteristico concava sulla corteccia con lente di ingrandimento. Poi, separare l&#39;ippocampo dalla corteccia tirando con attenzione di una frontiera e la rimozione dalla sua posizione con le forbici occhi. </li><li> Trasferire il tessuto dell&#39;ippocampo ad una piastra di 4 ben riempita con mezzo sterile di Hank priva di Ca 2+ e Mg 2+ più dello 0,6% di BSA e lavare il tessuto dell&#39;ippocampo. Senza rimuovere i mezzi di taglio del tessuto in piccoli pezzi (circa 2 x 2 mm) utilizzando le stesse forbici occhio. </li><li> Trasferimento pezzi di ippocampo di un flaconcino contenente 1,8 ml di soluzione di papaina pre-filtrata. Poi li incubare a 37 ° C, con occasionale, agitando delicatamente. 15 minuti più tardi, aggiungere 90 ml di soluzione di DNasi I (50 mg / ml finale) e incubare per 15 minuti supplementari. </li><li> Trasferire il tessuto in una provetta da centrifuga da 10 ml e lavare i frammenti con fresco Neurobasal Cultura Media. Ottenere sospensione cellulare passando frammenti di tessuto attraverso una plastica pip 5 mlette. </li><li> Sospensione cellulare a 160 xg Centrifugare per 5 min. Rimuovere il surnatante con una pipetta Pasteur di plastica sterile e sospendere accuratamente pellet con 1 ml automatizzati pipetta in 1 ml di terreno di coltura Neurobasal. </li><li> Misurare la densità cellulare utilizzando una camera di conteggio Neubauer. Mettere il vetrino di vetro sopra la camera di Neubauer. Aggiungere 10 ml di sospensione cellulare. Assicurarsi che la sospensione cellulare entra in modo uniforme e senza fare bolle camera. Contare il numero di cellule al microscopio ed eseguire calcoli corrispondenti per ottenere una goccia adatto di 40-80 ml ​​contenente 30 x 10 3 cellule. Il numero totale di cellule dipenderà dal numero di animali utilizzati. </li></ol></li><li> A breve termine e la cultura a lungo termine dei neuroni dell&#39;ippocampo di ratto. <ol><li> Sul piatto quattro ben multidish contenente 500 ml di Neurobasal cultura medio preparato prima e conservati in incubatrice, piastra di circa 30 x 10 3 cellule in una goccia di circa 50 microlitri per ognipozzetto della piastra multidish contenente un poli-D-lisina rivestite, 12 mm coprioggetto di vetro di diametro. </li><li> Mantenere cellule dell&#39;ippocampo primarie in un umidificata 37 ° C e 5% di CO 2 incubatore per 2-5 giorni in vitro (DIV, a breve termine, i giovani culture) o&gt; 15 DIV (a lungo termine, di età compresa tra culture) prima di esperimenti senza cambiare la cultura media. </li></ol></li></ol> 2. imaging di fluorescenza della Ca citosolico 2 + Concentrazione <ol><li> Preparazione delle soluzioni di prova per l&#39;imaging di fluorescenza. <ol><li> Preparare una soluzione esterna salina HEPES-buffered (HBS) contenente, in mM: NaCl 145, KCl 5, MgCl 2 1, CaCl 2 1, il glucosio 10, sodio-HEPES 10 (pH 7.42). </li><li> Preparare una soluzione esterna, Mg 2 + -free, salino HEPES-buffered (HBS) contenente, in mM: NaCl 146, KCl 5, CaCl 2 1, il glucosio 10 e HEPES 10 (pH 7.42). </li><li> Risolvere salina NMDA in Mg 2 + -free, HEPES-buffered (HBS) ad una finaconcentrazione l di 100 micron e integrare con 10 mM glicina. </li><li> Preparare una soluzione contenente KCl HBS invece di NaCl risolvendo (in mM): 145 KCl, MgCl 2 1, CaCl 2 1, glucosio 10 e 10 HEPES (pH 7.42). </li></ol></li><li> Caricamento di cellule dell&#39;ippocampo con sonda fluorescente calcio fura2 / AM. <ol><li> Prendere la coltura cellulare contenente lamelle via l&#39;incubatore e lavarli con HBS media a temperatura ambiente per il conferimento ad una nuova piastra multidish quattro pozzetti contenenti 500 ml di HBS per pozzetto. </li><li> Incubare le cellule con fura2 / AM 4 micron (preparati nello stesso mezzo HBS) per 60 minuti a temperatura ambiente (25 ° C) in un luogo buio. </li><li> Dopo 60 minuti, lavare coprioggetto con fresco medio HBS. </li></ol></li><li> Registrazione di immagini di fluorescenza di citosolico [Ca 2+] in cellule in coltura. <ol><li> Accendere la lampada, microscopio, sistema di perfusione, fotocamera fluorescenza e computer. </li><li> Mettere i coprioggetti in una piattaforma per termostatatoaperto 12 coprioggetto mm di vetro sul palco del microscopio invertito e selezionare un campo microscopico utilizzando un obiettivo 40X (olio, NA: 1.3). Profumato cellule continuamente con pre-riscaldato (37 ° C) HBS medie assenza o presenza di sostanze di prova. Mantenere il flusso ad una velocità di circa 5-10 ml / min. Nota: sistema di perfusione delle cellule per cellule viventi è montato in una piattaforma per termostatato aperta 12 coprioggetto mm vetro. 8 linee di sistema perfusione gravità-driven dotati di posizionatore viene utilizzato per perfusione soluzioni. Pompa da vuoto è responsabile per la rimozione di ogni eccesso. Le soluzioni vengono riscaldati mediante un sistema di riscaldamento a tubo. </li><li> Acquisire un&#39;immagine di sfondo con l&#39;otturatore chiuso ad entrambe le lunghezze d&#39;onda di eccitazione. </li><li> Epi-illuminare le cellule alternativamente a 340 e 380 nm. Luce Record emessa a 520 nm ogni 5-10 sec con una telecamera a fluorescenza, che viene filtrato da un specchio dicroico fura-2. </li><li> Quando il periodo di registrazione è terminata, memorizzare la sequenza completa oimmagini f emessi a 520 nm nel computer per ulteriori analisi. </li></ol></li><li> Analisi di immagini fluorescenti registrate. <ol><li> Aprire il file esperimento. Utilizzando il software aquacosmos, clicca su &#39;Rapporto&#39; e selezionare l&#39;intervallo rapporto desiderato. Calcolare il rapporto di pixel per pixel nelle immagini risultanti per ottenere una sequenza di immagini di rapporto. </li><li> Sottrarre sfondo regolando l&#39;&#39;eliminazione sfondo&#39;. Premere &#39;calcolo start&#39;. </li><li> Premere &#39;ogni momento sequenza&#39; pulsante e cancellare le antiche regioni di interesse (ROI). Per l&#39;analisi quantitativa delle singole cellule, stabilire nuove regioni di interesse o ROI corrispondenti ai singoli neuroni. Media tutti i valori del rapporto di ciascun pixel corrispondenti a ciascun ROI e ogni immagine per ottenere una registrazione di valori di fluorescenza di rapporto per i singoli ROI (celle). </li><li> Per rappresentare graficamente le singole registrazioni esportare i valori di rapporto di fluorescenza corrispondenti ad ogni ROI un progr graficaam. </li><li> Effettuare i calcoli corrispondenti per stimare la dimensione degli aumenti in rapporto fluorescenze in risposta a ciascuna stimolazione utilizzando un&#39;analisi dei dati adatto e grafici software. </li></ol></li></ol> 3. bioluminescenza Imaging di mitocondriale Ca 2+ Concentrazione <ol><li> La trasfezione di neuroni dell&#39;ippocampo in coltura con il plasmide mitGAmut. NOTA: Le cellule vengono prima trasfettate con il plasmide mitGAmut contenente una sequenza mitocondri mirati e un aequorina mutata priva di un sito di legame di Ca 2+ fusa alla proteina verde fluorescente (GFP). Questa costruzione rileva grandi aumenti in mitocondriale Ca 2+ assorbimento e permette l&#39;identificazione di cellule trasfettate da fluorescenza GFP. Il plasmide è stato sviluppato e gentilmente fornito da P. Brulet e collaboratori 18 (CNRS, Parigi). <ol><li> Preparare Neurobasal TF, contenente Neurobasal Cultura Media, privo siero fetale bovino, B27, gentamice 2 mM L-glutammina. </li><li> Preparare 50 ml di Neurobasal TF oltre 2,5 ml di reagente di trasfezione in un flaconcino (soluzione A). Preparare 50 ml di Neurobasal TF più 4 mg mitGAmut plasmide in un flaconcino (soluzione B). Aggiungere delicatamente soluzione B sopra soluzione A. Consentire miscelazione durante 20 minuti, senza agitare. </li><li> Trasferire i coprioggetti contenenti neuroni dell&#39;ippocampo a nuove piastre multidish contenenti 200 ml di Neurobasal fresco TF. </li><li> Aggiungere goccia a goccia 100 ml di soluzione A + B su ogni vetrino. Incubare per 30 min. Rimuovere il supporto. Lavare una volta cellule con Neurobasal fresco TF. Ritorna i coprioggetti all&#39;originale Neurobasal Cultura Media. </li><li> Neuroni di coltura per altre 24 ore a 37 ° C e 5% di CO 2 dopo la trasfezione per consentire l&#39;espressione efficace e la destinazione della sonda. </li></ol></li><li> Preparazione delle soluzioni di prova per l&#39;imaging bioluminescenza. <ol><li> Preparare le soluzioni HBS contenenti NMDA 100 micron o 145 mM KCl comesopra (punto 2.1). Preparare la soluzione HBS contenente 10 mM Ca 2+ più digitonina 100 micron. </li></ol></li><li> Ricostituzione di equorina mitocondri mirati con coelenterazine n. <ol><li> Coprioggetto trasferimento contenenti neuroni dell&#39;ippocampo transfettate ad una piastra di quattro pozzetti contenenti 200 ml di HBS. </li><li> Aggiungere 4 ml di coelenterazine n (200 micron) per 200 ml di HBS per una concentrazione finale di 4 micron e mescolare delicatamente. Incubare per 2 ore a temperatura ambiente (25 ° C) e al buio. </li></ol></li><li> Registrazione di immagini bioluminescenza di mitocondriale [Ca 2+]. <ol><li> Accendere il microscopio, la lampada, il sistema di perfusione, fotocamera bioluminescenza e il computer. </li><li> Trasferimento coprioggetti ricostituiti per un termostatato (37 ° C) camera di perfusione e profumato continuamente con soluzione pre-riscaldato HBS ad una velocità di 5-10 ml / min. </li><li> Utilizzando un obiettivo 40X (olio, NA: 1.3), selezionare un campo microscopico che contiene le cellule che esprimono l&#39;unapoaequorins come dimostrano emissione di fluorescenza associata con l&#39;espressione di proteine ​​verde fluorescente (GFP) usando i filtri FITC. Un tipico campo può contenere 1-2 cellule transfettate. Acquisire l&#39;immagine fluorescenza GFP, utilizzando una camera CCD. </li><li> Spegnere la luce microscopio. Rimuovere la scatola-dicroico contenente situato nella via luce. Spegnere la luce di eccitazione e chiudere al buio-box per la completa oscurità. </li><li> Profumato cellule a 5-10 ml / min con HBS medie, con o senza soluzioni di test pre-riscaldato a 37 ° C. </li><li> Cattura immagini emissioni fotoniche ogni 10 sec con una macchina fotografica conteggio di fotoni maneggiato con un processore di immagine. </li><li> Al termine di ogni esperimento, permeabilize cellule con 0,1 mM digitonina in 10 mM CaCl 2 in HBS per liberare tutti i rimanenti emissioni fotonici. Nota: Queste emissioni fotoniche devono essere sommati al fine di stimare le emissioni totali fotonici, un valore richiesto per la calibrazione di Ca 2+ concentrazioni &lt;./ li&gt; <li> Conservare immagini bioluminescenza nel computer l&#39;immagine di fluorescenza GFP associata con catturati prima di imaging conteggio dei fotoni. </li></ol></li><li> Analisi di immagini bioluminescenza riflettono mitocondriale [Ca 2+]. <ol><li> Quantificare le emissioni fotoniche utilizzo di software specifici. Emissioni fotonici possono essere convertiti mitocondriale Ca 2+ libera concentrazione ([Ca 2+] mit) utilizzando l&#39;algoritmo descritto da Brini et al. 15. </li><li> Aprire l&#39;immagine fluorescenza GFP esperimento e. Seleziona regioni di interesse (ROI) con l&#39;ausilio di software specifici disegnando la forma delle cellule trasfettate secondo le immagini di fluorescenza catturate all&#39;inizio dell&#39;esperimento. </li><li> Incollare le stesse ROI su ogni immagine. Totale emissioni fotoniche in ogni ROI sono calcolate con un software specifico per ottenere il valore di emissione di luminescenza (L) per ogni cella in ciascun punto nel tempo. </li><li> Sommate tutte le emiss fotonicaioni nelle immagini bioluminescenza, compresi quelli ottenuti dopo digitonina permeabilizzazione, utilizzando il software specifico, per ottenere un&#39;immagine bioluminescenza contenente tutte le emissioni fotonici. </li><li> Valore delle esportazioni di emissioni fotonici per ogni regione di interesse per un software specifico per i calcoli. Per fare questo, fare clic su &#39;grafico&#39;, al fine di calcolare i valori bioluminescenza per ogni ROI in ogni momento. Seleziona &#39;valore totale&#39; e &#39;usare il ROI corrente a tutte le immagini. Premere &#39;Calcola&#39;. Salvare il &#39;txt.file&#39; ed esportare i dati di un foglio di lavoro. Per ogni ROI, [Ca 2+] mit è calcolato utilizzando il seguente algoritmo: [Ca 2+] (M) = [R + (R · K TR) - 1] / [K R - (R · K R)]; dove, R = [L / (totale λ L)] 1 / n L è la luminescenza emessa al momento della misurazione in ciascuna regione di interesse. L totale èla luminescenza totale rimanente dopo l&#39;aggiunta dei conteggi presenti nel tessuto in quel momento al momento della misurazione per ciascuna regione di interesse. λ, K TR, K e R n sono costanti i cui valori dipendono combinazione di equorina (wild type o mutato) e coelenterazin utilizzato (wild type o tipo n) e la temperatura 16 registrazione. Per la combinazione qui utilizzato (mutato AEQ e coelenterzine n), a 37 ° C, abbiamo utilizzato i seguenti valori: K R = 8.47 x 10 7, K TR = 165.6 x 10 3, n = 1.204 e λ = 0,138. </li></ol></li><li> Effettuare i calcoli corrispondenti per stimare la dimensione degli aumenti di bioluminescenza in risposta ad ogni stimolo utilizzando un&#39;analisi dei dati adatto e grafici software. </li></ol>

<ol><li>Sattler, R., Tymianski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+glutamate+receptor-mediated+excitotoxic+neuronal+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of glutamate receptor-mediated excitotoxic neuronal cell death.</a> Molecular Neurobiology. 24 (1-3), 107-129 (2001).</li>
<li>MacDermott, A. B., Mayer, M. L., Westbrook, G. L., Smith, S. J., Barker, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA-receptor+activation+increases+cytoplasmic+calcium+concentration+in+cultured+spinal+cord+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">NMDA-receptor activation increases cytoplasmic calcium concentration in cultured spinal cord neurones.</a> Nature. 321 (6069), 519-522 (1986).</li>
<li>Choi, D. W., Maulucci-Gedde, M., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+neurotoxicity+in+cortical+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Glutamate neurotoxicity in cortical cell culture.</a> The Journal of Neuroscience. 7 (2), 357-368 (1987).</li>
<li>Kure, S., Tominaga, T., Yoshimoto, T., Tada, K., Narisawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+triggers+internucleosomal+DNA+cleavage+in+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Glutamate triggers internucleosomal DNA cleavage in neuronal cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 179 (1), 39-45 (1991).</li>
<li>Calvo, M., Sanz-Blasco, S., Caballero, E., Villalobos, C., Nunez, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Susceptibility+to+excitotoxicity+in+aged+hippocampal+cultures+and+neuroprotection+by+non-steroidal+anti-inflammatory+drugs%3A+role+of+mitochondrial+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Susceptibility to excitotoxicity in aged hippocampal cultures and neuroprotection by non-steroidal anti-inflammatory drugs: role of mitochondrial calcium.</a> Journal of Neurochemistry. 132 (4), 403-417 (2015).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptor+subunits+have+differential+roles+in+mediating+excitotoxic+neuronal+death+both+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">NMDA receptor subunits have differential roles in mediating excitotoxic neuronal death both in vitro and in vivo.</a> The Journal of Neuroscience. 27 (11), 2846-2857 (2007).</li>
<li>Zhou, M., Baudry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+changes+in+NMDA+neurotoxicity+reflect+developmental+changes+in+subunit+composition+of+NMDA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Developmental changes in NMDA neurotoxicity reflect developmental changes in subunit composition of NMDA receptors.</a> The Journal of Neuroscience. 26 (11), 2956-2963 (2006).</li>
<li>Brewer, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+vulnerability+of+hippocampal+neurons+with+age+in+culture%3A+temporal+association+with+increases+in+NMDA+receptor+current%2C+NR2A+subunit+expression+and+recruitment+of+L-type+calcium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Increased vulnerability of hippocampal neurons with age in culture: temporal association with increases in NMDA receptor current, NR2A subunit expression and recruitment of L-type calcium channels.</a> Brain Research. 1151, 20-31 (2007).</li>
<li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signalling+remodelling+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Calcium signalling remodelling and disease.</a> Biochemical Society Transactions. 40 (2), 297-309 (2012).</li>
<li>Stout, A. K., Raphael, H. M., Kanterewicz, B. I., Klann, E., Reynolds, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate-induced+neuron+death+requires+mitochondrial+calcium+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Glutamate-induced neuron death requires mitochondrial calcium uptake.</a> Nature Neuroscience. 1 (5), 366-373 (1998).</li>
<li>Pivovarova, N. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitotoxic+calcium+overload+in+a+subpopulation+of+mitochondria+triggers+delayed+death+in+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Excitotoxic calcium overload in a subpopulation of mitochondria triggers delayed death in hippocampal neurons.</a> The Journal of Neuroscience. 24 (24), 5611-5622 (2004).</li>
<li>Morris, R. G., Garrud, P., Rawlins, J. N., O'Keefe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Place+navigation+impaired+in+rats+with+hippocampal+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Place navigation impaired in rats with hippocampal lesions.</a> Nature. 297 (5868), 681-683 (1982).</li>
<li>Geinisman, Y., Detoledo-Morrell, L., Morrell, F., Heller, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+markers+of+age-related+memory+dysfunction%3A+behavioral%2C+electrophysiological+and+morphological+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Hippocampal markers of age-related memory dysfunction: behavioral, electrophysiological and morphological perspectives.</a> Progress in Neurobiology. 45 (3), 223-252 (1995).</li>
<li>Sodero, A. O., Weissmann, C., Ledesma, M. D., Dotti, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+stress+from+excitatory+neurotransmission+contributes+to+cholesterol+loss+in+hippocampal+neurons+aging+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Aging%22%5BJournal%5D)">Cellular stress from excitatory neurotransmission contributes to cholesterol loss in hippocampal neurons aging in vitro.</a> Neurobiology of Aging. 32 (6), 1043-1053 (2011).</li>
<li>Brini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfected+aequorin+in+the+measurement+of+cytosolic+Ca2%2B+concentration+%28%5BCa2%2B%5Dc%29.+A+critical+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Transfected aequorin in the measurement of cytosolic Ca2+ concentration ([Ca2+]c). A critical evaluation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 270 (17), 9896-9903 (1995).</li>
<li>Villalobos, C., Alonso, M. T., Garcìa-Sancho, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+imaging+of+calcium+oscillations+inside+intracellular+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence imaging of calcium oscillations inside intracellular organelles.</a> Methods in Molecular Biology. 574, 203-214 (2009).</li>
<li>Villalobos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redistribution+of+Ca2%2B+among+cytosol+and+organella+during+stimulation+of+bovine+chromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Redistribution of Ca2+ among cytosol and organella during stimulation of bovine chromaffin cells.</a> FASEB Journal. 16, 343-353 (2002).</li>
<li>Rogers, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+local+Ca2%2B+dynamics+with+genetically+encoded+bioluminescent+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Visualization of local Ca2+ dynamics with genetically encoded bioluminescent reporters.</a> The European Journal of Neuroscience. 21 (3), 597-610 (2005).</li>
<li>Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+imaging+of+cortical+neurons+using+Fura-2+AM%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM.</a> Journal of Visualized Experiments. (23), 1067(2009).</li>
</ol>

Nessuno degli autori ha interessi in competizione o in conflitto.

La ristrutturazione di Ca 2+ intracellulare omeostasi nel cervello che invecchia è stata collegata alla perdita cognitiva, aumentata suscettibilità alle ischemico danni, eccitotossicità e neurodegenerazione. Per studiare questa ipotesi in vitro, le procedure di imaging Ca 2+ sono disponibili. Purtroppo, colture vitali di vecchi neuroni dell&#39;ippocampo non sono affidabili. Recentemente, è stato osservato che le culture a lungo termine di ratto hippocampal neuroni presenti molte delle car...

Eccitotossicità è uno dei meccanismi più importanti che contribuiscono a danno neuronale e la morte cellulare in insulti neurologici quali ischemia, e in alcune malattie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer 1. Questo tipo di neurotossicità è mediato principalmente da glutammato agisce su Ca 2+ -permeable, recettori ionotropici NMDA (NMDAR) 2. L&#39;esposizione di neuroni in coltura per il glutammato può portare a eccitotossicità 3, che provoca l&#39;apoptosi neuronale 4. Noi e altri abbiamo già riferito che la vulnerabilità neuronale all&#39;apoptosi NMDA indotta può cambiare con lo sviluppo in vitro e l&#39;invecchiamento 5-8. È ampiamente accettato che un aumento del libero citosolico Ca 2+ concentrazione ([Ca 2+] cyt) porta all&#39;attivazione cellule. Tuttavia, se questo aumento è troppo alta e / o di sostegno sufficientemente, può innescare la morte cellulare 9. Inoltre, è stato propostoeccitotossicità che richiede Ca 2+ mitocondriale assorbimento 10, poiché il trattamento con neuroni neuroni protette contro disaccoppiatore mitocondriale indotta da glutammato morte cellulare 11. Se mitocondri occupano troppo Ca 2+, l&#39;apertura del poro di transizione di permeabilità mitocondriale può verificarsi, che porta al rilascio del citocromo c ed altri fattori pro-apoptotica, e inducendo apoptosi. Abbiamo recentemente dimostrato che questo mitocondriale Ca 2+ assorbimento è direttamente correlata alla suscettibilità età-dipendente per eccitotossicità, misurando direttamente NMDA indotta mitocondriale Ca 2+ uptake in singoli neuroni ippocampali 5, un metodo che viene riportato in questo articolo. L&#39;ippocampo, coinvolto in processi fisiologici, come l&#39;apprendimento, la memoria e altri processi cognitivi 12, è altamente vulnerabile a invecchiamento e malattie neurodegenerative 13. E &#39;stato proposto che, dopo diverse settimane in vitro, coltaneuroni ippocampali mostrano una serie di caratteristiche tipiche di neuroni dai 14. Di conseguenza, colture di neuroni dell&#39;ippocampo a lungo termine possono fornire un modello globale per indagare Ca 2+ meccanismi mediata di una maggiore eccitotossicità nell&#39;invecchiamento. L&#39;obiettivo generale del metodo presentato è, quindi, di indagare i cambiamenti sostanziali nel intracellulare di Ca 2+ omeostasi o Ca 2+ rimodellamento nel cervello di invecchiamento tra cui il differenziale Ca 2+ risposte indotte da agonisti del recettore NMDA in una prospettiva a lungo termine colture di neuroni dell&#39;ippocampo . Il metodo comprende una descrizione dettagliata della cultura di neuroni ippocampali di ratto e il monitoraggio di citosolici e mitocondriali Ca 2+ concentrazioni da fluorescenza e l&#39;imaging bioluminescenza in singoli neuroni rispettivamente. Imaging di fluorescenza di citosoliche Ca 2+ in neuroni in coltura è una procedura standard. Tuttavia, questo metodo è meno affidabile per subcellulare Ca 2+ misure tra cui mitocondriale Ca 2+. Le ragioni di questa includono la mancanza di una corretta mirati sonde sintetiche e affinità inadeguato per Ca 2 + concentrazioni che possono cambiare nei mitocondri dal livello di micron basso anche per il livello di mm. L&#39;utilizzo di Ca 2+ sonde a base di proteine ​​come ad esempio equorina, ha permesso di organelli subcellulari di targeting e l&#39;utilizzo di derivati ​​diversi Ca 2+ affinità utilizzando diversi coelenterazines o sonde mutanti privi specifico Ca 2+ siti di legame 15. In questo modo, bioluminescenza di cellule che esprimono equorina mitocondri mirati può consentire il monitoraggio dei mitocondriali di Ca 2+ concentrazioni in singoli neuroni. Tuttavia, questa procedura può richiedere l&#39;uso di macchine fotografiche di conteggio di fotoni o telecamere CCD ultrasensibili per bioluminescenza 16-18. Questo metodo può produrre nuovi risultati che dovrebbero essere confermata in più establmodelli mentata invecchiamento del cervello come, ad esempio, fette di cervello da vecchi animali.

<table><tbody><tr><td>Terreno per coltura neurobasale</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>HBSS medio</td><td>Gibco</td><td>14170-088</td><td></td></tr><tr><td>Ham's F-12 medio</td><td>Gibco</td><td>31330-038</td><td></td></tr><tr><td>DNasi I (da pancreas bovino)</td><td>Sigma</td><td>D5025-15KU</td><td></td></tr><tr><td>Bobine fetali Siero</td><td>Lonza</td><td>DE14-801E</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco</td><td>15750</td><td></td></tr><tr><td>L-glutammina</td><td>Gibco</td><td>25030-032</td><td></td></tr><tr><td>vetrini coprioggetti in vetro da 12 mm</td><td>Labolan</td><td>0111520/20012</td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington</td><td>LS003127</td><td></td></tr><tr><td>placche multipiatto a 4 pozzetti</td><td>Nunc</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>Piastre Petry</td><td>JD Catalan s.l.</td><td>2120044T</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sterili</td><td>Fisher Scientific</td><td>431030</td><td></td></tr><tr><td>Fura2-AM</td><td>Life Technologies</td><td>F1201</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>Celenterazina n</td><td>Biotium</td><td>BT-10115-2250 uG</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma</td><td>D5628</td><td></td></tr><tr><td>NMDA</td><td>Sigma</td><td>M3262</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>50046</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axiovert S100 Microscopio TV</td><td>Carl Zeiss Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema di illuminazione Xcite</td><td>Telecamera a</td> fluorescenza EXFO <td></td><td></td></tr><tr><td>ORCA ER</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Telecamera CCD per conteggio fotoni VIM</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VC-8 Regolatore valvola</td><td>Warner Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SH-27B</td><td>Warner Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aquacosmos Software</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fluorescenza e bioluminescenza di subcellulare ca<sup&gt; 2+</sup&gt; in aged neuroni dell&#39;ippocampo

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Suscettibilità alla morte cellulare dei neuroni associati alla neurodegenerazione e ischemia sono estremamente aumentata nel cervello invecchiato ma meccanismi responsabili sono mal noti. Eccitotossicità, un processo che si ritiene di contribuire al danno dei neuroni indotta da entrambe le ingiurie, è mediata da attivazione dei recettori del glutammato che promuove Ca 2+ afflusso e mitocondriale sovraccarico di Ca 2+. Un cambiamento sostanziale intracellulare di Ca 2+ omeostasi o ristrutturazione di Ca2 + intracellulare omeostasi può favorire danno neuroni in vecchi neuroni. Per indagare Ca 2+ rimodellamento nell&#39;invecchiamento abbiamo usato l&#39;imaging cellulare dal vivo in colture a lungo termine di neuroni di ratto dell&#39;ippocampo che assomigliano per alcuni aspetti neuroni in vivo di età. Per questo fine, cellule dell&#39;ippocampo sono, in primo luogo, al momento disperso dalle nuove ippocampi di ratto nato e placcato su vetrini rivestiti, vetro poli-D-lisina. Poi culture sono tenuti in media controllati per diversi giorni o più weeks per indagare giovani e vecchi neuroni, rispettivamente. In secondo luogo, neuroni in coltura sono caricati con fura2 e sottoposti a misure di concentrazione citoplasmatica di Ca 2+ utilizzando digitale rapporto imaging di fluorescenza. In terzo luogo, neuroni in coltura sono trasfettate con plasmidi che esprimono un tandem di bassa affinità equorina e GFP mirata ai mitocondri. Dopo 24 ore, equorina all&#39;interno delle cellule viene ricostituito con coelenterazine e neuroni sono sottoposti ad immagini bioluminescenza per il monitoraggio della concentrazione di Ca2 + mitocondriale. Questa procedura in tre fasi permette di monitorare citosolica e mitocondriale Ca 2+ risposte agli stimoli rilevanti come ad esempio l&#39;agonista del recettore del glutammato NMDA e confronta se queste ed altre risposte sono influenzati da invecchiamento. Questa procedura può produrre nuove intuizioni su come l&#39;invecchiamento influenza citosolica e mitocondriale risposte Ca 2+ agli stimoli selezionati, nonché la sperimentazione di farmaci selezionati volti a prevenire cella neuronemorte in malattie legate all&#39;età.

Qui si descrive un metodo semplice per valutare Ca 2+ rimodellamento e gli effetti di NMDA sulla citosolica e mitocondriale [Ca 2+] nei neuroni età. La figura 1 mostra lo schema del procedimento per l&#39;isolamento e la coltura neuroni ippocampali di ratti neonati. Prima di iniziare, abbiamo bisogno di preparare sterili, rivestiti, vetrini poli-D-lisina e localizzarli in un piatto 4-bene. Poi, ratti neonati vengono uccisi e il cervello rimossi. Dopo aver isolato l&#39;ippocampo, i...

Il rimodellamento intracellulare del Ca2+ nell'invecchiamento può contribuire all'eccitotossicità e al danno neuronale, processi mediati dal sovraccarico di Ca2+. Abbiamo mirato a studiare il rimodellamento del Ca2+ nel cervello che invecchia utilizzando l'imaging a fluorescenza e bioluminescenza del Ca2+ citosolico e mitocondriale in colture a lungo termine di neuroni ippocampali di ratto, un modello di invecchiamento neuronale.

Fluorescenza e bioluminescenza di subcellulare Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; In Aged neuroni dell&#39;ippocampo

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare il rimodellamento del calcio nel cervello invecchiato mediante imaging a fluorescenza e bioluminescenza del calcio citosolico e mitocondriale in colture a lungo termine di neuroni ippocampali di ratto, considerate un modello di invecchiamento neuronale. Questo metodo può contribuire a comprendere questioni fondamentali nel campo dell'invecchiamento, come il modo in cui il rimodellamento del calcio intracellulare contribuisce all'eccitotossicità e al danno neuronale, entrambi correlati al sovraccarico di calcio. Il principale vantaggio di questa tecnica è la possibilità di seguire da vicino il rimodellamento del calcio in singoli neuroni, utilizzando colture a diversi giorni in vitro (DIV), a partire dallo stesso campione. La duplicazione di questa tecnica potrebbe derivare in nuove terapie per ictus o malattie neurodegenerative, poiché rappresenta un potenziale bersaglio innovativo legato al sovraccarico di calcio in queste patologie correlate all'età.Dopo aver visto questo video, Gesù avrà una buona comprensione di come eseguire l'imaging di fluorescenza e di reminiscenza del calcio citosolico e mitocondriale in colture di neuroni ippocampali di ratto a breve e lungo termine. Per iniziare questa procedura, distribuire i coprioggetti su una striscia di paraform in una piastra di Petri. Quindi applicare 200 microlitri di poli-D-lisina a un milligrammo per millilitro su ciascun coprioggetto e lasciare in trattamento tutta la notte.Il giorno successivo, lavare le coprioggetti con acqua sterile doppiamente distillata ogni 15 minuti per 90 minuti in condizioni sterili. Posizionare le coprioggetti nella piastra multipla e mantenerle in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius e 5%CO2 fino all'uso. Per isolare i neuroni ippocampali, aprire il cranio dei ratto nati da poco con forbici sterili, estrarre il cervello con una spatola e lavarlo rapidamente in mezzo Ham's F12.Eseguire quindi un taglio diagonale con il bisturi in ciascun emisfero e trasferirlo nella piastra di Petri contenente mezzo Hams F12 sotto il microscopio. Scartare le meningi. Identificare con attenzione l'ippocampo in una posizione concava caratteristica sopra la corteccia.Quindi separare l'ippocampo dalla corteccia staccandolo con attenzione e rimuovendolo con forbici da occhiale. Successivamente, trasferire i frammenti di ippocampo in un vial contenente 1,8 millilitri di soluzione di pepane prefiltrata. Incubare a 37 gradi Celsius con lievi agitazioni occasionali per 15 minuti.Quindi aggiungere 90 microlitri di soluzione DNA one. Aggiungere 50 microgrammi per millilitro e incubare per altri 15 minuti. Successivamente, trasferire il tessuto in un tubo da centrifuga da 10 millilitri e lavare i frammenti con mezzo di coltura neurobasale fresco.Ottenere una sospensione cellulare facendo passare i frammenti di tessuto attraverso una pipetta di plastica da cinque millilitri. Successivamente, centrifugare la sospensione cellulare a 160 G per cinque minuti. Dopodiché, rimuovere il soprannatante utilizzando una pipetta Pasteur sterile di plastica e sospendere delicatamente il pellet in un millilitro di mezzo di coltura neurobasale mediante una pipetta automatica da un millilitro.Successivamente, misurare la densità cellulare utilizzando una camera di conteggio di Neubauer. Aggiungere 10 microlitri di sospensione cellulare e contare il numero di cellule al microscopio. Quindi effettuare i calcoli corrispondenti per ottenere da 40 a 80 microlitri di sospensione cellulare, contenente circa 30.000 cellule.Nella piastra a quattro pozzetti contenente 500 microlitri di mezzo neurobasale, si seminano circa 30.000 cellule in ciascun pozzetto contenente coprivetri di vetro. Mantenere le cellule nell'incubatrice da due a cinque giorni in vitro per neuroni giovani o per più di 15 giorni in vitro per neuroni maturi. In questo procedimento, incubare le cellule con meno 2:00 AM per 60 minuti a temperatura ambiente al buio.Quindi trasferire i coprioggetti alla camera di perfusione. Successivamente, posizionare la camera di perfusione con il coprioggetto nel supporto del microscopio invertito. Selezionare il campo microscopico e perfondere continuamente le cellule con HBS preriscaldato.Successivamente, illuminare le cellule a 340 e 380 nanometri. Alternatamente, registrare poi la luce emessa a 520 nanometri ogni cinque-dieci secondi mediante una telecamera a fluorescenza, filtrata da uno specchio dicotomico fira due diic. Per analizzare le immagini fluorescenti registrate, aprire innanzitutto il file dell'esperimento utilizzando il software Aqua Cosmos, fare clic su rapporto (ratio) e selezionare l'intervallo di rapporto desiderato.Calcolare il rapporto pixel per pixel nelle immagini risultanti al fine di ottenere una sequenza di immagini di rapporto. Successivamente, sottrarre il fondo regolando il pulsante di eliminazione del fondo. Dopodiché, premere il pulsante di avvio del calcolo.Successivamente, premere il pulsante di tutta la sequenza temporale e cancellare le ROI precedenti per l'analisi quantitativa delle singole cellule. Stabilire nuove ROI o le ROI corrispondenti ai singoli neuroni. Per tracciare le registrazioni individuali, esportare i valori del rapporto di fluorescenza corrispondenti a ciascuna ROI al programma Origin lab facendo clic su grafico.Quindi fare clic su calcola e salvare il file TXT. Successivamente, effettuare il calcolo corrispondente per stimare l'entità dell'aumento del rapporto di fluorescenza in risposta a ciascuna stimolazione per trasfettare neuroni coltivati con il plasmide mutante MIT. Per prima cosa, preparare 50 microlitri di soluzione A contenente il reagente di trasfezione in un flaconcino.Successivamente, preparare 50 microlitri di soluzione B contenente il plasmide MIT ute in un vial. Aggiungere la soluzione B alla soluzione A e incubare per 20 minuti. Successivamente, trasferire i coverslip contenenti neuroni dell'ippocampo in nuove piastre multiple contenenti 200 microlitri di neuro basal TF fresco. Quindi aggiungere 100 microlitri della soluzione A e B, goccia a goccia, su ciascun coverslip e incubare per 30 minuti.Dopo 30 minuti, rimuovere il mezzo. Lavare le cellule con neuro basal tf fresco. Quindi reinserire le lamelle nel mezzo di coltura neuro basal originale e coltivare le cellule per 24 ore dopo la trasfezione per consentire un'espressione efficiente e il corretto indirizzamento della sonda.Successivamente, aggiungere quattro microlitri di sigillante TEREZIN N a 200 microlitri di HBS per ottenere una concentrazione finale di quattro micromolare. Mescolare delicatamente e incubare per due ore a temperatura ambiente al buio. Dopo due ore, trasferire i coverslip nella camera di perfusione e perfondere continuamente con soluzione HBS preriscaldata.Per registrare le immagini di bioluminescenza della concentrazione di calcio mitocondriale, selezionare il campo microscopico contenente le cellule che esprimono APO corin, come mostrato dall'emissione di fluorescenza. Successivamente, spegnere la luce del microscopio. Rimuovere la scatola contenente il divisore dicromatico posizionata nel percorso luminoso.Quindi spegnere la luce di eccitazione e chiudere la scatola oscura per ottenere un'oscurità completa. Perfundere le cellule con mezzo HBS, con o senza soluzioni di prova preriscaldate a 37 gradi Celsius. Successivamente, acquisire le immagini di emissione fotonica ogni 10 secondi mediante una camera a conteggio di fotoni gestita con un processore di immagini.Successivamente, aggiungere dig toin per rilasciare tutti i fotoni rimanenti per analizzare le immagini bioluminescenti che riflettono il calcio mitocondriale. Aprire l'immagine di fluorescenza GFP. Selezionare singole ROI tracciando attorno alle cellule trasfettate.Quindi copiare e incollare le stesse aree di interesse (ROI) su ogni immagine della sequenza. Catture schermo. Successivamente, esportare i valori di emissione fotonica per ciascuna ROI al software specifico per il calcolo, facendo clic su grafico.Per calcolare i valori di ogni ROI, selezionare quindi il valore totale e applicare l'attuale ROI a tutte le immagini. Successivamente, premere calcola, salvare il file di testo ed esportare i dati. Dopodiché, effettuare i calcoli corrispondenti per stimare l'entità degli aumenti di calcio mitocondriale in risposta a ciascuno stimolo mostrato.Di seguito sono riportate immagini rappresentative in campo chiaro e a colori pseudocromatici di colture a breve e lungo termine di neuroni ippocampali prima e dopo la stimolazione con 100 micromolar e MDA; tonalità più calde indicano un aumento della concentrazione citosolica di calcio. Questi tracciati mostrano le registrazioni rappresentative della concentrazione citosolica di calcio a livello di singola cellula in risposta a 100 micromolar e MDA in colture a breve e lungo termine di neuroni ippocampali. Si noti che gli aumenti della concentrazione citosolica di calcio sono molto più marcati nei neuroni coltivati a lungo termine rispetto a quelli coltivati a breve termine.In questo esperimento, neuroni ippocampali in coltura sono stati trasfettati con la korina a bassa affinità mirata ai mitocondri, fusionata con GFP, e incubati con terezina sigillante a quattro micromoli, quindi sottoposti a imaging bioluminescente della concentrazione di calcio mitocondriale. Qui vengono mostrati i tracciati che evidenziano il rilascio di emissioni luminose indicative del calcio mitocondriale in neuroni ippocampali in coltura a breve e lungo termine. Un aumento di 100 micromoli di MDA ha innalzato la concentrazione di calcio mitocondriale nei neuroni anziani, ma non nei neuroni ippocampali giovani in coltura, seguendo questa procedura.Altri metodi come la valutazione della fair left possono essere combinati con l'imaging a fluorescenza e bioluminescenza nelle stesse cellule per rispondere a ulteriori domande, come la suscettibilità alla cellula neuronale, i fattori legati alla neurodegenerazione associata all'invecchiamento e all'ischemia.

fluorescence-bioluminescence-imaging-subcellular-ca2-aged-hippocampal

Research

Ricerca

JoVE Journal

Neuroscience

Neuroscienze

In questo protocollo, che aggiorniamo i recenti progressi nel campo dell'imaging...

Calcio Risposte imaging in neuroni GFP-tagged fette di cervello di topo ipotalamici

Fonte: Ulivi, A. F., et. al. Imaging longitudinale a due fotoni dell'ippocampo dorsale CA1 in topi vivi. J. Vis. Exp. (2019) Questo video mostra l'imaging longitudinale a due fotoni di neuroni piramidali marcati in fluorescenza in un topo vivo,  mostrando la preparazione, l'allineamento della cannula e l'imaging di dendriti e spine dendritiche per studiare la struttura neuronale nella regione CA1 dell'ippocampo.

Imaging longitudinale a due fotoni di neuroni marcati in fluorescenza in un ippocampo di topo vivo 

Fonte: Calvo-Rodríguez, et al. Imaging a fluorescenza e bioluminescenza di Ca2+ in neuroni ippocampali invecchiati. J. Vis. Exp. (2015).  Questo video dimostra l'uso dell'imaging a fluorescenza per misurare i livelli di calcio citosolico in colture ippocampali di ratto a breve e lungo termine. Confrontando i neuroni giovani e quelli invecchiati, evidenzia come l'aumento della densità dei canali del calcio voltaggio-dipendente di tipo L e l'attivazione prolungata nei neuroni anziani provochino...

Imaging in vitro del calcio in colture di ippocampi di ratto a breve e lungo termine

Fonte: Krishnamurthy, K. et al. Misurazione fluorescente in tempo reale delle funzioni sinaptiche nei modelli di sclerosi laterale amiotrofica. J. Vis. Exp. (2021)Questo video mostra l'imaging del calcio in tempo reale per monitorare l'attività sinaptica nei neuroni mutanti della SLA che esprimono un biosensore di calcio geneticamente codificato. Delinea i passaggi per preparare i neuroni per l'imaging, stimolare la dinamica del calcio e registrare la fluorescenza per misurare i cambiamenti in...

Imaging a fluorescenza della dinamica sinaptica del calcio in un modello in vitro di sclerosi laterale amiotrofica

Fonte: Kamei, R., et. al., Imaging cronico a due fotoni in vivo della microglia nell'ippocampo del topo. J. Vis. Exp. (2022)Il video mostra il processo di configurazione e imaging per la microscopia a due fotoni in vivo della dinamica microgliale nel CA1 dell'ippocampo (Cornu ammonis 1) e nel giro dentato, garantendo un allineamento ottico ottimale e una valutazione dell'integrità strutturale.

Imaging in vivo a due fotoni della dinamica microgliale nell'ippocampo del topo

Qui vi presentiamo un romanzo di Ca 2+ approccio -imaging utilizzando un reporter bioluminescente. Questo approccio viene utilizzato un costrutto fuso GFP-equorina che si lega al Ca 2+ ed emette luce, eliminando la necessità di luce di eccitazione. Significativamente questo metodo permette di imaging lungo continuo, l'accesso alle strutture cerebrali profonde e alta risoluzione temporale.

In Vivo cervello Imaging funzionale approccio basato sul calcio bioluminescente Indicatore GFP-equorina

Presentiamo un metodo che unisce le registrazioni della intero-cellula patch-clamp e due-fotone imaging per registrare transitori di Ca2 + nei dendriti neuronali nelle fette del cervello acuto.

Imaging del due-fotone calcio nei dendriti neuronali nelle fette del cervello

Questo metodo descrive una preparazione cronica che consente l'accesso ottico all'ippocampo di topi viventi. Questa preparazione può essere utilizzata per eseguire l'imaging ottico longitudinale della plasticità strutturale neuronale e della plasticità cellulare evocata dall'attività per un periodo di diverse settimane.

Imaging longitudinale a due fotoni dell'ippocampo dorsale CA1 in topi vivi

Sono descritti due metodi correlati per visualizzare gli eventi subcellulari necessari per la trasmissione sinaptica. Questi protocolli consentono il monitoraggio in tempo reale della dinamica dell'afflusso di calcio presinaptico e della fusione della membrana delle vescicole sinaptiche utilizzando l'imaging a cellule vive di neuroni in coltura in vitro .

Misurazione fluorescente in tempo reale delle funzioni sinaptiche in modelli di sclerosi laterale amiotrofica

Questo articolo descrive un metodo per l'osservazione cronica in vivo della microglia a riposo nell'ippocampo CA1 del topo utilizzando la chirurgia controllata con precisione e la microscopia a due fotoni.

In vivo Imaging cronico a due fotoni della microglia nell'ippocampo del topo

I metodi attuali descrivono un approccio non raziometrico per l'imaging subcompartimentale del calcio ad alta risoluzione in vivo in Caenorhabditis elegans utilizzando indicatori di calcio geneticamente codificati prontamente disponibili.

Imaging subcellulare della manipolazione neuronale del calcio in vivo

Scopri l'imaging di fluorescenza e bioluminescenza per studiare il calcio citosolico e mitocondriale in colture a lungo termine di neuroni ippocampali di ratto. Questa tecnica aiuta a comprendere il rimodellamento del calcio nell'invecchiamento neuronale.

Fluorescenza e bioluminescenza di subcellulare Ca

Esplora altri video