Fluorescenza e bioluminescenza di subcellulare Ca ²⁺ In Aged neuroni dell'ippocampo

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di studiare il rimodellamento del calcio nel cervello che invecchia utilizzando l'imaging a fluorescenza e bioluminescenza del calcio citosolico e mitocondriale in colture a lungo termine di neuroni ippocampali frat, che è considerato un modello di invecchiamento neuronale. Questo metodo può aiutare a comprendere le questioni chiave nel campo dell'invecchiamento, come ad esempio come il rimodellamento del calcio intracellulare contribuisca all'eccitotossicità e al danno neuronale, entrambi correlati al sovraccarico di calcio. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è possibile seguire da vicino il rimodellamento del calcio in singoli neuroni utilizzando colture a diversi DYS in vitro dallo stesso campione, la duplicazione di questa tecnica deriva attraverso la terapia di un ictus o di una malattia cellulare perché varia il nuovo bersaglio correlato al sovraccarico di calcio in queste malattie correlate all'agente.

Dopo aver visto questo video, Gesù ha una buona comprensione di come eseguire l'imaging a fluorescenza e reminiscenza del calcio citosolico e mitocondriale in colture a breve e lungo termine di neuroni ippocampali di ratto. Per iniziare questa procedura, distribuire i vetrini coprioggetto su una striscia di paraforma in una capsula di Petri. Quindi applicare 200 microlitri di poli D lice a un milligrammo per millilitro su ogni vetrino coprioggetti e trattare per una notte.

Il giorno successivo lavare i vetrini coprioggetto con acqua sterile a doppia distillazione ogni 15 minuti per 90 minuti in condizioni sterili. Posizionare i vetrini di copertura nel multi e mantenerli in un'incubatrice umidificata a 37 gradi Celsius e 5% di CO2 fino al momento dell'uso. Per isolare i neuroni dell'ippocampo, aprire il cranio dei cuccioli di ratto appena nati con forbici sterili, estrarre il cervello con una spatola e lavarlo rapidamente nel terreno F 12 del prosciutto.

Praticare quindi un taglio diagonale con il bisturi in ogni emisfero e trasferirlo al microscopio nella piastra di Petri contenente prosciutti F 12 medi. Scartare le meningi. Identificare attentamente l'ippocampo in una caratteristica posizione concava sopra la corteccia.

Quindi separare l'ippocampo dalla corteccia tirandolo via con cura e rimuovendolo con le forbici per gli occhi. Quindi, trasferisci i pezzi dell'ippocampo in una fiala contenente 1,8 millilitri di soluzione di pepane prefiltrata. Incubarli a 37 gradi Celsius agitandoli delicatamente di tanto in tanto per 15 minuti.

Quindi aggiungere 90 microlitri di una soluzione di DNA. Aggiungere 50 microgrammi per millilitro e incubarli per altri 15 minuti. Successivamente, trasferire il tessuto in una provetta da centrifuga da 10 millilitri e lavare i frammenti con terreno di coltura neurobasale fresco.

Ottenere una sospensione cellulare facendo passare i frammenti di tessuto attraverso una pipetta di plastica da cinque millilitri. Quindi, centrifugare la sospensione cellulare a 160 G per cinque minuti. Successivamente, rimuovere il supinato utilizzando una pipetta sterile di plastica da pascolo e sospendere accuratamente il pellet in un millilitro di terreno di coltura neurobasale con una pipetta automatizzata da un millilitro.

Quindi, misurare la densità cellulare utilizzando una camera di conteggio neubauer. Aggiungere 10 microlitri di sospensione cellulare e contare il numero di cellule al microscopio. Quindi eseguire i calcoli corrispondenti per ottenere da 40 a 80 microlitri di sospensione cellulare, che contiene circa 30.000 cellule.

Nella piastra a quattro pozzetti contenente 500 microlitri di mezzo neurobasale, hanno suonato circa 30.000 cellule per ogni pozzetto contenente vetrini di copertura. Tenerli nell'incubatrice da due a cinque giorni in vitro per i neuroni giovani o più di 15 giorni in vitro per i neuroni anziani. In questa procedura, incubare le cellule con meno 2:00 AM per 60 minuti a temperatura ambiente al buio.

Quindi trasferire i vetrini di copertura nella camera di profusione. Successivamente, posizionare la camera di profusione con il vetrino coprioggetto nel supporto sul microscopio invertito. Selezionare il campo microscopico e perfondere continuamente le celle con HBS di preriscaldamento.

Successivamente, epi illuminare le celle a 340 e 380 nanometri. In alternativa, registra la luce emessa a 520 nanometri ogni 5-10 secondi con una fotocamera fluorescente, che viene filtrata da uno specchio fira due diic. Per analizzare le immagini fluorescenti registrate, aprire prima il file dell'esperimento utilizzando il software Aqua Cosmos, fare clic sul rapporto e selezionare l'intervallo di rapporto desiderato.

Calcola il rapporto pixel per pixel nelle immagini risultanti per ottenere una sequenza di immagini con rapporto. Quindi sottrai lo sfondo regolando il pulsante di eliminazione dello sfondo. Dopodiché, premere avvia calcolo.

Quindi, premere il pulsante della sequenza temporale e cancellare le ROI antiche per l'analisi quantitativa delle singole cellule. Stabilire nuove ROI o le ROI corrispondenti ai singoli neuroni. Per rappresentare graficamente le singole registrazioni, esportare i valori di fluorescenza del rapporto corrispondenti a ciascuna ROI nel programma di laboratorio Origin facendo clic sul grafico.

Quindi fare clic su calcola e salvare il file TXT. Successivamente, effettuare il calcolo corrispondente per stimare l'entità dell'aumento del rapporto di fluorescenza in risposta a ciascuna stimolazione per trasfettare i neuroni in coltura con il plasmide mutante del MIT. Per prima cosa, preparare 50 microlitri di soluzione A contenente reagente di trasfezione in un flaconcino.

Successivamente, preparare 50 microlitri di soluzione B contenente il plasmide MIT ute in un flaconcino. Aggiungere la soluzione B alla soluzione A e incubare per 20 minuti. Dopodiché, trasferisci i vetrini coprioggetti contenenti i neuroni dell'ippocampo in nuove piastre multiplo contenenti 200 microlitri di TF neuro basale fresco. Quindi aggiungere 100 microlitri di soluzione A e B goccia a goccia su ciascun vetrino coprioggetti e incubare per 30 minuti.

Dopo 30 minuti, rimuovere il mezzo. Lavare le cellule con fresco neuro basal tf. Una volta restituito, il coperchio scivola sul terreno di coltura neurobasale originale e coltiva le cellule per 24 ore dopo la trasfezione per consentire un'espressione e un targeting efficienti della sonda.

Quindi, aggiungere quattro microlitri di sigillante TEREZIN N a 200 microlitri di HBS per ottenere una concentrazione finale di quattro micromolari. Mescolare delicatamente e incubare per due ore a temperatura ambiente al buio. Dopo due ore, trasferire i vetrini del coperchio nella camera di perfusione ed esaminare continuamente con la soluzione HBS di preriscaldamento.

Per registrare le immagini di bioluminescenza della concentrazione di calcio mitocondriale, selezionare il campo microscopico contenente le cellule che esprimono APO corin come mostrato dall'emissione di fluorescenza. Quindi, spegni la luce del microscopio. Rimuovere la scatola contenente il dicroico situata nel percorso della luce.

Quindi spegnere la luce di eccitazione e chiudere la scatola scura per una completa oscurità. Perfondere le celle con terreno HBS, con o senza soluzioni di prova preriscaldate a 37 gradi Celsius. Quindi cattura le immagini di emissione fotonica ogni 10 secondi con una fotocamera per il conteggio dei fotoni gestita con un processore di immagini.

Quindi, aggiungi dig toin per rilasciare tutti i fotoni rimanenti per analizzare le immagini bioluminescenti che riflettono il calcio mitocondriale. Aprire l'immagine a fluorescenza GFP. Seleziona le singole ROI disegnando intorno alle celle trasfettate.

Quindi copia e incolla le stesse ROI su ogni immagine della sequenza. Acquisizioni di schermate. Successivamente, esportare i valori di emissione fotonica per ogni ROI nel software specifico per il calcolo del grafico a clic.

Per calcolare i valori per ogni ROI, selezionare il valore totale e utilizzare il ROI corrente per tutte le immagini. Successivamente, premere calcola, salvare il file di testo ed esportare i dati. Successivamente, effettuare i calcoli corrispondenti per stimare l'entità degli aumenti del calcio mitocondriale in risposta a ciascuno stimolo mostrato.

Ecco le immagini rappresentative in campo chiaro e pseudo colori di colture a breve e lungo termine di neuroni ippocampali prima e dopo la stimolazione con 100 micromolari e i colori più caldi dell'MDA riflettono un'elevata concentrazione citosolica di calcio. Queste tracce mostrano le registrazioni rappresentative di singole cellule della concentrazione citosolica di calcio in risposta a 100 micromolari e MDA in colture a breve e lungo termine di neuroni ippocampali. Si noti che gli aumenti della concentrazione citosolica di calcio sono molto maggiori a lungo termine rispetto ai neuroni in coltura a breve termine.

In questo esperimento, i neuroni ippocampali in coltura sono stati trasfettati con la korin mirata ai mitocondri a bassa affinità fusa con GFP incubata con quattro sigillanti micromolari terezina e sottoposti a imaging a bioluminescenza della concentrazione di calcio mitocondriale. Qui, le registrazioni che mostrano il rilascio di emissioni fotografiche che riflettono il calcio mitocondriale nei neuroni ippocampali coltivati a breve e lungo termine. Un micromolare MDA 100 ha aumentato la concentrazione di calcio mitocondriale nei neuroni invecchiati, ma non nei giovani neuroni ippocampali in coltura A seguito di questa procedura.

Altri metodi, come la valutazione della sinistra giusta, possono essere combinati con la fluorescenza e l'imaging a bioluminescenza nelle stesse cellule per rispondere a domande aggiuntive come la suscettibilità alle cellule neuronali, il piombo associato all'invecchiamento, la neurodegenerazione e l'ischemia.