Name: Misura di Scattering non linearità da un nanoparticelle plasmoniche singolo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 6 s
Description: Scopri come migliorare la risoluzione in microscopia ottica mediante scattering non lineare da nanostrutture plasmoniche. Questa tecnica sfrutta nanoparticelle d'oro per ottenere contrasto elevato e non degradabile.

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Questo lavoro è supportato dal Ministero della Scienza e della Tecnologia sotto NSC-101-2923-M-002-001-MY3 e NSC-102-2112-M-002-018-MY3. Questa ricerca è supportata anche dalla Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) attraverso il "Programma di finanziamento per i ricercatori di prossima generazione leader a livello mondiale (NEXT Program)", avviato dal Council for Science and Technology Policy (CSTP) e dal JSPS Asian CORE Program.

1. GNS preparazione del campione <ol><li> Prima di preparare la, Sonicare 1 ml di soluzione colloidale GNS campione per almeno 15 minuti a circa 40 kHz a prevenire l&#39;aggregazione delle particelle, che può causare il picco LSPR di spostare. </li><li> Goccia 100-200 ml di colloidi GNS su un vetrino con commerciale silicato di alluminio magnesio (MAS) rivestimento per fissare il GNSS. </li><li> Dopo almeno 1 min, rimuovere il colloide extra risciacquo con acqua distillata. Il tempo di attesa dipende dalla densità necessaria distribuzione del GNSS. Tipicamente, 1-3 min si ottiene una densità adatta che permette alle particelle di essere facilmente identificati poiché la maggior parte di essi sono isolati l&#39;uno dall&#39;altro. Aggregazione significativa si può verificare se il tempo di attesa è troppo lungo. </li><li> Essiccare il campione da spurgo con azoto. </li><li> (Facoltativo) Per mappare la GNSS sul vetro con alta risoluzione, eseguire microscopia elettronica a scansione (SEM), in questa fase 23. Un&#39;immagine esempio è fornito in Figure 1, che mostra la densità caratteristica del GNSS. Utilizzare una emissione di campo SEM per acquisire l&#39;immagine. Una volta aggiunto olio sul campione (passo successivo), sarà difficile da rimuovere l&#39;olio e osservare il campione con SEM. </li><li> Aggiungere una goccia di olio con lo stesso indice di rifrazione sul campione per coprire il GNSS e per eliminare il forte riflessione dal substrato di vetro. </li><li> Posizionare un vetro di copertura sulla parte superiore del campione e sigillare con smalto. </li><li> Attendere almeno 5 minuti fino a quando lo smalto si asciuga. Il campione è pronto ora. </li></ol> 2. Allineamento della casa costruita confocale microscopio <ol><li> Vedere la Figura 2 per lo schema di installazione. Allineare il bianco percorso illuminazione luce del corpo del microscopio stesso. Accendere la sorgente luminosa alogena del microscopio, e seguire il manuale del produttore del microscopio per ottenere la condizione di illuminazione Köhler. Assicurarsi che i bianchi fasci di luce alogena sono quasi parallele sul retroapertura dell&#39;obiettivo, parzialmente riflesso dal 50/50 beamsplitter, e quindi propaga verso il laser. </li><li> Accendere specchi galvaniche per garantire che rimangano nella posizione iniziale corretta, che è, al centro del campo di scansione. </li><li> Posizionare almeno due bersagli, realizzati da un sottile foglio di carta con anelli concentrici su di esso, lungo il percorso della luce alogena, e allinearli con il fascio alogeno. </li><li> Per eseguire l&#39;imaging, selezionare il laser 532 nm. Per eseguire misure di spettroscopia, selezionare il laser super continuo. Durante l&#39;allineamento, la potenza dei laser deve essere inferiore a 10? W in corrispondenza dell&#39;apertura posteriore dell&#39;obiettivo per evitare linearità. Poi, collimare il fascio laser incidente opposta al fascio alogeno uscente con l&#39;aiuto dei due bersagli. Quando questo processo è completato, l&#39;allineamento grossolano del fascio laser è stato raggiunto. </li><li> Allineare il raggio laser attraverso il centro dell&#39;apertura posteriore della lente obiettivo. In genere, utilizzare un oiObiettivo l-immersione. Aggiungere una goccia di olio tra l&#39;olio-immersion lente dell&#39;obiettivo e il campione GNS. Utilizzare un tubo fotomoltiplicatore (PMT) come rilevatore per raccogliere i segnali di diffusione del GNSS. </li><li> Collocare un foro 20 micron di diametro davanti PMT per bloccare fuori fuoco dispersione segnali. Accendere specchi galvaniche e PMT (tramite software casa costruita), regolare la posizione foro stenopeico e l&#39;altezza della fase del campione di massimizzare i segnali backscattering del GNSS, e quindi osservare un individuo GNS sullo schermo del computer. Un&#39;immagine campione xy del GNSS con corretto allineamento è mostrata nella Figura 2B. </li><li> Leggermente modificare l&#39;altezza della fase del campione per verificare la concentricità del fuoco. Se non è concentrica, la regolazione del fascio con i due specchi di fronte dello scanner fino al centro del GNS rimane nella stessa posizione, mentre l&#39;altezza della fase del campione viene modificato. Assicurarsi che l&#39;immagine xz della PSF è analoga alla figura 2Cper assicurare l&#39;allineamento fascio corretto. Elaborare queste due immagini con passa-basso e filtri lisce gaussiana. </li></ol> 3. Caratterizzazione di Scattering Nonlinearità <ol><li> A bassa intensità di eccitazione (meno di 10 4 W / cm 2), acquisire un&#39;immagine di nanoparticelle di oro dal seguente protocollo 2.6. </li><li> Apri l&#39;immagine in ImageJ (o qualsiasi altro software di analisi di immagine). Tracciare una linea attraverso uno dei GNSS nell&#39;immagine (vedere Figura 2B), e utilizzare l&#39;analisi -&gt; Profilo trama degli strumenti di ImageJ per recuperare il profilo di intensità di scattering. Inserire il profilo del PSF scelto da una funzione gaussiana: <img alt="Equazione 2" src="/files/ftp_upload/53338/53338eq2.jpg" /> dove Y è il valore di lettura PMT, y 0 è il valore di fondo (se presente), A è l&#39;ampiezza di picco, w è la larghezza, x è la coordinata spaziale e x c è il centro coordinate della funzione gaussiana. La FWHM della PSF corrispondente è (½ln2) w. Sulla base della apertura numerica (NA) dell&#39;obiettivo, la FWHM teorico del PSF confocale può essere stimato in circa 0.43l / NA, dove L è la lunghezza d&#39;onda di eccitazione. Confrontare questi due numeri per controllare l&#39;allineamento del sistema di imaging. </li><li> Aumentare l&#39;intensità di eccitazione cambiando manualmente il filtro a densità neutra (ND) nella Figura 2A, e registrare le immagini di backscattering ad ogni livello di intensità. Prendere il valore del segnale di dispersione dal centro di ogni GNS a diverse intensità di eccitazione, e tracciare la curva di segnali rispetto intensità di eccitazione dispersione. Controllare la linearità dei primi punti, che dovrebbe esibire una relazione lineare quando l&#39;intensità di eccitazione è sufficientemente bassa. Tracciare una linea sulla base di montaggio lineare dei primi punti. Se le intensità di scattering dei punti successivi scendono sotto questa tendenza lineare, saturation è verificato. </li><li> Dopo aver osservato dispersione saturabile, diminuire gradualmente l&#39;intensità di sotto della soglia di saturazione, e di nuovo la stessa immagine GNSS per assicurare la reversibilità dei comportamenti non lineari. </li></ol> 4. Misura di una Scattering spettro di un oro Nanosphere singolo <ol><li> Per misurare lo spettro backscattering da un singolo GNS, utilizzare il laser super-continuo come sorgente laser. La lunghezza d&#39;onda iniziale del laser varia da 450 nm a 1.750 nm. Per rimuovere l&#39;alimentazione infrarossi eccesso che potrebbe causare danni al campione ed i componenti ottici, posizionare uno o due specchi subito dopo il laser super-continuo per riflettere la luce visibile, e utilizzare fascio discariche per raccogliere la luce infrarossa in eccesso. </li><li> Seguire le procedure di allineamento nella Sezione 2 per dirigere il laser super-continuo nel microscopio confocale a scansione laser. Utilizzare una banda larga 50/50 BS al fine di garantire la copertura spettrale tutta la gamma visibile. </li><li> Acquisire unimmagine del GNSS su vetro. Individuare un singolo GNS nell&#39;immagine, e fissare la messa a fuoco della luce a banda larga incidente sulla particella. </li><li> Utilizzare uno specchio capovolgimento di fronte al PMT per dirigere il segnale di backscattering verso lo spettrometro, che è dotato di un dispositivo ad accoppiamento di carica, e poi prendere uno spettro dei singoli GNS selezionati. Fare attenzione che lo spettro qui è una miscela di GNS dispersione e lo sfondo a causa di riflessioni da altre superfici. </li><li> Tornare al rivelatore PMT, e prendere un&#39;altra immagine per confermare che la posizione delle particelle non è cambiata. Quindi, spostare l&#39;attenzione ad un punto in cui è presente nessuna particella. Passare allo spettrometro, e prendere un altro spettro, che rappresenta lo sfondo. </li><li> Sottrarre il spettro di fondo dal punto 4.5 dello spettro dal punto 4.4 per ottenere una chiara gamma backscattering di un singolo GNS. </li></ol> 5. L&#39;allineamento di SAX microscopio <ol><li> Vedi Figura 3per lo schema del microscopio SAX, dove una modulazione temporale sinusoidale ideale è ottenuta dalla frequenza di battimento tra due modulatori acusto-ottica (AOMS). Innanzitutto, regolare la dimensione del fascio del laser per soddisfare il requisito dei AOMS successive. Dividere la luce laser 532 nm in due fasci, utilizzando un divisore di fascio 50/50. </li><li> Guida i due raggi attraverso i due AOMS, ad un trave che passa attraverso ogni AOM. Le frequenze di modulazione dei due AOMS devono essere diversi. Ad esempio, si può essere a 40.000 MHz e l&#39;altro a 40.010 MHz, ottenendo una differenza di frequenza di 10 kHz. Questa frequenza differenza sarà la frequenza fondamentale di modulazione f m per i segnali SAX. </li><li> Prendere il primo ordine fasci diffratti da entrambi AOMS, e combinare i due fasci utilizzando un altro splitter 50/50 fascio. Regolare gli specchi dopo che i AOMS per collimare i due fasci. </li><li> Aggiungere un fotorivelatore che è collegato ad un oscilloscopio per monitorare la modulatio temporalen. Dividere una piccola porzione del laser con un vetrino, e inviarlo al fotorivelatore, come mostrato nella figura 3. Con corretta modulazione e fascio sovrapposizione, osservare modulazione dell&#39;intensità sinusoidale alla principale frequenza f m, simile a quella della forma d&#39;onda mostrata in figura 4. Nota: Lo sfondo della modulazione deve essere il più basso possibile per ottenere la massima profondità di modulazione. Inoltre, utilizzare la funzione di analisi di Fourier dell&#39;oscilloscopio per verificare che la distorsione armonica della modulazione sta diminuendo. Per raggiungere implementazione SAX successo, garantire una perfetta modulazione dell&#39;intensità eccitazione sinusoidale con minimizzato linearità iniziale. </li><li> Scollegare l&#39;uscita elettrica del fotorivelatore dall&#39;oscilloscopio e collegare l&#39;ingresso di riferimento di un amplificatore lock-in. </li><li> Come mostrato in figura 3, allineare il raggio laser nel sistema confocale seguendo i protocolli precedenti. Here, collegare l&#39;uscita elettrica del PMT all&#39;amplificatore lock-in come ingresso di segnale. </li><li> Utilizzare un vetro di copertura in bianco come campione, e verificare la linearità del sistema di rivelazione elettrico gradualmente aumentando la potenza di eccitazione ,, come mostrato in figura 5, dove il rivelatore è lineare sotto di un valore di lettura di 1-V. In tutte le misurazioni successive, fare attenzione a frenare la lettura al di sotto di questo valore. </li><li> Impostare l&#39;uscita dell&#39;amplificatore lock-in per esportare la grandezza assoluta del segnale di tensione. Modificando la componente armonica impostazione al canale di riferimento, ottenere le ampiezze dei segnali SAX, A 1, A 2, e così via. </li><li> Esportare i segnali lineari e non lineari dal amplificatore lock-in per una scheda di acquisizione dati, che riceve anche i segnali di tensione guida degli specchi galvaniche scansione raster. Con l&#39;ausilio di un programma personalizzato Labview, sincronizzare i segnali dell&#39;amplificatore lock-in egalvano specchi per formare un&#39;immagine. </li><li> Per ottimizzare il rapporto segnale-rumore nelle immagini, selezionare opportunamente l&#39;acquisizione pixel e tempi di integrazione dell&#39;amplificatore lock-in. Ad esempio, quando la frequenza di modulazione principale f m dell&#39;eccitazione è 10 kHz, cioè quando il periodo è di 100 msec, impostare il tempo di integrazione del blocco amplificatore di essere almeno tre volte più lungo del periodo. Aggiungendo il tempo del movimento specchio galvano, la velocità di acquisizione è impostato a 1.500 pixel al secondo in modalità di imaging SAX. </li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Nel protocollo, ci sono diversi passaggi critici. In primo luogo, durante la preparazione dei campioni, la densità di nanoparticelle non deve essere troppo elevato, per evitare l&#39;accoppiamento plasmonica tra le particelle. Se due o più particelle sono molto vicini l&#39;uno all&#39;altro, i risultati di accoppiamento in lunghezza d&#39;onda LSPR spostando verso lunghezze d&#39;onda maggiori, riducendo in modo significativo la non linearità. Tuttavia, questa tecnica di imaging mappe realtà la distribuzione dei modi p...

Lo studio di plasmonica ha suscitato un grande interesse per le sue applicazioni in molti campi diversi 1-4. Uno dei campi più studiati in plasmonica è plasmonica di superficie, in cui l&#39;oscillazione collettiva di elettroni di conduzione coppie con un&#39;onda elettromagnetica esterna ad un&#39;interfaccia tra un metallo e dielettrico. Plasmonica di superficie è stata esplorata per le sue potenziali applicazioni nella subwavelength ottica, biofotonica, e microscopia 5,6. La forte amplificazione di campo nel volume ultra-piccole di nanoparticelle metalliche a causa localizzato risonanza plasmonica superficiale (LSPR) ha attirato grande attenzione, non solo per la sua eccezionale sensibilità dimensioni delle particelle, forme di particelle, e le proprietà dielettriche del mezzo circostante 7 -10, ma anche per la sua capacità di stimolare intrinsecamente deboli effetti ottici non lineari 11. La sensibilità eccezionale di LSPR è prezioso per la bio-sensing e near-fietecniche di imaging ld 12,13. D&#39;altra parte, la maggiore linearità delle strutture plasmoniche può essere utilizzato in circuiti integrati fotonici in applicazioni quali commutazione ottica ed elaborazione del segnale completamente ottica 14,15. E &#39;noto che l&#39;assorbimento plasmonica è linearmente proporzionale all&#39;intensità di eccitazione a bassi livelli di intensità. Quando l&#39;eccitazione è abbastanza forte, l&#39;assorbimento raggiunge la saturazione. Curiosamente, a intensità più elevate, l&#39;assorbimento aumenta di nuovo. Questi effetti non lineari sono chiamati assorbimento saturabile (SA) 15-17 e inversa assorbimento saturabile (RSA) 18, rispettivamente. È noto che a causa della LSPR, dispersione è particolarmente forte in strutture plasmoniche. Sulla base di elettromagnetismo fondamentali, la risposta di dispersione rispetto dell&#39;intensità incidente dovrebbe essere lineare. Tuttavia, in nanoparticelle, dispersione e l&#39;assorbimento sono strettamente collegati tramite la teoria di Mie, ed entrambi possono essere eXpressed in termini di parti reale e immaginaria della costante dielettrica. Partendo dal presupposto che un singolo GNS si comporta come un dipolo sotto illuminazione luce, il coefficiente di diffusione (Q sca) e il coefficiente di assorbimento (Q abs) da una singola nanoparticella plasmonico secondo la teoria di Mie possono essere espressi come 19 <img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/53338/53338eq1.jpg" /> dove x è 2 πa / λ, a è il raggio della sfera, ed m è 2 m ε / ε d. Qui, ε m ed ε d corrispondono alle costanti dielettriche del metallo e dei dielettrici che circondano rispettivamente. Poiché la forma del coefficiente di dispersione è simile a quello di the coefficiente di assorbimento, si prevede pertanto di osservare dispersione saturabile in una singola nanoparticella plasmonico 20. Recentemente, lineare dispersione saturabile in una particella plasmonica isolata è stata dimostrata per la prima volta 21. È notevole che in saturazione profonda, l&#39;intensità di scattering infatti leggermente diminuita quando l&#39;intensità di eccitazione aumentata. Ancora più notevole, quando l&#39;intensità di eccitazione continuato ad aumentare dopo che la dispersione si è saturato, l&#39;intensità di scattering risorto, che mostra l&#39;effetto di dispersione saturabile inverso 20. Wavelength- e studi dipendenti dalle dimensioni hanno dimostrato una forte relazione tra LSPR e non lineari dispersione 21. L&#39;intensità e lunghezza d&#39;onda dipendenze scattering plasmonica sono molto simili a quelli di assorbimento, suggerendo un meccanismo comune alla base di tali comportamenti non lineari. In termini di applicazioni, è ben known che non linearità aiuta a migliorare la risoluzione microscopia ottica. Nel 2007, l&#39;eccitazione saturi è stata proposta (SAX) microscopia, che può aumentare la risoluzione estraendo il segnale saturo tramite una modulazione sinusoidale temporale del fascio di eccitazione 22. Microscopia SAX si basa sul concetto che per un punto focale del laser, l&#39;intensità è maggiore al centro rispetto alla periferia. Se il segnale (sia fluorescenza o scattering) mostra un comportamento di saturazione, la saturazione deve iniziare dal centro, mentre la risposta lineare rimane alla periferia. Pertanto, se vi è un metodo per estrarre solo la parte saturo, lascerà solo la parte centrale respingendo la parte periferica, migliorando così efficacemente la risoluzione spaziale. In linea di principio, non vi è limite di risoluzione non inferiore in microscopia SAX, purché profonda saturazione viene raggiunta e non vi è alcun danno campione a causa della illuminazione intensa. E &#39;stato dimostrato che il resolution di imaging di fluorescenza può essere significativamente migliorata utilizzando la tecnica SAX. Tuttavia, la fluorescenza soffre dell&#39;effetto photobleaching. Combinando la scoperta di dispersione non linearità e il concetto di SAX, microscopia a super-risoluzione basata sullo scattering può essere realizzato 21. Rispetto ai tradizionali microscopie super-risoluzione, la tecnica basata scattering fornisce un metodo di contrasto non-imbianchimento romanzo. In questo lavoro, una descrizione passo-passo è dato a definire le procedure necessarie per ottenere ed estrarre la non linearità di dispersione plasmoniche. Vengono descritti metodi di identificazione non linearità di scattering introdotte modificando l&#39;intensità incidente. Maggiori dettagli saranno forniti a svelare come queste non linearità influenzano immagini di singole nanoparticelle e come spaziale risoluzione può essere migliorata di conseguenza con la tecnica SAX.

<table><tbody><tr><td>corpo del microscopio</td><td>Olympus, Giappone</td><td>Obiettivo BX-51</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Olympus, Giappone</td><td>UPlanSapo, 100X, NA 1.4</td><td></td></tr><tr><td>80-nm oro colloidale</td><td>BBI Solutions, Regno Unito</td><td>EM. Laser supercontinuum GC80</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fianium, Regno Unito</td><td>SC400-2-PP</td><td></td></tr><tr><td>specchi dielettrici a banda larga</td><td>Thorlabs, USA</td><td>BB1-E02</td><td></td></tr><tr><td>emissione di campo SEM</td><td>JEOL, Giappone</td><td>JSM-6330F</td><td></td></tr><tr><td>spettrometro</td> opzionale <td>Andor Technology, Regno Unito</td><td>Shamrock 163</td><td></td></tr><tr><td>dispositivo ad accoppiamento di carica</td><td>Andor Technology, Regno Unito</td><td>iDus Modulatori acusto-ottici DV420A-OE</td><td></td></tr><tr><td></td><td>IntraAction Corp., USA</td> Amplificatore lock-in <td>AOM-402AF1</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Stanford Research Systems, USA</td><td>SR-830</td><td></td></tr><tr><td>Vetro scorrevole rivestito in MAS</td><td>Matsunami Glass, Giappone,</td> <td>S9215</td><td></td></tr></tbody></table>

misura di scattering non linearità da un nanoparticelle plasmoniche singolo

Measurement of Scattering Nonlinearities from a Single Plasmonic Nanoparticle

La plasmonica, che si basa sull'oscillazione collettiva degli elettroni dovuta all'eccitazione della luce, coinvolge campi elettrici locali fortemente potenziati e quindi ha potenziali applicazioni nell'ottica non lineare, che richiede un'intensità ottica straordinaria. Una delle non linearità più studiate in plasmonica è l'assorbimento non lineare, compresi i comportamenti di saturazione e saturazione inversa. Sebbene lo scattering e l'assorbimento nelle nanoparticelle siano strettamente correlati dalla teoria di Mie, non c'è stata alcuna segnalazione di non linearità nello scattering plasmonico fino a poco tempo fa. 
L'anno scorso, non solo la saturazione, ma anche la saturazione inversa dello scattering in una particella plasmonica isolata è stata dimostrata per la prima volta. I risultati hanno mostrato che lo scattering saturabile mostra una chiara dipendenza dalla lunghezza d'onda, che sembra essere direttamente collegata alla risonanza plasmonica di superficie localizzata (LSPR). Combinati con le misure dipendenti dall'intensità, i risultati suggeriscono la possibilità di un meccanismo comune alla base dei comportamenti non lineari di scattering e assorbimento. Queste non linearità di scattering da una singola nanosfera d'oro (GNS) sono ampiamente applicabili, anche nella microscopia a super-risoluzione e negli interruttori ottici. 
In questo articolo, viene descritto in dettaglio come misurare la non linearità dello scattering in un singolo GNP e come utilizzare la tecnica della super-risoluzione per migliorare la risoluzione dell'imaging ottico basata sullo scattering saturabile. Questa scoperta presenta la prima microscopia a super-risoluzione basata sullo scattering non lineare, che è un nuovo metodo di contrasto non sbiancante che può raggiungere una risoluzione fino a l/8 e sarà potenzialmente utile in biomedicina e negli studi sui materiali.

La figura 6 mostra lo spettro misurato da un 80 GNS nm. Una curva calcolata sulla base della teoria di Mie è dato nello stesso appezzamento, mostrando ottima accordo. Il picco LSPR è di circa 580 nm. Nel seguente esperimento, la lunghezza d&#39;onda del laser è a 532 nm, che è stato scelto in quanto si trova all&#39;interno della banda plasmonica per migliorare la dispersione ottica con effetto plasmoniche e consentire la dispersione di saturazione 21. Fig...

Lo scattering saturabile e saturabile inverso è stato scoperto in particelle plasmoniche isolate e adottato come nuovo metodo di contrasto non sbiancante nella microscopia a super-risoluzione. Qui vengono spiegate in dettaglio le procedure sperimentali di rilevamento ed estrazione dello scattering non lineare, nonché come migliorare la risoluzione con l'aiuto della microscopia ad eccitazione satura.

Misura di Scattering non linearità da un nanoparticelle plasmoniche singolo

Plasmonics, which are based on the collective oscillation of electrons due to light excitation, involve strongly enhanced local electric fields and thus ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è dimostrare il miglioramento della risoluzione mediante scattering non lineare da nanostrutture plasmoniche. Nel campo della microscopia ottica, il contrasto e la risoluzione sono i fattori più importanti. La nostra tecnica si estende al campo della super risoluzione con un nuovo contrasto basato sullo scattering.Il vantaggio principale di questa tecnica è che la diffusione da parte delle nanoparticelle è intensa, altamente non lineare e non fotodegradabile. A illustrare la procedura sarà Hsuan Lee, uno studente più esperto del mio laboratorio.L'esperimento verrà eseguito su un banco ottico, dove è presente un microscopio e due sorgenti laser. La prima sorgente laser è un laser a onda continua di 532 nanometri utilizzato per l'acquisizione di immagini.Il secondo è un laser a supercontinuo utilizzato per misurazioni spettroscopiche. Questo è uno schema della configurazione di base sia per l'immagine che per la spettroscopia. I campioni verranno montati su un banco posizionatore piezoelettrico nel microscopio confocale.La luce del laser a 532 nanometri attraversa un filtro neutro. Il fascio viene deviato da un divisore di fascio verso specchi galvanometrici che effettuano una scansione a raster nel piano focale dell'obiettivo del microscopio confocale. La luce dispersa all'indietro viene raccolta dall'obiettivo e focalizzata sul rivelatore.Iniziare allineando il percorso di illuminazione a luce bianca del microscopio. Utilizzare la sorgente luminosa alogena in modalità illuminazione a riflessione. Per verificare l'allineamento dell'iride interna, assicurarsi di osservare bordi nitidi dell'ottagono attraverso l'oculare o la CCD.Successivamente, utilizzare un pezzo di carta per verificare il percorso della luce esterna. Verificare che i fasci vengano parzialmente riflessi dal divisore di fascio e si propaghino verso il laser spostando la carta lungo il percorso della luce. Preparare ora dei bersagli di carta per facilitare un ulteriore allineamento.I bersagli devono essere su carta sottile con anelli concentrici. Posizionare questi bersagli lungo il percorso del fascio in modo che siano allineati con il fascio alogeno. Qui, un bersaglio è posizionato sull'apertura posteriore dell'obiettivo.Questo è un altro bersaglio posizionato lungo il percorso ottico. Successivamente, accendere il laser a 532 nanometri utilizzato per l'acquisizione delle immagini, al fine di allinearlo. Utilizzare i bersagli di carta per facilitare la collimazione della luce laser incidente in opposizione al fascio alogeno.Proseguire con un allineamento più preciso del fascio laser prima di rimuovere le targhette e procedere. Dopo aver allineato il laser, procurarsi un campione preparato di nanosfere d'oro per l'esperimento. Questo campione contiene nanosfere d'oro di 80 nanometri in olio.La miscela viene sigillata tra due piastre di vetro. Procedere montando il campione sul palchetto del microscopio e aggiungendo l'olio per obiettivo. A questo punto, preparare il sistema di rilevamento per l'acquisizione delle immagini.Raccogliere la luce diffusa con il tubo fotomoltiplicatore alla fine del percorso ottico. Lungo il percorso del fascio, posizionare un foro stenopeico di 20 micrometri di diametro per bloccare la luce diffusa fuori fuoco che raggiunge il tubo fotomoltiplicatore. Procedere con l'acquisizione delle immagini attivando gli specchi galvanometrici e il fotomoltiplicatore.Osservare il monitor del computer per vedere il segnale di retrodiffusione delle nanoparticelle d'oro. Massimizzare il segnale di retrodiffusione regolando la posizione del diaframma e l'altezza dello stadio del campione. Dopo aver allineato il microscopio confocale, caratterizzare la non linearità della diffusione del campione.Per fare ciò, utilizzare innanzitutto un misuratore di potenza per rilevare la potenza del laser dopo l'obiettivo. La lettura dovrebbe essere inferiore a 10 microwatt, corrispondente a un'intensità di eccitazione inferiore a 10 alla quarta watt per centimetro quadrato. Successivamente, acquisire un'immagine delle nanoparticelle d'oro utilizzando il tubo fotomoltiplicatore.Aprire l'immagine acquisita in un software di analisi delle immagini per caratterizzare il profilo di intensità della diffusione. Selezionare una nanosfera d'oro tra quelle presenti nell'immagine e tracciare una linea al suo interno. Successivamente, seguire i passaggi richiesti dal software per ottenere il profilo di diffusione.Adattare il profilo a una gaussiana, il che consente un ulteriore controllo dell'allineamento del sistema di imaging. Ora, iniziare a scansionare sistematicamente le intensità di eccitazione. Innanzitutto, modificare il filtro neutro per aumentare l'intensità di eccitazione.Determinare la nuova intensità di eccitazione e acquisire l'immagine della retrodiffusione al nuovo livello di intensità. Utilizzare l'immagine per estrarre un profilo di diffusione di una nanosfera come in precedenza. Riportare il profilo di diffusione in un grafico e identificare il suo valore al centro della sfera come segnale di diffusione.Ripetere questi passaggi più volte per costruire un grafico del segnale di scattering in funzione dell'intensità di eccitazione. In questo grafico, i punti blu rappresentano i dati. La linea rossa è un fit polinomiale.Esiste una relazione lineare tra il segnale di scattering e i bassi valori dell'energia di eccitazione. La diminuzione al di sotto di questa relazione lineare indica che è avvenuta la saturazione. Il passo successivo consiste nell'eseguire la spettroscopia su una singola nanosfera d'oro.Questo schema fornisce una panoramica dell'allestimento. Utilizzare una sorgente laser supercontinuo con un intervallo di lunghezza d'onda compreso tra 450 e 1750 nanometri. Inoltre, utilizzare un divisore di fascio a banda larga 50/50 per garantire una copertura spettrale nell'intero spettro visibile.Posizionare uno specchio deviatore davanti al tubo fotomoltiplicatore per indirizzare la luce verso lo spettrometro, che è dotato di un dispositivo a accoppiamento di carica. Il laser a supercontinuo deve essere allineato utilizzando la stessa procedura del laser da 532 nanometri.All'uscita del laser a supercontinuo, adottare alcune precauzioni per rimuovere l'eccesso di potenza infrarossa dal sistema. Posizionare specchi riflettenti per la luce visibile nel percorso ottico subito dopo l'uscita del laser, prima di inviare il fascio al microscopio. In combinazione con gli specchi, utilizzare degli assorbitori di fascio (beam dump) per raccogliere la radiazione infrarossa che potrebbe danneggiare il sistema.Con il laser allineato, acquisire e visualizzare un'immagine delle nanosfere d'oro. Esaminare l'immagine e identificare una singola nanosfera da studiare. Fissare il fuoco della luce a banda larga sulla nanosfera scelta.Successivamente, assicurarsi che lo spettrometro sia nel percorso ottico. In questa posizione, lo specchio orientabile devia la luce incidente verso il tubo fotomoltiplicatore. Riorientare lo specchio in modo da indirizzare la luce incidente verso lo spettrometro.Procedere con la raccolta dei dati sullo spettro di scattering della singola nanoparticella d'oro. Come in questo esempio, lo spettro misurato sarà una miscela dello scattering della nanosfera e del segnale di fondo dovuto alle riflessioni. Dopo aver acquisito lo spettro, riportare indietro lo specchio orientabile.Ruotarlo in modo da indirizzare la luce verso il tubo fotomoltiplicatore. Acquisire un'altra immagine per confermare che la nanoparticella d'oro non ha cambiato posizione. Successivamente, spostare il fuoco della luce a banda larga in un punto in cui non è presente alcuna particella.Cambiare nuovamente lo specchio per indirizzare la luce verso lo spettrometro e procedere con un'altra misurazione spettrale. Il nuovo spettro corrisponde allo spettro di fondo, che verrà sottratto dallo spettro delle nanosfere d'oro.Ecco lo spettro di retrodiffusione chiaro ottenuto sottraendo lo spettro di fondo dallo spettro con le nanosfere d'oro. La microscopia con eccitazione saturata del campione richiede un apparato diverso. Questo è lo schema del microscopio a eccitazione saturata.La sorgente laser è un laser a 532 nanometri. Utilizzare un divisore di fascio 50/50 per creare due fasci a partire dalla sorgente laser. Far passare ciascun fascio attraverso un modulatore acusto-ottico separato.Le diverse frequenze del modulatore generano una frequenza di battimento che fungerà da frequenza di modulazione dei segnali di eccitazione saturi. Combinare i fasci diffratti del primo ordine provenienti dai modulatori acusto-ottici utilizzando un altro divisore di fascio 50/50. Per monitorare la modulazione temporale, utilizzare un vetrino per deviare una piccola parte della luce laser verso un fotodetettore.Per verificare il sistema, collegare il fotodetettore a un oscilloscopio. Assicurarsi che nessun campione sia posizionato. Valutare il segnale del fotodetettore sull'oscilloscopio.Il segnale dovrebbe essere una sinusoide alla frequenza di battimento se la modulazione e la sovrapposizione del fascio sono corrette. Per questo esperimento, la frequenza di battimento prevista è di 10 kilohertz. Si raccomanda di ottenere una sinusoide il più perfetta possibile, con non linearità minima.Il passo successivo consiste nell'inserire un amplificatore a sincronia nel sistema. Per la microscopia a eccitazione saturata, l'amplificatore a sincronia riceve in ingresso il segnale dal foto rivelatore e dal tubo fotomoltiplicatore. Scollegare l'uscita del foto rivelatore dall'oscilloscopio e collegarla all'ingresso di riferimento dell'amplificatore.Collegare l'uscita del fotomoltiplicatore all'amplificatore a blocco come ingresso del segnale. Inviare l'uscita dall'amplificatore a una scheda di acquisizione dati. A questo punto, montare il campione sullo stadio del microscopio.Utilizzare lo stesso campione con nanosfere d'oro di 80 nanometri in olio sigillate tra due lastre di vetro. Tornare all'amplificatore a blocco mentre si effettuano le misurazioni. Impostare l'amplificatore per esportare il valore assoluto dell'ampiezza del segnale di tensione.In questo caso, selezionare R nel pannello di visualizzazione del canale 1. Modificare l'impostazione della componente armonica sul canale di riferimento per ottenere le ampiezze massime di eccitazione singole. Queste immagini a colori vengono generate utilizzando un software personalizzato per sincronizzare e combinare i segnali provenienti dall'amplificatore a blocco e dalle tensioni di pilotaggio dei motori galvanometrici.L'immagine ottenuta al microscopio elettronico a scansione è riportata a scopo comparativo. Le immagini mostrano il miglioramento della risoluzione con diversi componenti armonici. Lo spettro misurato di una nanosfera d'oro di 80 nanometri è in rosso.La curva continua calcolata utilizzando la teoria di Mie mostra un'eccellente concordanza. La risonanza plasmonica localizzata è a 580 nanometri. Le immagini di scattering, in alto, e i profili lineari, in basso, presentano caratteristiche diverse in funzione dell'intensità di eccitazione.A bassa intensità, la funzione di diffusione puntuale presenta un profilo gaussiano standard. Intensità più elevate portano ad un appiattimento e allargamento della funzione, indicando una saturazione. A valori più alti, l'intensità centrale non è la massima, risultando in una funzione di diffusione puntuale a forma di ciambella.Infine, l'intensità centrale diventa nuovamente il picco durante la saturazione inversa. I punti dati blu in questo grafico dell'intensità centrale a diverse intensità di eccitazione rivelano sia il comportamento di saturazione che quello di saturazione inversa. I punti dati sono stati interpolati con un polinomio di quinto ordine, rappresentato in rosso.Questi dati possono essere utilizzati per estrarre le componenti di frequenza armonica. Le componenti armoniche possono anche essere individuate direttamente utilizzando l'amplificatore a blocco di fase. Questo grafico a sinistra mostra dati sperimentali.Il grafico a destra è il risultato del calcolo effettuato utilizzando l'adattamento polinomiale di quinto ordine. Entrambi i grafici mostrano dei minimi a specifiche intensità lungo le curve. Ad esempio, tre minimi nell'armonica seconda.Inoltre, in ciascun grafico, per ogni ordine armonico, la pendenza aumenta dopo il primo minimo. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in meno di tre ore se effettuata correttamente. Durante il tentativo di eseguire questa procedura, è importante verificare la qualità della modulazione sinusoidale, la linearità del sistema di rilevamento e la stabilità meccanica del campione.Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come ottenere un miglioramento della risoluzione basato sulla diffusione non lineare da nanostrutture plasmoniche. Questa tecnica fornisce un esempio promettente per i ricercatori nel campo della microscopia a super-risoluzione, al fine di esplorare nuovi contrasti in altre interazioni fondamentali tra luce e materia.

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