L'innesto di Perline in via di sviluppo di pollo Limbs embrioni per identificare percorsi di trasduzione del segnale che influenzano l'espressione genica

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di mostrare come determinare gli effetti dei fattori di crescita e degli inibitori nell'espressione genica degli arti in via di sviluppo di embrioni di pollo. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella biologia dello sviluppo, come ad esempio il modo in cui le molecole di segnalazione influenzano la crescita e la differenziazione delle cellule in vivo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce un metodo per testare questi fattori direttamente nell'embrione.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sullo sviluppo degli arti, può essere applicato anche ad altri sistemi, come il tessuto neurale, i somiti o la gastrulazione. A dimostrare la procedura sarà Rebeea Mohammed, una studentessa laureata del mio laboratorio. Per iniziare, trasferisci un millilitro di perline dalla soluzione madre originale in un tubo nuovo.

Lasciare depositare le perline, quindi rimuovere il liquido e sostituirlo con un millilitro di PBS. Ripetere questo passaggio cinque volte e conservare le perle lavate a quattro gradi Celsius, come un impasto in PBS. Selezionare le perle per l'innesto, rimuovendole dalla soluzione madre lavata utilizzando una pipetta da 20 microlitri e inserirle in un millilitro di PBS.

Usando uno stereoscopio, scegli perline di circa 100 micron di diametro. Trasferire le perle selezionate in due micro-litri di liquido in una nuova capsula di Petri contenente una goccia da 20 millilitri di PBS Quindi, rimuovere il PBS dalle perline. Prima, con una pipetta da 20 microlitri, quindi, rimuovere il liquido residuo per azione capillare utilizzando una pinza da orologiaio fine.

È importante rimuovere quanto più liquido possibile in modo che il fattore di crescita non venga diluito quando viene aggiunto alle perline. Pipettare il fattore di crescita direttamente sulle perline. Per l'FGF18, aggiungere 0,5 micro-litri di FGF18 ricombinante, ricostituito aggiungere 0,5 milligrammi per millilitro in PBS con lo 0,1% di BSA.

Quindi, metti alcune gocce d'acqua attorno ai bordi del piatto per evitare che il liquido evapori. Quando sono pronte, incubare le perle per un'ora a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, rimuovere le gocce d'acqua dal piatto con una pipetta Pasteur e posizionare il piatto sul ghiaccio.

Derivatizzare le perline, usando prima una spatola per trasferire le perle in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Quindi, aggiungere un millilitro di 0,2 di acido formico normale e incubare le perle nell'acido su una piattaforma di agitazione per un'ora. Quindi, lasciare che le perle si depositino, rimuovere l'acido formico e sostituirlo con un millilitro d'acqua.

Lavare le perle per un'ora sulla piattaforma di agitazione e ripetere il lavaggio sei volte per rimuovere eventuali residui di acido formico. Dopo l'ultimo lavaggio, rimuovere il liquido rimanente e conservare le perline a quattro gradi Celsius. Usa una spatola per rimuovere una piccola tavolozza di perline di circa cinque-dieci micro-litri di volume dal brodo e metti le perline in una capsula di Petri da 30 millilitri.

Quindi, aggiungere un millilitro di DMSO. Successivamente, utilizzare una pipetta P2 impostata su due microlitri, per trasferire perle di circa 100 micron di diametro, in una goccia di 20 microlitri di solvente in un'altra capsula di Petri da 30 millilitri. Rimuovere la maggior parte del solvente con una pipetta da 20 microlitri e l'eventuale residuo di solvente con una pipetta da due microlitri.

Quindi, coprire le perle con 20 micro-litri del farmaco da applicare, sciolto in DMSO. Incubare le perle nella soluzione farmacologica per un'ora. Proteggi le perle dalla luce, poiché molte molecole di farmaci sono sensibili alla luce.

Per aiutare a visualizzare le perle, trasferire da quattro a cinque perle in due micro-litri di liquido, in 20 micro-litri di rosso fenolo al due per cento disciolto in acqua. Rimuovere una singola perlina con una pinza da orologiaio e sciacquare la perlina in PBS. Non lasciare le perle nella soluzione di rosso fenolo per più di 15 minuti prima di risciacquarle, poiché ciò può causare la perdita di attività.

Tagliare il filo di tungsteno sottile in lunghezze di tre o quattro centimetri Quindi, inserire un pezzo di filo, nell'estremità di una pipetta di vetro Pasteur e sciogliere in un bruciatore Bunsen per fissarlo in posizione. Prepara fino a 10 aghi per assicurarti che ci siano pezzi di ricambio se sono danneggiati. Quindi, posiziona l'estremità del filo in una fiamma ossidrica e tienila lì fino a quando il tungsteno non si illumina di bianco e la punta è affilata.

Questo richiede circa due o tre minuti. Aggiungi da cinque a sei gocce di inchiostro di china per artisti a 15 millilitri di PBS contenenti 100 unità di penicillina e 0,1 milligrammi di streptomicina per millilitro. Per preparare gli embrioni di pollo, incubare le uova con l'estremità smussata fino a raggiungere lo stadio desiderato per la maggior parte della manipolazione delle gemme degli arti, che in genere è da tre a cinque giorni.

Quando viene raggiunto il punto temporale desiderato, usa una pinza smussata per picchiettare l'estremità smussata dell'uovo e rompere il guscio. Quindi, usa la pinza per rimuovere il guscio ed esporre l'embrione. Assicurarsi che anche la membrana della cellula uovo sia rimossa.

Per visualizzare l'embrione, iniettare PBS integrato con alcune gocce di inchiostro di china per artisti, sotto l'embrione con una siringa da un millilitro e un ago calibro 21. La membrana vitellina sovrastante l'embrione può quindi essere rimossa con una pinza fine. Successivamente, aggiungi due o tre millilitri di un PBS integrato con l'uno per cento di siero fetale di vitello, 100 unità per millilitro di penicillina e 0,1 milligrammi per millilitro di streptomicina, nell'ovulo per assicurarti che l'embrione non si disidrati.

Utilizzando una pinza da orologiaio affilata, aprire l'amnio sulle gemme degli arti in via di sviluppo. In queste fasi, l'embrione in genere si gira, in modo che il lato destro sia più in alto. Assicurati che l'embrione non si secchi aggiungendo più della soluzione PBS integrata quando è necessario.

L'amnio che circonda l'embrione può essere aperto utilizzando un sottile ago di tungsteno per rivelare l'arto in via di sviluppo. Quindi, usa il filo di tungsteno affilato per praticare un'incisione nella gemma dell'arto dove verrà impiantata la perlina. Evitare di tagliare fino in fondo la gemma dell'arto, ove possibile.

Anche se nelle fasi più giovani, questo è difficile. Raccogli una perlina, rivestita con il fattore di crescita o con il farmaco usando una pinza da orologiaio extra fine. Se la perlina è stata imbevuta di DMSO o rosso fenolo, assicurati che venga risciacquata con PBS prima di applicarla all'embrione.

Trasferire la perlina sull'embrione usando la pinza, quindi utilizzare il filo di tungsteno affilato per inserire la perlina nella posizione dell'incisione. Aggiungere altri uno o due millilitri della soluzione PBS integrata all'ovulo per garantire che l'embrione sia mantenuto idratato. Evitare di applicare la soluzione direttamente sull'embrione stesso, in quanto ciò può danneggiare l'embrione e causare lo spostamento della perlina.

Successivamente, utilizzare una siringa da dieci millilitri, dotata di un ago calibro 19 per rimuovere solo la quantità di albumina necessaria per garantire che l'embrione non entri in contatto con il nastro utilizzato per sigillare l'ovulo. Assicurarsi che l'ago non danneggi il tuorlo, facendolo scorrere verso il basso all'interno del guscio. Infine, sigillate l'uovo con del nastro adesivo e rimettetelo nell'incubatrice.

Al fine di confermare che FGF18 è in grado di agire attraverso MEK per fosforilare ERK, gli embrioni sono stati raccolti un'ora dopo l'innesto della perlina e immunocolorati per la presenza di ERK fosforilata, che può essere vista intorno alla perlina innestata nell'immagine a destra. Allo stadio HH 21, MyoD non è espresso nei mioblasti degli arti in via di sviluppo. Sebbene la colorazione possa essere vista nel miotomo dei somiti in via di sviluppo.

Sei ore dopo un innesto di perline FGF18, MyoD può essere visto indotto nel mioblasto vicino alla perlina. Mentre non c'è espressione nell'arto controlaterale. Questa espressione può essere inibita mediante il co-innesto di una perlina, rivestita di un inibitore MEK come U0126.

Allo stesso modo, l'innesto di una perlina U0126 allo stadio HH 21 riduce l'espressione endogena di MyoD dopo 24 ore, rispetto all'arto controlaterale non trattato. Nelle gemme degli arti, allo stadio HH 19, FGF18 non induce MyoD. Tuttavia, il co-innesto di perle imbevute di FGF18 e di un antagonista dell'acido retinoico può superare questo problema e viene rilevata la MyoD ectopica.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre o quattro minuti, se eseguita correttamente. Lo sviluppo di questa tecnica ha permesso ai ricercatori nel campo della biologia dello sviluppo di esplorare i fattori di crescita che segnalano nello sviluppo embrionale. Quando si tenta questa tecnica, è importante ricordare di non lasciare che l'embrione si secchi.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come innestare le perline negli embrioni in via di sviluppo per determinare in che modo la segnalazione dei fattori di crescita influisce sullo sviluppo.