Name: Linnesto di Perline in via di sviluppo di pollo Limbs embrioni per identificare percorsi di trasduzione del segnale che influenzano lespressione genica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: Impara a innestare perline in arti embrionali di pollo per studiare fattori di crescita e inibitori. Questo metodo permette di analizzare l'espressione genica e le vie di segnale in vivo.

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Questo lavoro è stato in parte finanziato da un premio dell'Università di Nottingham per la carriera precoce a DS. RM è finanziato dal Comitato Superiore per lo Sviluppo dell'Istruzione dell'Iraq.

Etica Dichiarazione: Tutti questi esperimenti seguono la cura degli animali e le linee guida etiche del l&#39;Università di Nottingham. 1. Preparazione di Beads eparina per innesto <ol><li> Lavare accuratamente perle di eparina in PBS prima dell&#39;uso. Nota: Beads possono essere conservati a 4 ° C come una sospensione in PBS. <ol><li> Selezionare perline per innesto rimuovendoli dal magazzino con una pipetta 20 microlitri in una goccia 1 ml di PBS. Quindi utilizzare una micropipetta set a 2 ml di trasferire perle in un calo del 20 microlitri di PBS in una capsula di Petri 3 centimetri. Scegli perline in base alle dimensioni e, utilizzando un impianto stereo dissezione microscopio, trasferire perline selezionati con la punta della pipetta P2; quelli intorno a 100 micron di diametro sono l&#39;ideale. </li></ol></li><li> Rimuovere la PBS dalle perline. Rimuovere la maggior parte del liquido con una pipetta 20 microlitri e il liquido residuo per azione capillare con orologeria pinza sottile. Nota: È importante rimuovere il più possibile così la crescita factor non è diluito quando viene aggiunto ai talloni. </li><li> Pipettare il fattore di crescita direttamente sulle perline. Per FGF18 aggiungere 0,5 ml di FGF18 ricombinante ricostituito a 0,5 mg / ml in 0,1% di BSA in PBS. Mettere alcune gocce di acqua intorno ai bordi del piatto per evitare che il liquido da evaporare. </li><li> Incubare le perline per 1 ora a RT. Rimuovere le gocce d&#39;acqua dal piatto con una pipetta Pasteur e disporli sul ghiaccio pronta per l&#39;innesto. </li><li> In caso di necessità (per perle trasparenti) trasferimento 4-5 perle al 2% rosso fenolo prima di innesto per aiutarli a visualizzare. Risciacquare in PBS prima del trasferimento per l&#39;embrione. </li></ol> 2. Preparazione di AG Beads 1-X2 per innesto <ol><li> Prima dell&#39;uso derivatize perline con 0,2 N di acido formico. <ol><li> Per fare questo uso una spatola per trasferire perline in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Aggiungere 1 ml di 0,2 N di acido formico e lavare su una piattaforma di agitazione per 1 ora. </li><li> Quindi rimuovere l&#39;acido formico con una pipetta p1000 e sostituirlo con 1ml di acqua. Lavare per 1 ora e ripetere sei volte per rimuovere residuo acido formico. </li><li> Rimuovere il liquido residuo con una pipetta p1000 e conservare le perline a 4 ° C. Nota: Non è necessario rimuovere tutta l&#39;acqua residua in questa fase. </li></ol></li><li> Rimuovere una piccola pallina di perle di circa il 5-10 volumi microlitri dal magazzino con una piccola spatola in una capsula di Petri 3 centimetri e aggiungere 1 ml di DMSO (o qualsiasi solvente il farmaco è dissolto in). Nota: Questo dovrebbe fornire diverse centinaia di perline da cui selezionare quelli della giusta misura. </li><li> Quindi utilizzare una pipetta P2 impostata su 2 microlitri di trasferire perle di circa 100 micron di diametro per un calo del 20 ml di solvente in un altro piatto di Petri 3 centimetri. </li><li> Rimuovere il solvente con una pipetta 20 microlitri e qualsiasi solvente residuo con una pipetta 2 microlitri. Sostituire con 20 ml di farmaco da applicare. NOTA: Per coerenza sciogliere il farmaco ad una concentrazione di 100 mM in DMSO (o che mai è utilizzato solvente),un&#39;aliquota in 20 microlitri e conservare a -80 ° C, come alcuni piccoli inibitori molecolari sono instabili ed è meglio evitare ripetuti di congelamento-scongelamento. Se necessario diluire il farmaco alla concentrazione desiderata prima di ammollo perline. Concentrazioni efficaci possono avere bisogno di essere determinati empiricamente per ogni farmaco. </li><li> Incubare per 1 ora. Proteggere dalla luce come molti di queste molecole sono sensibile alla luce. </li><li> Prima innesto trasferimento 4-5 perle con una pipetta p2 impostato 2 microlitri in 20 ml di 2% di rosso fenolo disciolti in acqua. Eseguire questo passaggio usando un microscopio da dissezione stereo per visualizzare le perline. Rimuovere una singola goccia di orologiai pinza sottile o un cappio e risciacquare in PBS prima del trasferimento per l&#39;embrione. Non lasciare perline in 2% rosso fenolo per più di 15 minuti prima dell&#39;uso come questo può causare la perdita di attività. </li></ol> 3. Preparazione tungsteno aghi <ol><li> Tagliare multa filo di tungsteno in 3-4 cm di lunghezza. Inserire un pezzo di filo al fine diuna pipetta Pasteur di vetro e si fondono in un becco Bunsen per fissare in posizione. Preparare fino a 10 aghi per assicurare che non vi siano parti di ricambio se danneggiati durante l&#39;uso. </li><li> Posizionare l&#39;estremità del filo in una fiamma ossidrica e tenerla lì fino a quando il tungsteno diventa bianco e la punta è affilata (circa 2-3 minuti). Nota: Durante l&#39;uso l&#39;ago può essere pulito e ri-affilata nella fiamma ossidrica, se necessario. NOTA: Questi aghi possono essere utilizzati anche per creare dei cicli per il trasferimento di perline. Toccare delicatamente l&#39;ago per la panchina e si piega a formare un anello. </li></ol> 4. Gli embrioni Preparazione per Bead innesti <ol><li> Incubare le uova con l&#39;estremità smussata fino a quando non raggiungono lo stadio desiderato (3-5 giorni per la maggior parte le manipolazioni gemma arto). Utilizzando pinze smussato toccare la punta smussata per rompere il guscio e quindi utilizzare le pinze per rimuovere il guscio ed esporre l&#39;embrione. Assicurarsi che la membrana guscio d&#39;uovo viene rimosso anche. NOTA: 1-2 ml di soluzione salina può essere aggiunto con una pipetta Pasteur per assistere conquesto se la membrana aderisce al tuorlo. Pipetta delicatamente la PBS sulla superficie del tuorlo, afferrare la membrana con le pinze, facendo attenzione a non danneggiare il tuorlo, e tirare delicatamente via dall&#39;uovo. </li><li> Rimuovere fino a 5 ml di albume dall&#39;uovo con una siringa da 10 ml e un ago 19 G. Prendere solo quanto necessario per garantire l&#39;embrione non entrare in contatto con il nastro utilizzato per sigillare l&#39;uovo come rimozione di volumi più grandi in grado di ridurre i tassi di sopravvivenza degli embrioni. </li><li> Per visualizzare l&#39;embrione aggiungere un 5-6 gocce di artisti china a 15 ml di PBS contenente 100 U penicillina e 0,1 mg di streptomicina / ml. Iniettare 0,5-1 ml direttamente sotto l&#39;embrione con una siringa da 1 ml e un ago 25 G. </li><li> Aggiungere 2-3 ml di PBS 1% con siero fetale bovino e 100 U di penicillina e 0,1 mg di streptomicina / ml nell&#39;uovo di garantire l&#39;embrione non disidratarsi. Utilizzando affilate orologiai pinze rimuovere la membrana vitellina e aprire il sacco amniotico sulle gemme degli arti in via di sviluppo. Assicurarsi che l&#39;embrione non si secchi e, Se necessario, aggiungere altro PBS / FCS. NOTA: Le gemme degli arti può essere visto chiaramente come escrescenze appaiati sul fianco dell &#39;embrione. A queste fasi dell&#39;embrione girerà come il lato destro è normalmente superiore. Il risultato è normalmente più facile innestare perle nelle arti di destra e utilizzare quelli lasciati come controlli controlaterale. </li><li> Utilizzare un filo di tungsteno affilato per fare un&#39;incisione nella gemma arto dove sarà impiantato il tallone. Evitare di tagliare tutto il percorso attraverso la gemma arto, se possibile, anche se a fasi più giovani questo è difficile. NOTA: in embrioni più anziani (HH stadio 22 e sopra) è possibile selezionare specifiche regioni del bocciolo arto per l&#39;innesto, ma nelle fasi più giovani questo è più difficile come l&#39;arto gemma in sé è piccolo. E &#39;anche importante ricordare che la gemma arto crescerà oltre il tallone innestato così, soprattutto nelle fasi più giovani, il tallone rimarrà nell&#39;arto prossimale. </li><li> Prendete una perlina sia dal fattore di crescita o di droga utilizzando wa extra finetchmakers forcipe o un ciclo fatto da un ago di tungsteno. Se il cordone è stato immerso in uno DMSO o rosso fenolo, lavare in PBS prima di applicare per l&#39;embrione. Trasferire il tallone per l&#39;embrione con la pinza / cappio. Quindi utilizzare il filo di tungsteno affilato per inserire il tallone nell&#39;incisione. </li><li> Aggiungere 1-2 ml di PBS / FCS all&#39;uovo assicurare che l&#39;embrione è mantenuta idratata ma evitare di applicare direttamente sulla dell&#39;embrione stesso come questo può danneggiare gli embrioni e causare il tallone da sloggiato. Sigillare l&#39;uovo con nastro e tornare alla incubatrice. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

L&#39;utilizzo di innesti tallone applicati direttamente allo sviluppo di tessuti in ovo è un potente strumento per analizzare il ruolo del fattore di crescita di segnalazione durante lo sviluppo dando il controllo senza precedenti sopra lo stadio di sviluppo in cui vengono applicate e la durata dell&#39;esposizione. La scelta del cordone per ogni tipo di molecola è importante. Piccole molecole idrofobe, come gli inibitori qui descritte ed acido retinoico, di solito si legano bene al derivat...

Embrioni aviaria hanno fornito un potente strumento per lo studio di sviluppo per molti anni 1. Una delle loro caratteristiche più utili è che sono relativamente facili da manipolare. Sviluppo esterno consente di aprire l&#39;uovo per accedere l&#39;embrione ed eseguire varie micromanipolazioni con esempi come il sistema chimera quaglia-chick classico per lo studio il destino della cellula 2,3, l&#39;iniezione di retrovirus per sovraespressione in tessuti specifici durante lo sviluppo 4,5 e la cultura espianto di identificare le fonti di segnalazione di sviluppo 6. Più recentemente chimere generato tra gli host non etichettati con innesti da una linea pollo transgenici che esprimono GFP ha dimostrato che la combinazione di innesto classica e la modificazione genetica in grado di fornire importanti intuizioni sviluppo 7,8. La facilità con cui l&#39;embrione aviaria può essere manipolato ha reso un ottimo modello per lo studio degli artisviluppo 9. L&#39;applicazione di fattori di crescita specifici per gli arti in via di sviluppo in vivo è stato fondamentale per identificare i fattori che alterano arto patterning 10,11 e continua a fornire intuizioni in questo processo 12. Questo approccio è stato utilizzato anche per studiare i fattori che regolano lo sviluppo muscolare e ha scoperto ruoli per numerosi segnali, come Wnts 13, BMP 14 e HGF 15. Recentemente questa tecnica è stata utilizzata per studiare i segnali che controllano l&#39;espressione genica myogenic sul nascere degli arti e ha dimostrato che le interazioni tra FGF18 e acido retinoico può controllare i tempi di espressione MyoD 16. Usando una combinazione di fattori di crescita e piccole molecole che possono essere caricati su perline e poi innestate direttamente nei tessuti specifici a stadi di sviluppo definiti dà la possibilità di intervenire in quasi ogni momento e regione durante lo sviluppo. Questo è stato usato per investigate molti processi tra cui somite patterning 17,18, specificazione neurale 19, neural crest migrazione 20 e l&#39;estensione dell&#39;asse 21. Qui si descrive un metodo per perline imbevute di entrambi i fattori di crescita o inibitori nello sviluppo di arti di pollo innesto. Questo è stato utilizzato per determinare gli effetti di questi segnali su miogenesi analizzando muscolo espressione genica specifica con ibridazione in situ. Descriviamo innesti utilizzando eparina imbevuto perline, che sono utilizzati per fattori di crescita, o perline AG 1-X2 per piccole molecole idrofobe quali acido retinoico o piccole molecole inibitrici di vie di segnalazione specifici. Tuttavia altre perle sono disponibili che sono stati utilizzati per fornire sia FGFs 22 e 23 anche Shh.

<table><tbody><tr><td>Perle acriliche di eparina</td><td>Sigma</td><td>H5263</td><td>Le perle acriliche-epariche utilizzate sono state interrotte. Tuttavia è disponibile un prodotto sostitutivo, perline di agarosio eparina, gatto n. H6508. Questi sono trasparenti, quindi più difficili da lavorare, ma possono essere macchiati con rosso fenolo allo stesso modo delle perle AG 1-X2,</td></tr> <tr><td>perline AG 1-X2</td><td>Bio-Rad</td><td>140-1231</td><td></td></tr><tr><td>Affi Gel perline blu</td><td>Bio-Rad</td><td>153-7301; 153-7302</td><td>Queste perle sono state utilizzate con una gamma di fattori di crescita tra cui Shh e FGF e possono essere utilizzate per sostituire le perle di eparina</td></tr><tr><td>FGF18</td><td>Peprotech</td><td>100-28</td><td>Risospendere in PBS con 0/1% di BSA, preparare aliquote monouso da 0,5-1ul e conservare a -80°C. I lotti e i fornitori possono variare, quindi è necessario testare concentrazioni diverse per determinare una dose efficace.</td></tr><tr><td>U0126</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>9903</td><td>Produrre a 20mM in DMSO e conservare in aliquote monouso a -80 °C. Proteggere dalla luce.</td></tr><tr><td>BMS-493</td><td>Tocris Biosciences</td><td>3509</td><td>Risospendere in DMSO e conservare in aliquote monouso a -80 °C. Proteggere dalla luce.</td></tr><tr><td>Inchiostro di china nero</td><td>Windsor e Newton</td><td>5012572003384 (30 ml)</td><td>Sebbene siano disponibili alternative a questo prodotto, è necessario prestare attenzione poiché alcuni inchiostri sono tossici per gli embrioni</td></tr><tr><td>Filo di tungsteno, diametro 0,1 mm 99,95%</td><td>Alfa Aesar</td><td>10404</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina / streptomicina</td><td>Sigma</td><td>P0781</td><td>Diluire 100X in PBS/inchiostro e PBS/FCS</td></tr></tbody></table>

l&#39;innesto di perline in via di sviluppo di pollo limbs embrioni per identificare percorsi di trasduzione del segnale che influenzano l&#39;espressione genica

Grafting of Beads into Developing Chicken Embryo Limbs to Identify Signal Transduction Pathways Affecting Gene Expression

Usando embrioni di pollo è possibile testare direttamente gli effetti delle due fattori di crescita o inibitori specifici di vie di segnalazione di espressione genica e attivazione di vie di trasduzione del segnale. Questa tecnica permette la consegna di molecole di segnalazione in stadi di sviluppo ben definiti per i tempi specifici. Dopo questo embrioni possono essere raccolte e l&#39;espressione genica esaminati, ad esempio in situ ibridazione, o l&#39;attivazione di vie di trasduzione del segnale osservato con immunocolorazione. In questo video di eparina perline imbevuti di FGF18 o AG perline 1-X2 imbevute di U0126, un inibitore di MEK, si innestano nel bocciolo arto in ovo. Questo dimostra che FGF18 induce l&#39;espressione di MyoD e ERK fosforilazione e espressione MyoD sia endogena e FGF18 indotta è inibito dalla U0126. Perline imbevuto di un antagonista dell&#39;acido retinoico possono potenziare l&#39;induzione prematura MyoD da FGF18. Questo approccio può essere noied una vasta gamma di fattori di crescita e inibitori e si adatta facilmente ad altri tessuti embrioni.

Nella fase HH 21 MyoD non è espresso in mioblasti sviluppo arto sebbene colorazione può essere visto in myotome dei somiti sviluppo (Figura 1A). Figura 1B mostra ibridazione in situ per MyoD 6 ore dopo un innesto FGF18 tallone. MyoD è indotta in mioblasti vicino al tallone, mentre non vi è alcuna espressione nell&#39;arto controlaterale. Co-innestando un branello imbevuto U0126, un inibitore specifico di MEK, induzione blocchi FGF18 di MyoD (Figura 1C). Allo st...

Innestando perline imbevute di fattori di crescita o inibitori specifici delle vie di segnalazione negli embrioni in via di sviluppo, è possibile testare direttamente i loro effetti in vivo. In questo protocollo, le perle vengono innestate nella gemma dell'arto per determinare gli effetti di queste molecole sull'espressione genica e sulla trasduzione del segnale.

L&#39;innesto di Perline in via di sviluppo di pollo Limbs embrioni per identificare percorsi di trasduzione del segnale che influenzano l&#39;espressione genica

Using chicken embryos it is possible to test directly the effects of either growth factors or specific inhibitors of signaling pathways on gene expression ...

L'obiettivo generale di questo procedimento è mostrare come determinare gli effetti di fattori di crescita e inibitori sull'espressione genica degli arti in via di sviluppo nell'embrione di pollo. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nella biologia dello sviluppo, come ad esempio in che modo le molecole di segnale influenzano la crescita e la differenziazione delle cellule in vivo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce un metodo per testare direttamente questi fattori nell'embrione.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sullo sviluppo degli arti, può anche essere applicato ad altri sistemi, come il tessuto neurale, i somiti o la gastrulazione. A dimostrare la procedura sarà Rebeea Mohammed, una studentessa laureata del mio laboratorio. Per iniziare, trasferire un millilitro delle perle dalla soluzione stock originale in un tubo nuovo.Lasciare depositare le perle, quindi rimuovere il liquido e sostituirlo con un millilitro di PBS. Ripetere questo passaggio cinque volte e conservare le perle lavate a quattro gradi Celsius, sotto forma di sospensione in PBS. Selezionare le perle per l'innesto, prelevandole dalla soluzione lavata con una pipetta da 20 microlitri e ponendole in un millilitro di PBS.Utilizzando un microscopio stereoscopico, selezionare le perline con un diametro di circa 100 micron. Trasferire le perline selezionate in due microlitri di liquido in una nuova piastra di Petri contenente una goccia di 20 millilitri di PBS. Successivamente, rimuovere il PBS dalle perline. Prima, utilizzando una pipetta da 20 microlitri, quindi rimuovere il liquido residuo per azione capillare usando una pinzetta da orologiaio fine.È importante rimuovere la maggior quantità possibile di liquido in modo che il fattore di crescita non venga diluito quando aggiunto alle perle. Pipettare il fattore di crescita direttamente sulle perle. Per il FGF18, aggiungere 0,5 microlitri di FGF18 ricombinante, ricostituito a 0,5 milligrammi per millilitro in PBS con lo 0,1 percento di BSA.Quindi, aggiungere alcune gocce di acqua lungo i bordi della piastra per evitare che il liquido evapori. Una volta pronto, incubare le perle per un'ora a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, rimuovere le gocce d'acqua dalla piastra utilizzando una pipetta di Pasteur e posizionare la piastra sul ghiaccio.Derivatizzare le perle, trasferendo innanzitutto le perle in una provetta microcentrifuga da 1,5 millilitri utilizzando una spatola. Quindi, aggiungere un millilitro di acido formico 0,2 N e incubare le perle nell'acido su una piattaforma agitata per un'ora. Successivamente, lasciare sedimentare le perle, rimuovere l'acido formico e sostituirlo con un millilitro di acqua.Lavare le perle per un'ora sulla piattaforma agitatrice e ripetere il lavaggio sei volte per rimuovere qualsiasi traccia residua di acido formico. Dopo l'ultimo lavaggio, rimuovere il liquido rimanente e conservare le perle a quattro gradi Celsius. Utilizzare una spatola per prelevare una piccola porzione di perle di volume compreso tra cinque e dieci microlitri dalla soluzione madre e posizionare le perle in una piastra di Petri da 30 millilitri.Quindi, aggiungere un millilitro di DMSO. Successivamente, utilizzare una pipetta P2 impostata su due microlitri per trasferire delle perle di diametro approssimativo di 100 micron in una goccia di solvente da 20 microlitri in un'altra piastra di Petri da 30 millilitri. Rimuovere la maggior parte del solvente con una pipetta da 20 microlitri e qualsiasi solvente residuo con una pipetta da due microlitri.Quindi, coprire le perle con 20 microlitri del farmaco da applicare, disciolto in DMSO. Incubare le perle nella soluzione di farmaco per un'ora. Proteggere le perle dalla luce, poiché molte molecole farmaceutiche sono sensibili alla luce.Per facilitare la visualizzazione delle perle, trasferirne da quattro a cinque in due microlitri di liquido in 20 microlitri di rosso fenolo al due percento disciolto in acqua. Rimuovere una singola perla con pinzette fini da orologiaio e risciacquare la perla in PBS. Non lasciare le perle nella soluzione di rosso fenolo per più di 15 minuti prima del risciacquo, poiché ciò può causare una perdita di attività.Tagliare il filo sottile di tungsteno in pezzi lunghi da tre a quattro centimetri. Inserire quindi un pezzo del filo all'estremità di una pipetta di vetro di Pasteur e farlo fondere con un becco di Bunsen per fissarlo in posizione. Preparare fino a 10 aghi per assicurarsi di avere pezzi di ricambio nel caso in cui si danneggino. Successivamente, posizionare l'estremità del filo nella fiamma di un cannello e mantenerla finché il tungsteno non diventa incandescente di colore bianco e la punta non diventa affilata.Questa operazione richiede circa due o tre minuti. Aggiungere da cinque a sei gocce di inchiostro da disegno a 15 millilitri di PBS contenente 100 unità di penicillina e 0,1 milligrammi di streptomicina per millilitro. Per preparare gli embrioni di pollo, incubare le uova con l'estremità arrotondata verso l'alto fino a quando raggiungono lo stadio desiderato per la maggior parte delle manipolazioni dei gemmi degli arti, che di solito è di tre a cinque giorni.Quando si raggiunge il punto temporale desiderato, utilizzare pinze smussate per battere sull'estremit&agrave; smussata dell'uovo e rompere il guscio. Successivamente, utilizzare le pinze per rimuovere il guscio ed esporre l'embrione. Assicurarsi che venga rimossa anche la membrana cellulare dell'uovo.Per visualizzare l'embrione, iniettare PBS integrato con alcune gocce di inchiostro da disegno, sotto l'embrione utilizzando una siringa da un millilitro e un ago da 21 gauge. Quindi, la membrana vitellina sovrastante l'embrione può essere rimossa con pinzette fini. Successivamente, aggiungere due-tre millilitri di PBS supplementato con l'uno percento di siero fetale bovino, 100 unità per millilitro di penicillina e 0,1 milligrammi per millilitro di streptomicina all'interno dell'uovo per assicurarsi che l'embrione non si disidrati.Utilizzando pinzette affilate da orologiaio, aprire l'amnios sopra gli abbozzi degli arti in via di sviluppo. In questi stadi, l'embrione di solito si gira in modo che il lato destro risulti superiore. Assicurarsi che l'embrione non si secchi aggiungendo ulteriore soluzione PBS supplementata quando necessario.L'amnios che circonda l'embrione può essere aperto utilizzando un sottile ago di tungsteno per esporre l'arto in via di sviluppo. Successivamente, utilizzare il filo di tungsteno affilato per praticare un'incisione nel rigonfiamento dell'arto nel punto in cui verrà impiantata la perlina. Evitare, se possibile, di tagliare completamente attraverso il rigonfiamento dell'arto.Sebbene in stadi più giovani ciò sia difficile, prendere un’albuletta rivestita con il fattore di crescita o il farmaco utilizzando pinzette finissime da orologiaio. Se l’albuletta è stata immersa in DMSO o in rosso fenolo, assicurarsi che venga risciacquata con PBS prima di applicarla all’embrione.Trasferire la perlina all'embrione utilizzando la pinzetta e quindi inserirla nel sito dell'incisione con il filo di tungsteno appuntito. Aggiungere un ulteriore uno o due millilitri della soluzione PBS supplementata nell'uovo per assicurare che l'embrione rimanga idratato. Evitare di applicare la soluzione direttamente sull'embrione stesso, poiché ciò potrebbe danneggiarlo e causare lo spostamento della perlina.Successivamente, utilizzare una siringa da dieci millilitri, dotata di un ago da 19 gauge, per rimuovere solo l’albumina necessaria a garantire che l’embrione non entri in contatto con il nastro utilizzato per sigillare l’uovo. Assicurarsi che l’ago non danneggi il tuorlo, facendolo scivolare lungo l’interno del guscio. Infine, sigillare l’uovo con del nastro e riposizionarlo nell’incubatrice.Per confermare che FGF18 è in grado di agire attraverso MEK per fosforilare ERK, gli embrioni sono stati prelevati un'ora dopo il trapianto della perla e sottoposti a immunomarcatura per rilevare la presenza di ERK fosforilato, che può essere osservato attorno alla perla trapiantata nell'immagine a destra. Allo stadio HH 21, MyoD non è espresso nei mioblasti in via di sviluppo degli arti. Sebbene la marcatura possa essere osservata nel miotomo dei somiti in formazione.Sei ore dopo un innesto di perle con FGF18, si può osservare l'induzione di MyoD nei mioblasti vicini alla perla, mentre non vi è alcuna espressione nell'arto controlaterale. Questa espressione può essere inibita innestando contemporaneamente una perla ricoperta di un inibitore della MEK, come U0126.In modo simile, innestare una perla con U0126 allo stadio HH 21 riduce l'espressione endogena di MyoD dopo 24 ore, rispetto all'arto controlaterale non trattato. Nei gemmuli degli arti, allo stadio HH 19, FGF18 non induce MyoD. Tuttavia, l'innesto congiunto di perle imbevute di FGF18 e di un antagonista dell'acido retinoico può superare questo ostacolo, e si rileva MyoD ectopico.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre o quattro minuti, se effettuata correttamente. Lo sviluppo di questa tecnica ha permesso ai ricercatori nel campo della biologia dello sviluppo di esplorare i segnali dei fattori di crescita durante lo sviluppo dell'embrione. Nel tentativo di applicare questa tecnica, è importante ricordare di non far seccare l'embrione.Dopo aver guardato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come innestare perline in embrioni in via di sviluppo per determinare in che modo il segnale dei fattori di crescita influisce sullo sviluppo.

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Visualizzare e accedere all'embrione di pollo durante lo sviluppo può essere impegnativo. Abbiamo sviluppato un metodo ex ovo che è semplice, economico e può essere facilmente utilizzato in classe o in un ambiente di ricerca. Questo metodo consente l'accesso all'embrione nelle fasi avanzate dello sviluppo embrionale (HH 40).

Ottimizzato Ex-ovo Coltura di Chick embrioni a stadi avanzati di sviluppo

Qui segnaliamo la doppia etichettatura delle cellule della cresta neurale e dei vasi sanguigni utilizzando l'innesto intraspecie del tubo neuraleGFP del pulcino combinato con l'iniezione di DiI intra-vascolare. Questa tecnica sperimentale ci permette di visualizzare e studiare contemporaneamente lo sviluppo del sistema nervoso derivato dall'NCC (enterico) e del sistema vascolare, durante l'organogenesi.

Doppia etichettatura delle cellule della cresta neurale e dei vasi sanguigni all'interno degli embrioni di pollo utilizzando l'innesto del tubo neuraleGFP del pulcino e l'iniezione di colorante carbocianina

Il pesce zebra è un eccellente sistema modello per studi genetici e di sviluppo. L'impianto di perline è una preziosa tecnica di manipolazione dei tessuti che può essere utilizzata per interrogare i meccanismi di sviluppo introducendo alterazioni negli ambienti cellulari locali. Questo protocollo descrive come eseguire l'impianto di microsfere nell'embrione di zebrafish.

Microperla impianto nel zebrafish

Vengono descritti protocolli che utilizzano barriere impermeabili per bloccare gli eventi di induzione tra i tessuti dell'asse principale del corpo e il fianco nell'embrione di pollo necessari per la formazione degli arti. Le perle imbevute di segnali induttivi candidati vengono utilizzate per superare l'effetto del posizionamento della barriera e l'analisi dell'espressione genica lo conferma.

L&#39;applicazione di barriere impermeabili combinati con un fattore di Candidato Perle Soaked per studiare i segnali induttivi nel Chick

Gli arti ricombinanti sono un potente modello sperimentale che consente di studiare il processo di differenziazione cellulare e la generazione di modelli sotto l'influenza di segnali embrionali. Questo protocollo presenta un metodo dettagliato per generare arti ricombinanti con cellule mesodermiche di pollo, adattabili ad altri tipi di cellule ottenute da organismi diversi.

Test degli arti ricombinanti di pollo per comprendere la morfogenesi, i modelli e i primi passi nella differenziazione cellulare

Il test del tallone imbevuto prevede la consegna mirata del reagente di prova in qualsiasi momento dello sviluppo per studiare la regolazione della differenziazione cellulare e della morfogenesi. Viene presentato un protocollo dettagliato, applicabile a qualsiasi modello animale sperimentale, per preparare tre diversi tipi di perline imbevute e impiantarle nell'interdigit di un embrione di pollo.

Analisi della differenziazione cellulare, della morfogenesi e del pattern durante l'embriogenesi del pollo utilizzando il test Soaked-Bead

Impara a innestare perline in arti embrionali di pollo per studiare fattori di crescita e inibitori. Questo metodo permette di analizzare l'espressione genica e le vie di segnale in vivo.

Linnesto di Perline in via di sviluppo di pollo Limbs embrioni per identificare percorsi di trasduzione del segnale che influenzano lespressione genica (Video) | JoVE Journal

L'innesto di Perline in via di sviluppo di pollo Limbs embrioni per identificare percorsi di trasduzione del segnale che influenzano l'espressione genica

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