Optogenetic risonanza magnetica funzionale

L'obiettivo generale di questa procedura di imaging è combinare la F-MRI con la stimolazione optogenetica per la mappatura specifica del tipo di cellula dei circuiti neurali funzionali e delle loro dinamiche in tutto il cervello vivente. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle neuroscienze, come determinare il ruolo di specifici elementi del circuito cerebrale nel guidare l'attività cerebrale globale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la stimolazione specifica del tipo di cellula e la lettura di una risoluzione spaziale relativamente alta dell'attività cerebrale globale.

A dimostrare questa procedura saranno Jia Liu e Zhongnan Fang, studenti laureati nel mio laboratorio. Dopo aver anestetizzato l'animale come descritto nel protocollo di testo, radere la testa con un rasoio elettrico ed eseguire un triplo scrub chirurgico sulla pelle utilizzando Betadine e un risciacquo con etanolo al 70%. Successivamente, immobilizzare il cranio dell'animale in un apparato stereotassico.

Usa un bisturi per praticare un'incisione del cuoio capelluto di 15-20 millimetri. Ritrarre il cuoio capelluto utilizzando emostatici chirurgici attaccati al periostio. Identifica le posizioni Lambda e Bregma sul cranio, quindi posiziona la punta del trapano sulla regione di interesse, o ROI.

Praticare una piccola craniotomia sul ROI con un trapano dentale, facendo attenzione a non perforare il cervello. Inserire lentamente un ago attaccato alla siringa da microlitro attraverso la craniotomia nel ROI nel cervello. Quindi utilizzare un controller per microsiringa per iniettare due microlitri della soluzione vettoriale nel ROI.

Al termine dell'iniezione, attendere 10 minuti, quindi rimuovere lentamente la siringa a una velocità di 0,5 millimetri al minuto. Dopo l'iniezione, asciugare la superficie del cranio. Confermare le coordinate per il ROI e inserire l'impianto della boccola alla profondità target a una velocità di 0,5 millimetri al minuto.

Infine, montare l'impianto della ghiera sul cranio utilizzando il cemento dentale. Dopo che il cemento dentale si è solidificato, sigillare l'incisione con punti di sutura attorno al tappo di cemento dentale. Inizia collegando il cavo patch in fibra ottica a una sorgente di luce laser e misura l'uscita sulla punta del cilindro del cavo patch con un misuratore di potenza.

Regolare il livello di potenza appropriato per produrre l'uscita desiderata sulla punta del cavo in fibra ottica, che viene impiantato all'interno del cervello. Prevenire la fuoriuscita di luce dall'impianto coprendo gli occhi dell'animale. Quindi, posiziona la bobina sopra la testa dell'animale.

Utilizzare un manicotto della ghiera per tenere il cavo in fibra ottica all'impianto della ghiera. Inserire la culla con l'animale nel foro dello scanner. Monitorare la frequenza respiratoria, la CO2 corrente e la temperatura corporea durante l'esperimento regolando il ventilatore artificiale per mantenere i valori fisiologici entro i limiti adeguati.

Collegare i cavi BNC dalla porta di attivazione dello scanner MRI al generatore di funzioni. Selezionare una sequenza di posizionamento e fare clic su scansione'nella finestra operativa. Fare clic su continua' per visualizzare la posizione della testa dell'animale.

Se il cervello non è all'isocentro, regolare la posizione della testa dell'animale e ripetere la scansione di posizionamento fino a quando il cervello non si trova all'isocentro. Acquisire un'immagine anatomica ad alta risoluzione per verificare l'integrità complessiva del cervello e per confermare la posizione dell'impianto in fibra ottica. Quindi, seleziona una sequenza ponderata T2.

Regolare il numero di sezioni, quindi fare clic su scansione'per acquisire le immagini anatomiche coronali ad alta risoluzione pesate in T2. Infine, selezionare una sequenza di eco richiamata con gradiente multi-slice, quindi fare clic su continua' per acquisire l'immagine funzionale. Questo protocollo utilizza la F-MRI optogenetica per stimolare la corteccia motoria in un modello animale.

Questa mappa di attivazione mostra i voxel attivati nella corteccia motoria e nel talamo, indicando connessioni sinaptiche a lungo raggio tra queste regioni. Qui, il segnale in grassetto viene mostrato per i voxel attivi nella corteccia motoria e nel talamo durante la stimolazione optogenetica della corteccia motoria. La funzione di risposta emodinamica talamica mostra una risposta ritardata rispetto alla risposta nella corteccia motoria dopo la stimolazione.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire interventi chirurgici di impianto e risonanza magnetica funzionale optogenetica. Una volta padroneggiata, questa procedura di imaging può essere completata in due ore. Durante il tentativo di questa procedura, è molto importante monitorare l'animale e mantenere la sua fisiologia entro i limiti normali.

Seguendo questa procedura, possono essere utilizzati metodi complementari, come l'elettrofisiologia per studiare le dinamiche temporali della neuroattività, o l'immunoistochimica per convalidare l'espressione e la specificità dell'opsina. Lo sviluppo di questa tecnica ha aperto la strada ai neuroscienziati per studiare la connettività funzionale in un cervello intatto e vivente. Non dimenticare che lavorare con uno scanner MRI può essere estremamente pericoloso.

Precauzioni come tenere l'apparecchiatura magnetica sufficientemente lontana dallo scanner devono essere sempre prese durante l'esecuzione di questa procedura.