Optogenetic risonanza magnetica funzionale
19 aprile 2016
Questo protocollo descrive i passaggi e l'analisi dei dati necessari per eseguire con successo la risonanza magnetica funzionale optogenetica (ofMRI). ofMRI è una nuova tecnica che combina la lettura fMRI ad alto campo con la stimolazione optogenetica, consentendo la mappatura specifica del tipo di cellula dei circuiti neurali funzionali e delle loro dinamiche in tutto il cervello vivente.
L'obiettivo generale di questa procedura di imaging è combinare la fMRI con la stimolazione optogenetica per la mappatura, specifica per tipo cellulare, di circuiti neurali funzionali e delle loro dinamiche in tutto il cervello vivente. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo delle neuroscienze, come determinare il ruolo di specifici elementi dei circuiti cerebrali nel guidare l'attività cerebrale globale. Il principale vantaggio di questa tecnica è che permette una stimolazione specifica per tipo cellulare e un'acquisizione con risoluzione spaziale relativamente alta dell'attività cerebrale globale.
Dimostreranno questa procedura Jia Liu e Zhongnan Fang, studenti laureati nel mio laboratorio. Dopo aver anestetizzato l'animale come descritto nel protocollo testuale, rasare il capo con un rasoio elettrico ed eseguire un'antisepsi chirurgica tripla sulla cute utilizzando Betadine e un risciacquo con etanolo al 70%. Successivamente, immobilizzare il cranio dell'animale in un apparato stereotassico.
Utilizzare un bisturi per praticare un'incisione mediana nel cuoio capelluto lunga da 15 a 20 millimetri. Ritrarre il cuoio capelluto utilizzando emostati chirurgici applicati al periostio. Individuare le posizioni di Lambda e Bregma sul cranio, quindi posizionare la punta del trapano sulla regione di interesse, o ROI.
Praticare una piccola craniotomia sopra l'area di interesse (ROI) utilizzando un trapano dentale, avendo cura di non perforare il cervello. Inserire lentamente un ago collegato alla siringa microlitrica attraverso la craniotomia fino all'area di interesse (ROI) nel cervello. Quindi utilizzare un controllore della microsiringa per iniettare due microlitri della soluzione vettoriale nell'area di interesse (ROI).
Al termine dell'iniezione, attendere 10 minuti, quindi rimuovere lentamente la siringa a una velocità di 0,5 millimetri al minuto. Dopo l'iniezione, asciugare la superficie del cranio. Verificare le coordinate per la regione di interesse (ROI) e inserire il connettore fino alla profondità target a una velocità di 0,5 millimetri al minuto.
Infine, fissare l'inserto al cranio utilizzando cemento dentale. Dopo che il cemento dentale si è solidificato, chiudere l'incisione con punti di sutura intorno al cappuccio di cemento dentale. Iniziare collegando il cavo patch in fibra ottica a una sorgente luminosa laser e misurare l'uscita alla punta del barile del cavo patch mediante un misuratore di potenza.
Regolare il livello di potenza appropriato per produrre l'output desiderato alla punta del cavo in fibra ottica, che è impiantato all'interno del cervello. Evitare la fuoriuscita di luce dall'impianto coprendo gli occhi dell'animale. Successivamente, posizionare la bobina sopra la testa dell'animale.
Utilizzare un manicotto di ferrula per fissare il cavo in fibra ottica all'impianto di ferrula. Inserire il supporto con l'animale all'interno del foro dello scanner. Monitorare la frequenza respiratoria, la CO2 espiratoria e la temperatura corporea per tutta la durata dell'esperimento, regolando il ventilatore artificiale in modo da mantenere i valori fisiologici entro limiti appropriati.
Collegare i cavi BNC dalla porta di trigger dello scanner MRI al generatore di funzioni. Selezionare una sequenza di posizionamento e fare clic su "scansione" nella finestra di operazione. Fare clic su "continua" per acquisire l'immagine della posizione della testa dell'animale.
Se il cervello non si trova all'isocentro, regolare la posizione della testa dell'animale ed eseguire nuovamente la scansione di posizionamento finché il cervello non viene centrato all'isocentro. Acquisire un'immagine anatomica ad alta risoluzione per verificare l'integrità complessiva del cervello e confermare la posizione dell'impianto della fibra ottica. Successivamente, selezionare una sequenza pesata in T2.
Regolare il numero di fette, quindi fare clic su "scan" per acquisire le immagini anatomiche coronali ad alta risoluzione pesate in T2. Infine, selezionare una sequenza eco-gradientale multi-fetta, quindi fare clic su "continue" per acquisire l'immagine funzionale. Questo protocollo utilizza la fMRI optogenetica per stimolare la corteccia motoria in un modello animale.
Questa mappa di attivazione mostra i voxel attivati nella corteccia motoria e nel talamo, indicando connessioni sinaptiche a lungo raggio tra queste regioni. Qui, il segnale BOLD è mostrato per i voxel attivi nella corteccia motoria e nel talamo durante la stimolazione optogenetica della corteccia motoria. La funzione di risposta emodinamica talamica mostra una risposta ritardata rispetto alla risposta nella corteccia motoria dopo la stimolazione.
Dopo aver visionato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire interventi chirurgici di impianto e di come effettuare l'imaging funzionale magnetico ottogenetico. Una volta acquisita padronanza, questa procedura di imaging può essere completata in due ore. Durante il tentativo di eseguire questa procedura, è molto importante monitorare l'animale e mantenere la sua fisiologia entro i limiti normali.
Al termine di questa procedura, possono essere utilizzati metodi complementari, come l'elettrofisiologia per studiare la dinamica temporale dell'attività neuronale, o l'immunohistochimica per confermare l'espressione e la specificità dell'opsina. Lo sviluppo di questa tecnica ha aperto la strada ai neuroscienziati per indagare la connettività funzionale in un cervello intatto e vivente. Non dimenticare che lavorare con uno scanner MRI può essere estremamente pericoloso.
Precauzioni come mantenere l'equipaggiamento magnetico sufficientemente lontano dallo scanner devono essere sempre adottate durante l'esecuzione di questa procedura.
Panoramica
Questo protocollo descrive la procedura e l'analisi dei dati per l'esecuzione di risonanza magnetica funzionale ottogenetica (ofMRI), una tecnica che integra fMRI ad alto campo con stimolazione ottogenetica. Questo metodo consente ai ricercatori di mappare circuiti neurali funzionali e le loro dinamiche nei cervelli viventi con specificità per tipo cellulare.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Neuroscienze
- Tecniche di imaging
- Optogenetica
Sfondo
- l'ofMRI combina la fMRI con la stimolazione optogenetica.
- Questa tecnica permette una mappatura precisa dei circuiti neurali.
- Risponde a domande fondamentali sulle funzioni dei circuiti cerebrali.
- Un vantaggio significativo di questo metodo è l'elevata risoluzione spaziale.
Scopo dello studio
- Dimostrare l'utilizzo della ofMRI per lo studio dei circuiti neurali.
- Fornire un protocollo dettagliato per i ricercatori.
- Evidenziare l'importanza del monitoraggio dei parametri fisiologici durante la procedura.
Metodi Utilizzati
- Preparazione dell'animale e anestesia.
- Craniotomia e iniezione della soluzione vettoriale nel cervello.
- Implantazione del cavo in fibra ottica e collegamento a una sorgente laser.
- Utilizzo dello scanner MRI per l'acquisizione di immagini e dati.
Risultati principali
- Le mappe di attivazione mostrano le connessioni tra la corteccia motoria e il talamo.
- È stata dimostrata una risposta emodinamica ritardata nel talamo.
- Implementazione riuscita della stimolazione optogenetica durante l'imaging.
- La procedura può essere completata in circa due ore.
Conclusioni
- l'ofMRI è uno strumento prezioso per lo studio della connettività funzionale nel cervello.
- Il mantenimento della fisiologia animale è cruciale durante la procedura.
- Metodi complementari possono migliorare la comprensione della dinamica dell'attività neurologica.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La risonanza magnetica funzionale ottogenetica (ofMRI) consente l'interrogazione specifica per tipo cellulare di circuiti neurali con risoluzione spaziale a livello dell'intero cervello, supportando la validazione degli obiettivi nella scoperta di farmaci neuropsichiatrici. Collegando una manipolazione precisa dei circuiti a letture dell'attività cerebrale globale, il metodo migliora la riduzione del rischio meccanicistico e la fiducia predittiva nelle ipotesi sugli obiettivi nelle fasi iniziali. Questa capacità facilita la selezione del portafoglio chiarificando la connettività funzionale rilevante per i modelli di malattia e i meccanismi terapeutici.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di specifici elementi dei circuiti cerebrali nel determinare l'attività globale, supportando la verifica di ipotesi terapeutiche.
- Valore operativo: Fornisce una stimolazione specifica per tipo cellulare con un'acquisizione ad alta risoluzione spaziale della dinamica cerebrale.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera mappe di attivazione che mostrano connessioni sinaptiche a lungo raggio, come quelle tra corteccia motoria e talamo, per la progettazione di saggi basati su circuiti.
- Valore operativo: Fornisce misurazioni quantitative del segnale BOLD che consentono il confronto tra condizioni di stimolazione e risposte della rete.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Supporta la modellizzazione di sistemi rilevanti per le malattie mappando la connettività funzionale in cervelli viventi integri in condizioni sane e patologiche.
- Valore operativo: Favorisce la continuità dalla scoperta alla validazione preclinica mediante imaging non invasivo e ripetibile dell'attività neuronale.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nella biologia della scoperta permettendo la verifica di ipotesi sulla funzione dei circuiti, negli screening tramite uscite quantitative pronte per i saggi e nella ricerca traslazionale attraverso mappature connettomiche rilevanti per le malattie.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi, la chiarificazione dei percorsi e la riduzione del rischio biologico dei bersagli neurali.
- Screening: Fornisce standardizzazione dei saggi, riproducibilità e letture quantitative BOLD per la valutazione dei composti.
- Analisi: Produce dati sulla funzione di risposta emodinamica e mappe di attivazione per confrontare l'attivazione dei circuiti in diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica attraverso il monitoraggio dell'intero cervello in modelli di malattia.
- Riutilizzo aziendale: Rappresenta una piattaforma riutilizzabile per la validazione di bersagli basati su circuiti in diversi programmi di scoperta nel campo delle neuroscienze.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva, validazione degli obiettivi, riduzione dell'ambiguità meccanicistica nelle ipotesi basate su circuiti.
- Valore operativo: Standardizzazione, riproducibilità e scalabilità della mappatura dell'attivazione cerebrale specifica per circuito.
- Valore strategico: Decisioni più efficaci di proseguimento/cessazione, efficienza del capitale e riduzione del rischio biologico in fase avanzata nei programmi neuropsichiatrici.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione e decisioni di avanzamento corrette per rischio basate sull'interazione con il bersaglio a livello di circuito.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specialistiche in neuroscienze, optogenetica e fisica della risonanza magnetica per l’impianto chirurgico e l’acquisizione delle immagini.
- Necessita di uno scanner RM ad alto campo, una sorgente di luce laser, impianti in fibra ottica e sistemi di monitoraggio fisiologico.
- Richiede standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per i protocolli chirurgici, i parametri di somministrazione della luce e le sequenze di imaging.
- Comporta considerazioni di adattamento tra specie diverse, aree cerebrali e sistemi di espressione degli opsin.
- Include limitazioni pratiche come l’invasività chirurgica, la dispersione della luce nei tessuti e la complessità nell’interpretazione del segnale emodinamico.
