Name: Misurazione Attaccamento e internalizzazione del virus A in cellule A549 mediante citometria di flusso (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Impara a misurare l'attaccamento e l'internalizzazione del virus dell'influenza A nelle cellule epiteliali polmonari A549 mediante citometria a flusso. Questo metodo semi-quantitativo utilizza il binding a freddo e lo spostamento termico per distinguere tra virus attaccati e internalizzati.

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Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione da parte del Fondo nazionale svizzero (31003A_135278) per SST. MOP è il beneficiario di una borsa di dottorato di ricerca del Fondo AXA. Ringraziamo Patricia Nigg aiuto per la progettazione di figura 1.

Nota prima dell&#39;inizio: cappa a flusso laminare e Uso appropriato biocontenimento quando si lavora con virus vivo. Qui, descriviamo le condizioni di crescita idonee a ceppo di virus influenzale cultura A / WSN / 33. Molteplicità di infezione (MOI) e di incubazione possono variare a seconda ceppo virale usato. 1. Preparazione di A biotinilato / WSN / 33 Virus <ol><li> Seed Madin-Darby kindey canino (MDCK), le cellule in un pallone T175 cm 2 utilizzando Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) supplementato con 10% FBS e 1% di penicillina-streptomicina (Pen / Strep). Cellule di coltura a 37 ° C fino a circa il 70% di confluenza viene raggiunto. </li><li> Prima infezione, rimuovere medie e lavare le cellule con tampone fosfato salino (PBS, pH7.0-7.3) aggiungendo un volume sufficiente a coprire il monostrato cellulare. </li><li> Rimuovere PBS e infettare le cellule con A / WSN / 33 con un MOI di 10 -4. Diluire virus in PBS completati con 0,02 mg Mg 2 +, 0,01 mg di Ca 2+ &lt;/ sup&gt;, lo 0,3% di albumina sierica bovina (BSA), e 1% Pen / Strep (infezione-PBS). Utilizzare un inoculo di 4 ml per una fiasca T175 cm 2. </li><li> Incubare le cellule 1 ora a 37 ° C. Rimuovere inoculo per aspirazione e pipette 10 ml di DMEM integrato con 0,3% di BSA, 20 HEPES mM, e 1% Pen / Strep nel pallone. </li><li> Incubare le cellule a 37 ° C per circa 3 giorni fino effetto citopatico (CPE) è visibile, e quindi raccolto surnatante. CPE può essere riconosciuto come arrotondamento delle cellule seguono distacco e morte delle cellule 14. </li><li> Spin surnatante a 450 xg per 5 minuti per rimuovere i detriti cellulari. Trasferire il surnatante in un nuovo tubo falco e ripetere questo passaggio ancora una volta. Eliminare il pellet. </li><li> Trasferire supernatanti in provette ultracentrifuga e supernatanti sottopavimenti con 5 ml di saccarosio 30% diluiti in tampone NTE (Tris 10 mM [pH 7,4], NaCl 100 mM, EDTA 1 mM). Equilibrio tubi prima ultracentrifugazione e riempire con PBS per raggiungere un volume fine di 30 ml. Spin Supernaabi- a 112.398 xg (corrispondente a 25.000 rpm per rotore SW28) per 90 min in un&#39;ultracentrifuga. </li><li> Rimuovere con attenzione il surnatante pipettando e immergere pellet virus notte a 4 ° C in 250 l di PBS. Pellet Risospendere pipettando su e giù. Misurare il contenuto di proteine ​​del virus purificato dalla Bradford test 15. </li><li> Utilizzare un kit biotinilazione per generare biotinilato A / WSN / 33. Seguire le istruzioni del produttore. </li><li> In breve, aggiungere la giusta quantità di biotina al virus purificato e incubare per 2 ore su ghiaccio. Trasferimento virus di un tubo ultracentrifuga e riempire il tubo con PBS per raggiungere un volume fine di 30 ml. Spin virus a 112.389 xg per 90 min in un&#39;ultracentrifuga. Rimuovere il surnatante pipettando e aggiungere 250 microlitri di PBS. Immergere pellet per tutta la notte a 4 ° C. Aliquotare e conservare il virus biotinilato conservato a -80 ° C in cui sarà stabile per almeno 24 mesi. NOTA: Potrebbe essere utile per determinare il titolo del p biotinilatoriparazione di IAV mediante test placca standard. Tuttavia, va notato che il protocollo successiva solo misurare particelle virali biotinilati. Rimanendo particelle unbiotinylated causa biotinylation incompleta contribuirà al titolo infettivo mediante saggio di placca ma non al segnale misurato nel test allegato / internalizzazione. </li></ol> 2. Determinare la quantità necessaria di Biotinylated Virus NOTA: Prima di eseguire il test di attacco / internalizzazione, è importante determinare la quantità di virus biotinilato necessaria per infettare tutte le cellule di un campione. <ol><li> Cultura e cellule A549 trypsinize secondo le istruzioni del produttore. Contare le cellule utilizzando una camera di cella. Pipette cellule 200.000 A549 in FACS Deepwell tubi. Spin 3 min a 450 x g. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet con 200 microlitri di PBS. Cellule raffreddare in ghiaccio per 10 minuti. </li><li> Preparare 5-fold diluizioni seriali del biotinylated magazzino virus infezione-PBS. </li><li> Tubi Spin contenenti le cellule a 4 ° C per 3 min a 450 x g. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet con 100 microlitri virus contenenti infezioni PBS. Come utilizzare il controllo finto infezione PBS senza virus biotinilato. Incubare le provette in ghiaccio per 1 ora. </li><li> Tubi Spin a 4 ° C per 3 minuti a 450 x g. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet in 200 l di PBS. Ripetere questo passaggio ancora una volta. </li><li> Per il fissaggio, tubi di spin a 4 ° C per 3 minuti a 450 x g. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet in 100 ml di 3,7% paraformaldeide (PFA). Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Quindi, ripetere il lavaggio passo descritto in 2.4). </li><li> Per permeabilizzazione, tubi di spin a 4 ° C per 3 minuti a 450 x g. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet in 100 l di PBS contenente 0,5% Triton X-100. Incubare per 6 minuti a temperatura ambiente. Quindi, ripetere il lavaggio passo descritto in 2.4). </li><li> Tubi Spin a 4 ° C per 3 minuti a 450 x g. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet in 50 microlitri 2% BSA in PBS diluito contenente STV-Cy3. (Si prega di notare, la concentrazione appropriata di STV-Cy3 deve essere determinato prima di iniziare l&#39;esperimento Inizia con una concentrazione di 1:. 200 e il test diluizioni 2-fold fino a 1:. 2400 Nelle nostre mani, una diluizione di 1: 1.000 dimostrato essere ottimale.) </li><li> Incubare 1 ora al buio a temperatura ambiente. Quindi, ripetere il passaggio di lavaggio descritta in 2.4, ma risospendere il pellet in 200 ml 2% BSA diluito in PBS. </li><li> Analizzare i campioni mediante citometria di flusso 16. Porta sulla popolazione Cy3-positivo. Scegliere la più bassa concentrazione di virus biotinilato da ottenere il numero massimo di celle Cy3-positivi nella popolazione A549. </li></ol> 3. Determinare la quantità necessaria di Streptavidina NOTA: L&#39;efficienza di bloccare il segnale derivato dal virus extracellulare determina il campo di rilevamento del test. Pertanto, è importante abrogare segnale STV-Cy3 il più possibile. The quantità richiesta di STV necessario dipende dalla quantità di biotinilato magazzino virus usato (determinata al punto 2). <ol><li> Seguire i passaggi 2.1-2.4, ma utilizzare concentrazione di virus determinate al punto 2. </li><li> Preparare diluizioni seriali di cinque-fold di STV diluiti in PBS contenente 2% di BSA e lo 0,1% di sodio azide. </li><li> Tubi Spin a 4 ° C per 3 minuti a 450 x g. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet in 50 microlitri di diluizione STV. Come utilizzare il controllo finto PBS contenente 2% di BSA e lo 0,1% di sodio azide senza STV. Incubare le provette per 30 min in ghiaccio. Quindi, ripetere il passaggio di lavaggio descritta in 2.4. </li><li> Seguire i passaggi 2,5-2,9. Per il saggio internalizzazione, scegliere la più bassa concentrazione di STV conseguente forte blocco del Cy3 segnale (rispetto al campione in cui non era presente ATS). Per questo, può essere utilizzata la percentuale di cellule positive Cy3 o l&#39;intensità di fluorescenza media del segnale Cy3. Idealmente, il segnale Cy3 di campioni STV trattati deve essere il più vicino possibile al segnale da mock-infettatecelle come possibile. </li></ol> 4. Allegato / Internalizzazione Assay NOTA: Assicurarsi di preparare tutti i reagenti prima di iniziare il test. Per i tre gruppi di controllo presentati nella sezione risultati (cellule infettate finto, le cellule pre-trattate neuraminidasi e cellule sodioazide trattati) piccole modifiche al protocollo sono obbligatori. <ol><li> Preparare 16 provette contenenti deepwell ogni 200.000 cellule A549. Accanto al gruppo sperimentale composto da 4 tubi, ci sono 3 condizioni di controllo, ciascuno dei quali occorrono 4 tubi: cellule mock-infettate, neuraminidasi (NA), le cellule -pretreated e le cellule trattate azide di sodio. Ogni gruppo è composto da 4 tubi etichettati come &#39;0 min&#39;, &#39;0 min + STV&#39;, &#39;30 minuti &#39;, &#39;30 minuti + STV&#39;. </li><li> Tubi Spin a 4 ° C per 3 minuti a 450 x g. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet in 200 l di PBS. </li><li> Tubi Spin a 4 ° C a 450 x g. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet in 200 microlitri DMEM contenente 0,3% di BSA, 20 mM HEPES e 1% di penicillina-streptomicina (mezzo di incubazione). Incubare per 30 minuti a 37 ° C. NOTA: Per il controllo neuraminidasi: Utilizzo neuraminidasi batterica (es sialidasi da Vibrio colera) ad una concentrazione di 200 mU / ml diluito in mezzo di incubazione per risospendere le cellule. </li><li> Tubi Spin a 4 ° C per 3 minuti a 450 x g. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet in 200 l di PBS. Ripetere questo passaggio ancora una volta, poi i tubi raffreddare in ghiaccio per 10 minuti. </li><li> Tubi Spin a 4 ° C per 3 minuti a 450 x g. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet in 100 ml biotinilati virus (utilizzare la concentrazione di virus determinata al punto 2 diluito in infezioni-PBS). Incubare 1 ora su ghiaccio. Quindi, ripetere il passaggio di lavaggio descritta in 2.4. NOTA: Per il controllo mock-infettate: Usa infezione-PBS, senza virus. Per il controllo sodio azide: Usa virus diluito in infezioni PBS integrato con 0,1% di sodio azide. </li><li> Professionistaelaborazione dei campioni dopo l&#39;infezione su ghiaccio: <ol><li> Per i campioni &quot;0 min&quot;, seguire passo 2.5 e conservare i campioni a 4 ° C fino a quando sono stati fissati gli altri campioni. </li><li> Per il &#39;0 min + STV&#39; campioni, tubi di spin a 4 ° C per 3 minuti a 450 x g. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet in 50 microlitri STV (utilizzare la concentrazione determinata al punto 3) diluito in PBS contenente 2% di BSA e lo 0,1% di sodio azide (per evitare interiorizzazione durante la manipolazione del campione). Incubare 30 min in ghiaccio. Seguire passo 2.4-2.5 e conservare i campioni a 4 ° C. </li><li> Per i campioni &#39;30 min &#39;, tubi di spin a 4 ° C per 3 minuti a 450 x g. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet in 200 l di PBS contenente 2% di BSA. Incubare 30 minuti a 37 ° C. Seguire passo 2.4-2.5 e conservare i campioni a 4 ° C. NOTA: Per il controllo sodio azide: Utilizzo PBS integrato con il 2% di BSA e 0,1% di sodio azide per 30 min di incubazione a 37 ° C. </li><li> Per il &#39;30 min + campioni STV &#39;girano provette a 4 ° C per 3 min a 450 x g. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet in 200 l di PBS contenente 2% di BSA. Incubare 30 minuti a 37 ° C. Poi, tubi di spin a 4 ° C per 3 minuti a 450 x g. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet in 50 microlitri STV (utilizzare la concentrazione determinata al punto 3) diluito in PBS contenente 2% di BSA e lo 0,1% di sodio azide (per evitare interiorizzazione durante la manipolazione del campione). Incubare 30 min in ghiaccio. Seguire passo 2.4-2.5 e conservare i campioni a 4 ° C. NOTA: Per il controllo sodio azide: Utilizzo PBS integrato con il 2% di BSA e 0,1% di sodio azide per 30 min di incubazione a 37 ° C. </li></ol></li><li> Seguire i passaggi 2,6-2,8 e analizzare campioni mediante citometria a flusso. Determinare la percentuale di cellule positive Cy3-in ciascun campione. </li><li> Calcolare la percentuale allegato virus e la quantità relativa di virus interiorizzato. <ol><li> Per calcolare la quantità di virus in allegato, utilizzare la percentuale di Cy3-positive cellule gated o l&#39;intensità di fluorescenza media del segnale Cy3. Per confronto, impostare cellule non trattate al 100% (Figura 4B). NOTA: La percentuale di virus si è descritto dal campione &quot;0 min&quot;. </li><li> Per calcolare la quantità di virus internalizzato, prendere il rapporto tra il &quot;30 min + STV&quot; campione al &quot;30 min&quot; campione (Figura 5B). NOTA: Come menzionato sopra, la percentuale di cellule positive Cy3 gated o l&#39;intensità di fluorescenza media del segnale Cy3 può essere utilizzato. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Edinger, T. O., Pohl, M. O., Stertz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entry+of+influenza+A+virus%3A+host+factors+and+antiviral+targets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Entry of influenza A virus: host factors and antiviral targets.</a> J Gen Virol. 95, 263-277 (2014).</li>
<li>Palese, P., Shaw, M. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPalese%2C+P+%22Fields+Virolog%22">Fields Virolog</a>. Knipe, D. M., Howley, P. M. 2, Lippincott Williams and Wilkins. (2007).</li>
<li>Matlin, K. S., Reggio, H., Helenius, A., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infectious+entry+pathway+of+influenza+virus+in+a+canine+kidney+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Infectious entry pathway of influenza virus in a canine kidney cell line.</a> J Cell Biol. 91, 601-613 (1981).</li>
<li>Sieczkarski, S. B., Whittaker, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+virus+can+enter+and+infect+cells+in+the+absence+of+clathrin-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Influenza virus can enter and infect cells in the absence of clathrin-mediated endocytosis.</a> J Virol. 76, 10455-10464 (2002).</li>
<li>Rust, M. J., Lakadamyali, M., Zhang, F., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+endocytic+machinery+around+individual+influenza+viruses+during+viral+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Assembly of endocytic machinery around individual influenza viruses during viral entry.</a> Nat Struct Mol Biol. 11, 567-573 (2004).</li>
<li>Vries, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+the+influenza+A+virus+endocytic+routes+reveals+macropinocytosis+as+an+alternative+entry+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Dissection of the influenza A virus endocytic routes reveals macropinocytosis as an alternative entry pathway.</a> PLoS Pathog. 7, e1001329(2011).</li>
<li>Vries, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+A+virus+entry+into+cells+lacking+sialylated+N-glycans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Influenza A virus entry into cells lacking sialylated N-glycans.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109, 7457-7462 (2012).</li>
<li>Londrigan, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-linked+glycosylation+facilitates+sialic+acid-independent+attachment+and+entry+of+influenza+A+viruses+into+cells+expressing+DC-SIGN+or+L-SIGN%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">N-linked glycosylation facilitates sialic acid-independent attachment and entry of influenza A viruses into cells expressing DC-SIGN or L-SIGN.</a> J Virol. 85, 2990-3000 (2011).</li>
<li>Wang, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DC-SIGN+mediates+avian+H5N1+influenza+virus+infection+in+cis+and+in+trans%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">DC-SIGN mediates avian H5N1 influenza virus infection in cis and in trans.</a> Biochem Biophys Res Commun. 373, 561-566 (2008).</li>
<li>Pohl, M. O., Edinger, T. O., Stertz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolidase+is+required+for+early+trafficking+events+during+influenza+A+virus+entry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Prolidase is required for early trafficking events during influenza A virus entry.</a> J Virol. 88, 11271-11283 (2014).</li>
<li>Konig, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+host+factors+required+for+influenza+virus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human host factors required for influenza virus replication.</a> Nature. 463, 813-817 (2010).</li>
<li>Ludwig, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+cell+signalling+pathways+to+fight+the+flu%3A+towards+a+paradigm+change+in+anti-influenza+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemothe%22%5BJournal%5D)">Targeting cell signalling pathways to fight the flu: towards a paradigm change in anti-influenza therapy.</a> J Antimicrob Chemothe. 64, 1-4 (2009).</li>
<li>Simoes, S., Slepushkin, V., Duzgunes, N., Pedroso de Lima, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+mechanisms+of+internalization+and+intracellular+delivery+mediated+by+pH-sensitive+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">On the mechanisms of internalization and intracellular delivery mediated by pH-sensitive liposomes.</a> Biochim Biophys Acta. 1515, 23-37 (2001).</li>
<li>Tran, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+specific+host+factors+protects+against+influenza+virus-induced+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+death%2C+and+disease%22%5BJournal%5D)">Knockdown of specific host factors protects against influenza virus-induced cell death.</a> Cell death, and disease. 4, e769(2013).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgramm+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgramm quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Macey, M. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMacey%2C+MG+%22Flow+Cytometry+Principles+and+Applications%22">Flow Cytometry Principles and Applications</a>. Macey, M. G. , Humana Press. (2007).</li>
<li>Burness, A. T., Pardoe, I. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+enzymes+on+the+attachment+of+influenza+and+encephalomyocarditis+viruses+to+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Viro%22%5BJournal%5D)">Effect of enzymes on the attachment of influenza and encephalomyocarditis viruses to erythrocytes.</a> J Gen Viro. 55, 275-288 (1981).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il nostro protocollo descrive un modo semplice per misurare l&#39;attaccamento virus e internalizzazione mediante citometria a flusso. Esso consente l&#39;utilizzo di virus di tipo selvatico marcato che imita più da vicino le infezioni da virus rispetto all&#39;uso di particelle simili a virus (VLP). Mentre il nostro protocollo è stato ottimizzato per misurare attaccamento e internalizzazione di IAV può essere facilmente adattato per altri virus. Inoltre, come la citometria a flusso è utilizzato per la lettura, co-color...

L&#39;ingresso del virus influenzale A (IAV) è un processo in più fasi che inizia con il legame del virus ai recettori presenti sulla membrana plasmatica delle cellule bersaglio 1. Il recettore per IAV è l&#39;acido sialico che è presente su una grande varietà di glicoproteine ​​e glicolipidi. La emoagglutinina (HA) proteina di IAV che è presente nella busta virale si lega all&#39;acido sialico e media così fissaggio delle particelle virali alla membrana plasmatica di cellule bersaglio 2. Il virus entra nelle cellule tramite endocitosi clatrina-mediata, ma anche percorsi di inserimento alternativi, come macropinocitosi, sono stati descritti 3-6. L&#39;interazione tra HA e acido sialico sembra essere sufficiente per mediare sia, attaccamento e innescando internalizzazione delle particelle virali 7. Tuttavia, i recettori di ingresso alternativi sono stati proposti e il loro ruolo nella voce IAV sono attualmente in fase di studio 1,8,9. Curtualmente, gli sforzi sono fatti per identificare i fattori dell&#39;ospite che sono coinvolti nel ciclo di vita virale con l&#39;obiettivo di sviluppare nuove terapie urgenti antivirali 10-12. Virus ingresso sarebbe un passo favorevole per il targeting crescita IAV al fine di bloccare l&#39;infezione virale nel suo punto più presto. Misurare diverse fasi di ingresso IAV sperimentalmente è impegnativo come di solito grandi quantità di virus sono necessari per individuare il virus in arrivo. Inoltre, il campo di rilevamento delle variazioni entrata del virus è lineare solo a causa della mancanza di replicazione virale. Ciò sottolinea la necessità di test ad alta sensibilità. Il saggio qui presentiamo permette il rilevamento di virus attaccato alla superficie cellulare e rilevamento del virus internalizzato in relazione alla quantità totale di virus associato alle cellule. L&#39;utilizzo di virus di tipo selvatico biotinilato permette conveniente misurazione attraverso colorazione con STV-Cy3 e la lettura mediante citometria a flusso. Virus Biotinilato è freddo legato alla cellas per consentire l&#39;attaccamento, ma impediscono l&#39;internalizzazione delle particelle virali. Le cellule possono essere fissate, permeabilizzate e colorate con STV-Cy3 per misurare il virus allegato. Il segnale da virioni extracellulari, allegati può essere abrogata se un passo bloccante viene applicata prima fissazione in cui le cellule vengono incubate con streptavidina-etichettato (STV). In una fase successiva, a seguito dell&#39;adesione di biotinilato IAV, la temperatura è spostato a 37 ° C e l&#39;interiorizzazione di particelle virali è permesso di prendere posto. Particelle interiorizzato sono protetti da legame di STV consentendo in tal modo la discriminazione tra i virus extra- ed intracellulari. Per condizione sperimentale, sono necessari quattro campioni: &#39;0 min&#39;: Il primo esempio, l&#39;etichetta &#39;0 min&#39;, è quello di misurare il virus legato a freddo sulla superficie cellulare. &#39;0 min + STV&#39;: Il secondo campione, etichettato &#39;0 min + STV&#39;, dà l&#39;intensità del segnale di base di questo esperimento. Il virus si è bloccato with STV e il seguente segnale di colorazione con STV-Cy3 dovrebbero essere molto inferiore rispetto al campione &#39;0 min&#39;. &#39;30 Min &#39;: Il terzo campione, &#39;30 minuti&#39; contiene attaccato e internalizzata virus a causa del passaggio di temperatura a 37 ° C per 30 min. &#39;30 Min + STV &#39;: Il quarto campione, la data del 30 min + STV&#39; misura la frazione intracellulare di virus. Il passo di blocco STV viene applicato dopo il periodo di incubazione 30 min. Come risultato, le particelle virali sulla superficie cellulare sono vincolati da STV lasciando solo virus internalizzati disponibile per colorazione con STV-Cy3. La quantità relativa di virus internalizzati può essere calcolato come rapporto del virus internalizzati (misurata nel &#39;30 min + ATS &#39;esempio) divisa per la quantità totale di virus (descritta dal &#39;30 min&#39; esempio). Come controllo si consiglia di includere cellule mock-infettate. Il segnale seguente STV-Cy3 colorazione delle cellule mock-infettate dà lo sfondorisultante dal protocollo di colorazione. Un controllo per il fissaggio IAV è il pre-trattamento delle cellule con neuraminidasi batterica (NA). Unirà NA off acido sialico da glicoproteine ​​cellulari, eliminando in tal modo i recettori di attacco dalla superficie cellulare. Sodio azide (SA) è un inibitore del metabolismo potenti e quindi blocchi endocitosi 13. Cellule trattate con sodio azide dovrebbero essere positivi per il legame virus, ma negativo per l&#39;internalizzazione.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>41966-052</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-streptomicina</td><td>Life Technologies</td><td>15140-163</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-169&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>VWR Calbiochem</td><td>126579</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630-100</td><td></td></tr><tr><td>D-saccarosio</td><td>Fluka</td><td>84100</td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Biosolve BV</td><td>20092391</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3680</td><td></td></tr><tr><td>EZ-LINK NHS-SS-BIOTINA kit</td><td>Fisher Scientific</td><td><a href="https://extranet.fisher.co.uk/insight2_ch/getProduct.do?productCode=W9971E">W9971E&nbsp; </a></td><td></td></tr><tr><td>Bio Rad Protein Bio Assay</td><td>Bio Rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>provette a pozzetto profondo (microprovette da 1,2 ml)</td><td>Milian</td><td>82 00 001</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>&nbsp; Lucerna chimica Scienze della microscopia elettronica</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>provette per ultracentrifuga</td><td>Hemotec HmbH</td><td>253070</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fluka</td><td>93420</td><td></td></tr><tr><td>STV-Cy3</td><td>Life Technologies</td><td>43-4315</td><td></td></tr><tr><td>STV</td><td>Life Technologies</td><td>43-4302</td><td></td></tr><tr><td>azoturo di sodio</td><td>Fluka</td><td>71290</td><td></td></tr><tr><td>neuraminidasi batterica / sialidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6514-1UN</td><td></td></tr></tbody></table>

misurazione attaccamento e internalizzazione del virus a in cellule a549 mediante citometria di flusso

Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

L'attaccamento alle cellule bersaglio seguito dall'internalizzazione sono i primissimi passi del ciclo di vita del virus dell'influenza A (IAV). Forniamo qui un protocollo dettagliato per misurare i cambiamenti relativi nella quantità di particelle virali che si attaccano alle cellule A549, una linea cellulare epiteliale polmonare umana, nonché nella quantità di particelle che vengono internalizzate nella cellula. Utilizziamo virus biotinilati che possono essere facilmente rilevati dopo la colorazione con streptavidina marcata con Cy3 (STV-Cy3). Descriviamo la crescita, la purificazione e la biotinilazione di A/WSN/33, un ceppo di laboratorio IAV ampiamente utilizzato. Le particelle di IAV biotinilate legate a freddo su cellule A549 vengono colorate con STV-Cy3 e misurate mediante citometria a flusso. Per studiare l'assorbimento delle particelle virali, il virus legato al freddo viene lasciato internalizzare a 37 °C. Al fine di distinguere tra particelle virali esterne e internalizzate, viene applicata una fase di blocco: i punti di legame liberi sulla biotina del virus attaccato sulla superficie cellulare sono legati da streptavidina non marcata (STV). La successiva permeabilizzazione cellulare e la colorazione con STV-Cy3 consentono quindi il rilevamento delle particelle virali internalizzate. Presentiamo un calcolo per determinare la quantità relativa di virus internalizzato. Questo test è adatto per misurare gli effetti di trattamenti farmacologici o altre manipolazioni sull'attaccamento o l'internalizzazione di IAV.

Un cartone descrive le quattro diverse condizioni sperimentali è mostrato in Figura 1 I risultati di un esperimento rappresentativo sono presentati nelle Figure 2 -. 5. Nel campione &quot;0 min&quot;, virus biotinilato è freddo legato alle cellule, che possono essere visualizzati da STV-Cy3 colorazione bersaglio (figure 1 e 2). Quando viene applicato un passo di blocco (in &quot;0 min + STV&quot; campione), virus sulla ...

Presentiamo un protocollo che descrive un metodo semi-quantitativo per misurare sia l'attaccamento del virus dell'influenza A alle cellule A549, sia l'internalizzazione delle particelle virali nelle cellule bersaglio mediante citometria a flusso.

Misurazione Attaccamento e internalizzazione del virus A in cellule A549 mediante citometria di flusso

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed ...

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare l'adesione e l'internalizzazione dell'influenza. Le particelle virali in cellule epiteliali polmonari A549. Questo viene ottenuto innanzitutto mediante legame a freddo dell'influenza, un virus alle cellule A549, che permette l'adesione ma impedisce l'assorbimento delle particelle virali.Successivamente, si permette l'internalizzazione del virus spostando la temperatura a 37 gradi Celsius. Quindi si esegue un passaggio di blocco in cui lo strp Aden non marcato si lega alla superficie cellulare. I virus associati vengono trattati al fine di discriminare tra particelle virali aderenti e quelle internalizzate.Infine, il virus biotinilato associato alla cellula viene incubato con streptavidina marcata con CY3 e la citometria a flusso viene utilizzata per rilevare i virus colorati. In definitiva, si calcola la quantità relativa di virus legati e internalizzati. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla quantità relativa di influenza, un virus che si lega e internalizza nelle cellule 5 0 9.Si può inoltre applicare ad altri sistemi che utilizzano linee cellulari diverse o altri virus. Dopo aver generato il virus biotinilato e aver determinato le quantità necessarie di virus marcato, streptavidina e SI tre streptavidina marcata secondo il protocollo descritto nel testo, preparare quattro provette deep well, ciascuna contenente 200.000 cellule A549. Etichettare le provette come zero minuti, zero minuti più STV, 30 minuti e 30 minuti più STV. Successivamente, centrifugare le provette.Rimuovere il soprannatante e utilizzare 200 microlitri di PBS per risospendere i pellet. Dopo aver centrifugato nuovamente i tubi, utilizzare 200 microlitri di un mezzo di crescita standard 5 49 per risospendere le cellule, incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti; al termine dell'incubazione, centrifugare i campioni e risospendere i pellet in 200 microlitri di PBS. Dopo aver ripetuto il lavaggio un’altra volta, raffreddare i tubi in ghiaccio per 10 minuti. Una volta raffreddati i tubi, centrifugare nuovamente e utilizzare 100 microlitri di virus biotinilato diluito in PBS di infezione per risospendere i pellet; dopo aver incubato in ghiaccio per un’ora, ripetere la centrifugazione e lavare con PBS due volte, elaborando i seguenti campioni in parallelo il più possibile per i campioni a zero minuti.Dopo la centrifugazione, utilizzare 100 microlitri di paraformaldeide al 3,7% o PFA per risospendere il pellet cellulare. Incubare a temperatura ambiente per 10 minuti, quindi centrifugare e lavare le cellule due volte con PBS dopo la fissazione. Conservare a quattro gradi Celsius fino a quando tutti i campioni non sono stati processati.Per trattare i campioni allo zero minuto più STV, centrifugare i tubi, rimuovere il soprannatante e utilizzare 15 microlitri di STV con 2% BSA e 0,1% azida sodica in PBS per risospendere il pellet cellulare; incubare sul ghiaccio per 30 minuti. Successivamente, centrifugare e lavare le cellule due volte con PBS dopo la fissazione con PFA come appena dimostrato. Conservare i campioni a quattro gradi Celsius per i campioni dei 30 minuti. Dopo la centrifugazione e la rimozione del soprannatante, utilizzare PBS con 2% BSA per risospendere i campioni.Incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti prima di lavare con PBS e fissare con PFA. Successivamente, conservare i campioni a quattro gradi Celsius per 30 minuti più i campioni STV. Dopo la centrifugazione, sospenderemo i campioni in 200 microlitri di PBS 2% BSA, seguendo un'incubazione a 37 gradi Celsius per 30 minuti.Centrifugare e risospendere le cellule in 50 microlitri di STV con 2% BSA e 0,1% azida sodica in PBS, incubare sul ghiaccio per 30 minuti prima del lavaggio e della fissazione. Successivamente, dopo aver reso permeabili e colorato tutti i campioni con STV SI tre, seguendo le indicazioni dettagliate nel protocollo del testo, conservare i campioni a quattro gradi Celsius. Infine, analizzare i campioni mediante citometria a flusso.Determinare la percentuale di cellule positive a CY tre in ogni campione. Calcolare la percentuale di virus legato e la quantità relativa di virus internalizzato. Secondo il protocollo descritto nel testo, come mostrato qui nel campione a zero minuti, il virus legato è associato alle cellule bersaglio in condizioni di freddo ed è visibile mediante colorazione con St.V.SI tre.Quando STV viene applicato come passaggio di blocco, il virus presente sulla superficie cellulare non può più essere rilevato mediante la colorazione con S St.V.SI, riducendo fortemente il segnale. Quando la temperatura viene aumentata a 37 gradi Celsius, il virus legato viene internalizzato nelle cellule. Il virus internalizzato non è sensibile al blocco con STV non marcato, con conseguente riduzione meno marcata dell'intensità del segnale nei campioni a 30 minuti con aggiunta di STV mostrati.Di seguito sono riportate le percentuali di cellule positive per SI tre per tutte le condizioni sperimentali descritte in questo video. Le cellule infettate con virus fittizio forniscono l'intensità del segnale di fondo per l'esperimento e fungono da controllo negativo per l'attacco virale. Un altro controllo, la neuraminidasi, riduce fortemente l'attacco del virus dell'influenza A (IAV) del 90% rispetto alle cellule non trattate.L'azide sodica, che esaurisce l'ATP, inibendo così l'endocitosi, ha inibito l'internalizzazione delle particelle virali sia durante che dopo l'infezione, come mostrato qui di seguito: dopo il trattamento con azide sodica, le cellule incubate per 30 minuti a 37 gradi Celsius hanno mostrato una drastica riduzione dell'internalizzazione rispetto alle cellule non trattate incubate nelle stesse condizioni. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come misurare l'attacco e l'internalizzazione dell'influenza, un virus, in cellule MDCK. Questo protocollo permette una lettura agevole mediante citometria a flusso ed è facilmente adattabile ad altri contesti sperimentali.

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

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Questo metodo descrive l'utilizzo di Infrared sistema colorante di imaging based per il rilevamento di H1N1 in bronchioalveolar lavaggio (BAL) fluido di topi infettati ad una sensibilità elevata. Questa metodologia può essere eseguita in uno 96 - o 384-bene piastra, richiede &lt;10 volume pl di materiale di prova e ha il potenziale per lo screening concomitante di agenti patogeni multipli.

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Descriviamo l'isolamento rapido di primarie murine di tipo II le cellule epiteliali alveolari (AECII) per selezione di citometria di flusso negativo. Questi AECII mostrano alta vitalità e purezza e sono adatte per una vasta gamma di studi funzionali e molecolari riguardanti il ​​loro ruolo in condizioni respiratorie come le malattie autoimmuni o infettive.

Flusso Isolamento citometrica di primari murini di tipo II cellule alveolari epiteliali per gli studi funzionali e molecolari

Source: Klaus, J. P., et al Highly Sensitive Assay for Measurement of Arenavirus-cell Attachment. J. Vis. Exp. (2016).This video demonstrates how to measure arenavirus attachment to monkey kidney cells. The assay uses low temperatures to block endocytosis and isolate the virus binding step. The approach enables precise quantification of surface-bound virus particles under conditions that restrict internalization.

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In questo video, discutiamo la correlazione tra il CIT50 e la molteplicità delle infezioni virali. Le cellule infettate dal virus mostrano effetti citopatici, causando la loro morte e il distacco dal microelettrodo d'oro, che a sua volta riduce l'impedenza.

Saggio cellulare basato sull'impedenza per misurare la molteplicità dell'infezione da virus influenzale

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Questo video mostra un test che misura l'attivazione mediata da anticorpi delle funzioni effettrici delle cellule T. L'aggiunta di un anticorpo monoclonale specifico per l'emoagglutinina (HA) del virus dell'influenza alle cellule di mammifero trasfettate che esprimono HA provoca la formazione di immunocomplessi con HA. Dopo l'introduzione di cellule T ingegnerizzate che esprimono recettori Fc e un reporter della luciferasi, le cellule T vengono attivate dai complessi anticorpo-HA e questa...

Misurazione dell'attivazione delle funzioni effettrici mediate da FC da parte degli anticorpi HA

Il primo passo nel ciclo di vita dell'arenavirus è l'attaccamento delle particelle virali alle cellule ospiti. Riportiamo un test quantitativo basato su (q)RT-PCR per il rilevamento e la quantificazione ultrasensibili degli eventi di attacco all'arenavirus.

Saggio altamente sensibile per la misura dell&#39;attaccamento Arenavirus-cell

Descriviamo il test della lectina enzimatica (ELLA) per misurare i titoli anticorpali di inibizione della neuraminidasi dell'influenza (NA) nei sieri. Il test utilizza l'agglutinina di arachidi per quantificare i residui di galattosio che diventano accessibili quando NA rimuove l'acido sialico da piastre a 96 pozzetti rivestite di fetuina.

Misurare Influenza neuraminidasi Inibizione anticorpo I titoli da Enzyme-linked lectina Assay

Descriviamo un metodo per misurare l'attivazione di funzioni effettrici Fc-mediata dagli anticorpi che hanno come destinazione l'emagglutinina del virus dell'influenza. Questo dosaggio può essere adattato anche per valutare la capacità di anticorpi monoclonali o policlonali sieri altre glicoproteine di superficie virale di targeting di indurre immunità Fc.

Un metodo per valutare le funzioni effettrici Fc-mediata indotte dagli anticorpi specifici di Hemagglutinin di riossidazione

Qui è riportato un protocollo per la quantificazione di particelle virali infettive utilizzando il monitoraggio in tempo reale dell'impedenza elettrica delle cellule infette. Un'applicazione pratica di questo metodo è presentata quantificando il decadimento del virus dell'influenza A in diversi parametri fisico-chimici che imitano le condizioni ambientali.

Monitoraggio della sopravvivenza del virus influenzale al di fuori dell'ospite utilizzando l'analisi cellulare in tempo reale

Impara a misurare l'attaccamento e l'internalizzazione del virus dell'influenza A nelle cellule epiteliali polmonari A549 mediante citometria a flusso. Questo metodo semi-quantitativo utilizza il binding a freddo e lo spostamento termico per distinguere tra virus attaccati e internalizzati.

Misurazione Attaccamento e internalizzazione del virus A in cellule A549 mediante citometria di flusso

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