Misurazione Attaccamento e internalizzazione del virus A in cellule A549 mediante citometria di flusso

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare l'attaccamento e l'internalizzazione dell'influenza. Un virus si diffonde in 5 49 cellule epiteliali polmonari. Ciò si ottiene legando prima a freddo da parte di un'influenza ata, un virus a 5 49 cellule, che consente l'attaccamento ma impedisce l'assorbimento di particelle virali.

Successivamente, il virus viene autorizzato a internalizzarsi spostando la temperatura a 37 gradi Celsius. Quindi un passaggio di blocco in cui strp Aden non marcato è legato alla superficie cellulare. I virus attaccati vengono eseguiti per discriminare tra particelle virali attaccate e internalizzate.

Infine, il virus biotinilato associato alle cellule viene incubato con streptavidina marcata con CY 3 e la citometria a flusso viene utilizzata per rilevare i virus colorati. In definitiva, viene calcolata la quantità relativa di virus attaccati e internalizzati. Anche se questo metodo può fornire informazioni sulla quantità relativa di influenza, un virus che si attacca e si internalizza in 5 0 9 cellule.

Può anche essere applicato ad altri sistemi che utilizzano diverse linee cellulari o altri virus Dopo aver generato il virus biotinilato e determinato le quantità richieste del virus marcato strep din e SI tre marcati strep din secondo il protocollo di testo, preparare quattro provette a pozzetti profondi ciascuna contenente 200, 000, A 5 49 cellule etichettate le provette come zero minuti. Zero minuti, più STV, 30 minuti e 30 minuti più STV. Quindi, fai girare i tubi.

Rimuovere il surnatante e utilizzare 200 microlitri di PBS per risospendere i pellet. Quindi, dopo aver girato nuovamente le provette, utilizzare 200 microlitri di un terreno di crescita standard 5 49 per risospendere le cellule, incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti dopo la centrifuga di incubazione, centrifugare i campioni e risospendere i pellet in 200 microlitri di PBS Dopo aver ripetuto il lavaggio ancora una volta, raffreddare le provette con ghiaccio per 10 minuti. Quando le provette si sono raffreddate, centrifugare di nuovo e utilizzare 100 microlitri di virus biotinilato diluito in PBS di infezione per risospendere i pellet dopo l'incubazione su ghiaccio per un'ora, ripetere la centrifuga e lavare con PBS due volte, elaborando i seguenti campioni in parallelo il più possibile per i campioni al minuto zero.

Dopo la centrifuga, utilizzare 100 microlitri di aldeide paraforme al 3,7% o PFA per risospendere il pellet cellulare. Incubare a temperatura ambiente per 10 minuti prima di centrifugare e utilizzare PBS per lavare le cellule due volte dopo la fissazione. Conservare a quattro gradi Celsius fino a quando tutti i campioni non sono stati elaborati.

Per trattare i campioni di STV a zero minuti più, centrifugare le provette, rimuovere il surnatante e utilizzare 15 microlitri di STV 2%BSA e 0,1% di sodio azi in PBS per risospendere il pellet cellulare incubare su ghiaccio per 30 minuti. Quindi centrifugare e utilizzare il PBS per lavare le cellule due volte dopo la fissazione con PFA, come appena dimostrato, portare i campioni a quattro gradi Celsius per i campioni di 30 minuti. Dopo la centrifuga e la rimozione del supernat, utilizzare PBS 2%BSA per sciogliere i campioni.

Incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti prima di lavare con PBS e fissare con PFA. Quindi conservare i campioni a quattro gradi Celsius per i 30 minuti più i campioni STV. Dopo la pellettatura, sospendiamo i campioni in 200 microlitri di PBS 2%BSA, a seguito di un'incubazione a 37 gradi Celsius per 30 minuti.

Centrifugare e risospendere le cellule in 50 microlitri di STV 2%BSA 0,1%Sodium azi in PBS, incubare su ICE per 30 minuti prima di lavare e fissare. Quindi, dopo aver permeato e colorato tutti i campioni con STV SI tre, seguendo i dettagli nel protocollo di testo, ha conservato i campioni a quattro gradi Celsius. Infine, analizzare i campioni mediante citometria a flusso.

Determinare la percentuale di CY tre cellule positive in ciascun campione. Calcola la percentuale di virus attaccato e la quantità relativa di virus internalizzato. Secondo il protocollo di testo, come mostrato qui nel campione a zero minuti, il virus ated è legato a freddo alle cellule bersaglio come visualizzato da St.V.SI tre colorazioni.

Quando l'STV viene applicato come fase di blocco, il virus sulla superficie cellulare non può più essere rilevato dalla colorazione S St.V.SI tre, riducendo fortemente il segnale. Quando la temperatura viene aumentata a 37 gradi Celsius, il virus attaccato viene assorbito nelle cellule. Il virus internalizzato non è sensibile al blocco con STV non marcato, con conseguente calo meno drammatico dell'intensità del segnale nei 30 minuti e più campioni di STV mostrati.

Ecco le percentuali di tre cellule SI positive per tutte le condizioni sperimentali descritte in questo video. Le finte cellule infette forniscono l'intensità del segnale di fondo per l'esperimento e fungono da controllo negativo per l'attaccamento del virus. Un'altra neuraminidasi di controllo abroga fortemente l'attaccamento IAV del 90% rispetto alle cellule non trattate.

Il sodio azi, che esaurisce un TP, inibendo così l'endocitosi, ha inibito l'internalizzazione delle particelle virali sia durante che dopo l'infezione, come mostrato qui dopo il trattamento con sodio azi Le cellule incubate per 30 minuti a 37 gradi Celsius hanno mostrato un drastico calo dell'internalizzazione rispetto alle cellule non trattate incubate nelle stesse condizioni. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come misurare l'attaccamento e l'internalizzazione dell'influenza, un virus in 5 0 9 cellule. Questo protocollo consente una comoda lettura mediante citometria a flusso e può essere facilmente adattato ad altri contesti sperimentali.