Trasporto di membrana processi analizzati da un altamente parallelo sistema Nanopore Chip a risoluzione della proteina singolo

L'obiettivo generale di questa piattaforma basata su chip a nanostruttura è analizzare la funzione delle proteine di membrana a livello molecolare singolo in modo altamente parallelo. Grazie alla sua capacità di risolvere singole proteine, si ottengono nuove conoscenze sul trasporto e sul flusso di membrana. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle proteine di membrana, come la conducibilità o il comportamento di trasporto di singoli canali o trasportatori, specialmente con carichi non elettrogenici.

Il vantaggio principale di questa tecnica è il suo elevato parallelismo derivato dalla progettazione di chip a nanostruttura, con centinaia di migliaia di nanopori e la lettura fluorescente degli eventi di trasporto. Le implicazioni di questa tecnica si estendono a ciò che sta creando i migliori saggi di librerie efficaci per le proteine di membrana. Perché la piattaforma basata su chip consente la registrazione del trasporto altamente parallela e automatica.

In generale, le persone che non conoscono questo metodo impareranno rapidamente come gestire la tecnica presentata. L'obiettivo è sempre stato quello di creare un test di facile utilizzo in modo che tutti gli interessati potessero adottarlo. Questo saggio di trasporto a membrana utilizza un silicio su wafer isolato, progettato utilizzando l'incisione ionica di reazione.

Da ciascun wafer vengono fabbricati circa 1.000 chip di analisi. Ogni chip contiene 250.000 microcavità. Queste cavità vengono sigillate da doppi strati lipidici contenenti le proteine di trasporto di interesse.

La membrana costituisce l'interfaccia del sensore. Inizialmente, i materiali fluorescenti sono contenuti su un lato del doppio strato lipidico, corrispondente all'interno dei liposomi da cui sono composti. Ogni cavità è indirizzabile tramite una lettura a fluorescenza multispettrale.

Uno strato superiore opaco blocca i segnali fluorescenti provenienti dal serbatoio tampone, rendendo il biochip compatibile con i microscopi a fluorescenza invertita. Utilizzando la microscopia a forza atomica, le aperture dei pori disposte uniformemente e la rugosità superficiale dello strato di biossido di silicio sono state misurate a 3,6 nanometri, ottimali per la fusione delle vescicole. La microscopia elettronica a scansione mostra una sezione trasversale attraverso un nanoporo, che accede alle cavità dei femtolitri all'interno del chip di silicio.

Questo video mostra la preparazione dei proteoliposomi, la preparazione dei chip per il test e l'esecuzione del test di base. Collegare un pallone a fondo tondo lavato con etanolo a un evaporatore rotante. Asciugare il film lipidico per 40 minuti a 300 millibar, 30 gradi Celsius di temperatura del bagnomaria e velocità di rotazione massima per formare un film lipidico omogeneo sulla parete di vetro del pallone.

Quindi, utilizzando una pompa ad alto vuoto, asciugare il film lipidico per altri 30 minuti a temperatura ambiente. Quindi, aggiungi cinque millilitri di tampone e otto perle di vetro lavate con etanolo al pallone per realizzare le vescicole multilamellari. Collegare il pallone all'evaporatore rotante e ruotare senza vuoto a 50 gradi Celsius alla massima velocità.

Dopo 45 minuti, la soluzione apparirà lattiginosa, senza film lipidico residuo sulle pareti. Trasferire il pallone sotto un gas inerte in un bagno ad ultrasuoni e sonicarlo per quattro minuti a temperatura ambiente. La sonicazione interrompe i liposomi rendendoli unilamellari.

Ora, dividere la soluzione LUV in aliquote da un millilitro ed eseguire cinque cicli di congelamento e scongelamento utilizzando azoto liquido e un bagno d'acqua a 40 gradi Celsius. Questo porta alla rottura, al riarrangiamento e alla crescita dei liposomi. Nell'ultima fase di congelamento, conservare tutti i campioni a meno 80 gradi Celsius.

Prima di ricostituire un'aliquota LUV, estrudere i liposomi facendo passare l'aliquota attraverso una membrana filtrante in policarbonato da 400 nanometri per 17 volte, utilizzando un mini-estrusore. Quindi, destabilizzare i LUV aggiungendo il 4% di Triton X-100 per lo 0,25% in soluzione. Incubare la miscela per cinque minuti a 50 gradi Celsius.

Ora, mescola una parte di MscL purificato e modificato in 20 parti di liposomi saturi di detergente e continua l'incubazione per 30 minuti. Dopo l'incubazione, prendere un'aliquota da 100 microlitri e aggiungere un volume di calcina da 30 millimolari. Incubare questa miscela per cinque minuti a 50 gradi Celsius.

A questo punto, rimuovere il detergente dal campione trattato con calcina e non trattato. Aggiungere bio-perle umide in tampone Tris a ciascuna e incubarle per una notte a quattro gradi Celsius su una piastra rotante. Prima dell'esperimento, testare un preparato utilizzando un saggio di attività.

Per iniziare, mescola la base di elastomero nell'agente indurente ed essicca completamente la miscela in modo che sia inorridita. L'adesivo deve essere utilizzato entro 30 minuti quando è pronto. Nel frattempo, prendendo precauzioni, pulire un vetrino di copertura utilizzando cinque millilitri di cloroformio, applicato da una siringa di vetro, e lasciare asciugare il vetrino.

A questo punto, utilizzando una pipetta da 10 microlitri, depositare l'adesivo preparato sul vetro di copertura. Quindi, rimuovere con cautela un chip dal pannello wafer utilizzando una pinzetta fine. Con il lato rivestito del chip rivolto verso l'alto, depositalo sull'adesivo e strofinalo delicatamente sul vetrino per distribuire uniformemente l'adesivo.

Non lasciare che le bolle d'aria rimangano intrappolate sotto o che l'adesivo penetri sopra il chip. Inoltre, fare il gruppo in modo che si adatti al supporto del carrello a otto camere. Ora essiccare gli assemblaggi per due ore a 65 gradi Celsius in un essiccatore ad armadio.

Successivamente, rimuovere lo strato protettivo sui trucioli con alcuni lavaggi con solvente a 54 gradi Celsius. Per prima cosa posiziona i chip montati in un supporto per vetrini. Quindi, incubarli in tre bagni di solvente per 10 minuti ciascuno.

Isopropanolo, acetone e isopropanolo. Successivamente, lavare accuratamente e accuratamente le patatine con acqua ultra pura. Completa il processo essiccando i trucioli sotto un leggero flusso di azoto gassoso.

Ora, prepara un vetrino adesivo a otto pozzetti e mettilo all'indietro sul banco. Quindi, sollevare con cautela e premere i vetrini del coperchio sul vetrino adesivo con i trucioli rivolti verso i pozzetti. Lasciare riposare l'assemblaggio per qualche minuto prima di procedere.

Prima di procedere con il saggio di traslocazione, lavare accuratamente l'assemblaggio del chip, come descritto nel protocollo di testo, terminando con un bagno tampone Tris. Successivamente, sostituire la soluzione del bagno con il tampone DOPEd Tris, contenente cinque millimolari di cloruro di calcio e un colorante micromolare Oy647. Quindi, aggiungi i proteoliposomi alla camera del chip per una concentrazione finale di un milligrammo per millilitro e attendi un'ora.

Dopo un'ora, sciacquare le patatine quattro volte con 400 microlitri di tampone Tris senza calcio. Ora, aggiungere il colorante controllato a ciascun pozzetto a cinque micromolari e procedere con il saggio. Quindi, montare il supporto del chip sul microscopio a epifluorescenza e mettere a fuoco il bordo del chip nanoporo per trovare le microcavità.

Una volta che le microcavità sono a fuoco, scansionare l'array di nanopori per individuare una regione che mostri il rapporto di soffitto più alto. I dettagli sono forniti nel protocollo di testo. I liposomi sono stati preparati e controllati per la loro distribuzione dimensionale e dispersione.

I liposomi preparati erano più grandi del diametro dei pori per il test, il che è essenziale. Anche i liposomi monodispersi sono desiderabili. Prima dell'esperimento, la proteina MscL modificata nella preparazione del liposoma è stata controllata utilizzando un saggio di dequenching a fluorescenza.

Il rapporto tra i liposomi che ospitano MscL modificato attivo era adeguato per procedere con l'esperimento di traslocazione. Sul biochip è stata osservata la traslocazione del soluto di un bersaglio fluorescente attraverso il canale MscL modificato. Il modulatore chimico, MTSET, è stato utilizzato per aprire i canali MscL ingegnerizzati tramite repulsione elettrostatica.

È stata monitorata la successiva diminuzione della fluorescenza all'interno dello spazio della cavità. Questo processo si è dimostrato altamente riproducibile, con eventi di efflusso molto consistenti. Le curve di efflusso risultanti sono raggruppate in due popolazioni distinte, corrispondenti a eventi di traslocazione a canale singolo o multicanale.

Il sistema è stato in grado di seguire fino a tre coloranti fluorescenti unici con analisi in tempo reale. Ciò facilita la discriminazione precisa dei risultati positivi, degli eventi di efflusso monoesponenziale, della cinetica complessa, delle intrusioni lipidiche e delle rotture della membrana. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in fasi consecutive, ovvero la preparazione del chip, la preparazione del campione, l'imaging e l'analisi, rendendo modulare l'intero protocollo.