Name: Efficiente protocollo Isolamento da B e T linfociti umani da Palatine Tonsille (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Impara un protocollo rapido per isolare linfociti B e T da tonsille palatine umane. Questo metodo efficiente supporta la ricerca virologica sulle cause virali della tonsillite entro tre ore.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla Swedish Cancer Society (11 0253, 13 0469), dallo Swedish Research Council (K2012-99X-21959-01-3), dalla Marcus Borgströms Foundation e dallo Swedish Research Council attraverso una sovvenzione all'Uppsala RNA Research Centre (2006-5038-36531-16). Siamo in debito con la struttura centrale di BioVis presso l'Università di Uppsala per il grande aiuto con l'analisi FACS.

Il protocollo descrive l&#39;isolamento di cellule linfoidi dal materiale umano paziente e richiede quindi l&#39;approvazione etica. Il lavoro svolto in questo studio è stata concessa dalla Uppsala Ethical Review Board (DNR. 2013/387). 1. Isolamento di cellule mononucleate (MNC) da umani Palatine Tonsille ATTENZIONE: Tutto il materiale non schermati di origine umana come sangue, tessuti o fluidi corporei dovrebbe essere considerato come materiale potenzialmente infetto. Pertanto, pratiche di biosicurezza consigliate per la manipolazione dei tessuti umani devono essere seguite. Nota: Per evitare contaminazioni, tutte le soluzioni e le attrezzature colture cellulari devono essere sterili. Tutti i tamponi e le soluzioni devono essere pre-raffreddati e tenuti in ghiaccio. Tessuti di tonsille e cellule isolate dovrebbero essere tenuti e gestiti su ghiaccio. <ol><li> Ottenere tonsille fresche da pazienti sottoposti a tonsillectomia o tonsillotomia (Figura 2). Tuffatevi la Clum tessutips in un tubo da centrifuga da 50 ml contenente una soluzione sterile Hanks equilibrata sale ghiacciata (HBSS) supplementato con siero fetale bovino al 5% (FBS), glutammina 10 mM, 0,05 mg / ml di gentamicina e 1% mix antibiotici contro funghi (Penicillina, streptomicina e amfotericina B). </li><li> Tenere le provette con i campioni di tessuto tonsille sommersi in ogni momento sul ghiaccio. Provare per elaborare le tonsille nel più breve tempo possibile, e comunque entro 3 ore dopo la rimozione chirurgica. </li><li> Posizionare la tonsilla su una cella di plastica piastra di coltura 60 millimetri su ghiaccio e mantenere il tessuto inumidito con HBSS. Rimuovere coaguli di sangue visibili, adiposo e tessuto connettivo con una pinza pulita dalla superficie tonsille. </li><li> Utilizzare una nuova piastra di coltura cellulare 60 millimetri contenente 5 ml di HBSS. Tagliare il ciuffo tessuto tonsillare in 3-10 frammenti mm utilizzando un paio di forbici sterili e / o un bisturi. </li><li> Preparare una nuova piastra di coltura cellulare 60 mm contenente 10 ml di HBSS e posizionare un colino plastica cella 100 micron nella soluzione HBSS. </li><li> Trasferire i dissframmenti tonsillari rifletteva nel colino cella con una pinza sterile. Usando l&#39;estremità stantuffo di una siringa di plastica, uniformemente spremere i frammenti di tessuto attraverso il filtro cella. Assicurarsi che i frammenti tonsillari sono totalmente immersi nel HBSS. </li><li> Eliminare il filtro cella con i resti di tessuto e trasferire la sospensione cellulare risultante dalla piastra di coltura cellulare 60 mm in un tubo di plastica da 50 ml centrifuga. Lasciare la provetta in ghiaccio mentre si procede con passo 1.8 e 1.9. </li><li> Nel caso di grandi tonsille, più grande di 2 cm (Figura 2), spremere i frammenti tonsille in due filtri cellulari per evitare l&#39;intasamento della rete nel filtro. </li><li> Ottenere il volume finale di 35 ml di sospensione cellulare. Nota: A questo punto è possibile preparare la sospensione di cellule per la crioconservazione (vedere la sezione 2). </li><li> Aggiungere 10 ml di soluzione di gradiente di densità Ficoll come in una nuova provetta da centrifuga da 50 ml. Sovrapporre delicatamente i suspens cellulariion (passo 1.9) sulla parte superiore della soluzione gradiente di densità. Evitare la miscelazione della sospensione cellulare e la soluzione gradiente di densità. Nota: La soluzione di gradiente di densità deve essere riscaldato a temperatura ambiente. </li><li> Centrifugare la sospensione cellulare in un rotore incernierato a 700 xg per 20 minuti a RT. Non attivare la funzione di freno alla centrifuga come frenata veloce può interrompere il gradiente. Inoltre, utilizzare la funzione di accelerazione più basso sul centrifuga. Nota: Dopo questo passo centrifugazione, osservare multinazionali come uno strato bianco soffice all&#39;interfaccia, e globuli rossi (RBC), fibroblasti e detriti cellulari come il sedimento sul fondo della provetta. </li><li> Raccogliere accuratamente lo strato multinazionali utilizzando una pipetta da 10 ml. Posizionare la sospensione cellulare in una nuova provetta da centrifuga da 50 ml. </li><li> Aggiungere 25 ml di PBS ghiacciato alla sospensione cellulare e girare il tubo a 300 xg per 5 minuti in un rotore incernierato a 4 ° C. </li><li> Rimuovere il surnatante con una pipetta 25 mle ripetere pellet cellulare lavaggio passo altre due volte. Infine risospendere il pellet cellulare in 15 ml di PBS. Nota: Dopo la fase di lavaggio finale, è possibile crioconservare la sospensione cellulare (vedi capitolo 2). </li><li> Applicare 10 ml di sospensione cellulare in camera di conteggio delle cellule emocitometro e contare il numero di cellule al microscopio. Distribuire la quantità appropriata di cellule (ad esempio, 2-3 x 10 7) in una provetta da 15 ml per centrifuga successiva separazione magnetica tallone. Tenere questo aliquota in ghiaccio fino al punto 3.2. </li></ol> 2. La crioconservazione delle cellule tonsillare <ol><li> Preparare medio di congelamento (90% FBS e il 10% DMSO) e tenerlo in ghiaccio. Per la conservazione a lungo termine mantenere i mezzi di comunicazione di congelamento a -20 ° C. </li><li> Determinare il numero totale di cellule utilizzando una camera di conteggio cellulare emocitometro (passo 1.15). Calcolare la quantità di terreno necessaria congelamento secondo la densità cellulare congelato desiderata (ad esempio, 10 7 cellules / ml di media di congelamento). </li><li> Centrifugare la sospensione cellulare a 300 xg per 5 min. Decantare il surnatante senza disturbare il pellet e risospendere il pellet cellulare in mezzo congelamento ghiacciato (dal punto 2.1). </li><li> Dispensare 1 ml aliquote della sospensione cellulare in fiale sterili progettati per lo stoccaggio a lungo termine in azoto liquido. Congelare le fiale in una camera isopropanolo e conservarli a -80 ° CO / N. Per la conservazione a lungo termine trasferire le fiale in azoto liquido contenente serbatoio o di una cella freezer -140 ° C. </li><li> Per scongelare fiale con cellule congelate, li riscaldare rapidamente in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C. Immediatamente quando scongelato, disperdere la sospensione cellulare in 10 ml di pre-riscaldato HBSS (con supplementi, punto 1.1) in una provetta da centrifuga da 15 ml. Spin il tubo a 300 xg per 5 min, rimuovere HBSS e risospendere il pellet cellulare alla densità cellulare desiderato in HBSS (con supplementi, punto 1.1). Nota: La vitalità della multinazionali after scongelamento è di importanza, in quanto la presenza di cellule morte diminuisce la resa finale purificata B e T linfociti. Nota: Secondo la nostra esperienza la vitalità cellulare meno 80% ridurrà l&#39;efficienza isolamento delle cellule. </li></ol> 3. selezione positiva di T linfociti Popolazione da tonsillare multinazionali Nota 1: Questo protocollo si basa sulla selezione positiva di umani linfociti T CD3 + da multinazionali tonsillari utilizzando sfere magnetiche accoppiate per l&#39;anticorpo CD3. E &#39;possibile iniziare questa sezione dal fresco (sezione 1) o congelati (sezione 2) multinazionali. Nota 2: Iniziare con 3 x 10 7 multinazionali. Non superare questo numero di cellulare, dal momento che le colonne di separazione possono intasare e questo ridurrà l&#39;efficienza di isolamento. Utilizzare le colonne più grandi se verranno trattati più celle. I volumi utilizzati in questo protocollo sono state sperimentalmente ottimizzati per il numero di cellule uscato nel nostro setup sperimentale. <ol><li> Preparare il tampone di separazione [PBS (pH 7,2), lo 0,5% di albumina sierica bovina (BSA) e 2 mM EDTA]. Filtrare il tampone di separazione attraverso un filtro da 0,45 micron e conservare a 4 ° C. </li><li> Spin sospensione PTM (passo 1.14) a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C. Risospendere il pellet risultante cellule in 240 microlitri (80 microlitri per 10 7 cellule) di tampone di separazione ghiacciato. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta sterile da 2 ml. </li><li> Aggiungere 20 ml di anticorpo CD3 magnetica alla soluzione cellulare. Incubare le provette per 1 ora a 4 ° C con continua miscelazione delicata per mantenere le cellule in sospensione. </li><li> Trasferire tutto di sospensione cellulare in una provetta da 15 ml contenente 5 ml di tampone di separazione ghiacciata per lavare le cellule. </li><li> Centrifugare la provetta a 300 xg per 10 min a 4 ° C in un rotore incernierato. </li><li> Nel frattempo, impostare il separatore magnetico e di colonna. Fissare il separatore magnetico per il supporto e posizionare la colonna nel SEPARator. Lavare la colonna applicando 500 ml di buffer di separazione ghiacciato. Gettare il flusso attraverso. </li><li> Inserire un nuovo tubo di raccolta 15 ml sotto la colonna. Tenere il tubo di raccolta sul ghiaccio. </li><li> Eliminare il surnatante (passo 3,5) di pipetta e risospendere delicatamente il pellet cellulare in 500 microlitri tampone di separazione. Applicare la sospensione cellulare sulla sommità della colonna pre-lavata e farlo funzionare attraverso. Nota: grumi di cellule possono ostruire la colonna e ridurre la portata così. Per evitare questo problema, inserire un filtro cella 40 micron plastica sulla parte superiore della colonna. Passando le cellule attraverso la maglia sarà altamente migliorare l&#39;efficienza di questo metodo. </li><li> Lavare la colonna 4 volte con 1,5 ml di tampone di separazione (500 microlitri per 10 7 cellule). Attendere il serbatoio colonna vuota (nessun liquido dovrebbe essere osservato nella colonna) prima di applicare il lavaggio successivo passo. Nota: Ottenere le cellule CD3 non marcati, considerati come frazione di linfociti B, in quanto sonoeluito nel tubo di raccolta. </li><li> Rimuovere la colonna dal separatore e posto in un nuovo tubo di raccolta da 15 ml. Pipettare 2 ml di tampone di separazione nella colonna. Utilizzando il pistone in dotazione con la colonna eluire i linfociti T selezionati positivamente, che sono considerati come la frazione di linfociti T. </li><li> Determinare il numero di cellule purificate (passo 1.15) se necessario. Sospensioni cellulari sono ora pronti per esperimenti a valle. </li></ol> 4. Citometria a flusso Analisi dei isolata tonsillare linfociti B e T ATTENZIONE: soluzione Paraformaldeide è irritante e sospetto cancerogeno. Indossare indumenti protettivi, guanti e proteggersi gli occhi / la faccia. Nota 1: Questo protocollo descrive il metodo per la colorazione diretta del B isolata e le cellule T per fluorescenza cellulare Attivato Ordinamento (FACS) analisi. Lo scopo principale di questa fase è quello di valutare la purezza della cella isolata popolazioni after CD3 anticorpo separazione magnetica. A tal fine stabilito B e marcatori di cellule T, si utilizzano anticorpi monoclonali fluoroforo coniugato CD20-FITC e CD2-APC. Anche l&#39;inserimento di anticorpi di controllo isotipo è altamente raccomandato per distinguere la non specifico &quot;sfondo&quot; legame di anticorpi CD2 e CD20 (vedi punto 4.8). Nota 2: E &#39;possibile mantenere le frazioni cellulari purificate in paraformaldeide 1% di soluzione (PFA) al buio a 4 ° C fino al momento della colorazione (ad esempio, il giorno dopo.). Anche la stessa procedura è applicabile se esiste un intervallo di tempo tra la colorazione e l&#39;analisi FACS. Ricorda che in entrambi i casi le cellule devono essere lavati correttamente con PBSA (PBS contenente 0,2% di BSA) tampone, prima della colorazione o l&#39;analisi FACS. <ol><li> Estrarre 6 x 10 6 cellule delle multinazionali dal punto 1.15 (prima di applicare alla colonna), frazione di linfociti B dal punto 3.9 e la frazione di linfociti T a partire dal punto 3.10. </li><li> Spin la cellasospensioni a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C con un rotore swing-out. </li><li> Rimuovere il surnatante con pipetta e lavare il pellet cellulare una volta con 1 ml di ghiacciata PBSA. Spin le sospensioni cellulari a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C. Rimuovere il surnatante con pipetta e risospendere il cellule in 600 ml di tampone PBSA ghiacciato. </li><li> Aggiungere 100 ml di sospensione cellulare al fondo di un tubo FACS. </li><li> Aggiungere 100 ml di PBS contenente il 10% di calore siero umano inattivato a ciascuna provetta, mescolare bene e incubare per ~ 1 minuti a temperatura ambiente oppure 20 minuti in ghiaccio. Nota: i linfociti B trasportano recettori Fc. Per bloccare il recettori Fc frazioni cellulari purificate sono incubati con 10% di siero umano inattivato al calore. Il siero umano inattivato al calore è da incubazione a 56 ° C per 1 ora. Dividete il calore siero inattivato in piccole aliquote e conservare congelati a -20 ° C. </li><li> Centrifugare la sospensione cellulare a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C in un swing-out rotore. </li><li> Rimuovere il surnatante con pipetta e lavare il pellet cellulare con 1 ml PBSA. Ripetere la centrifugazione (300 xg per 5 minuti a 4 ° C). </li><li> Aggiungere 100 microlitri PBSA in ciascun tubo in ghiaccio. Aggiungere la quantità appropriata di anticorpo monoclonale coniugato fluoroforo, secondo la raccomandazione del costruttore (ad esempio, 20 ml di anti-CD20 e / o 5 ml di anticorpi anti-CD2 in 100 ml di PBSA). Nota: Non dimenticare di assegnare provette di controllo sufficienti per l&#39;analisi FACS. In questo protocollo dovrebbero essere inclusi i seguenti controlli: 1) cellule colorate con gli anticorpi anti-CD2 e anti-CD20 individualmente, 2) cellule colorate con gli anticorpi anti-CD2 e anti-CD20 controllo isotipico singolarmente e, 3) celle senza aggiunta di anticorpi. </li><li> Brevemente vortice la provetta e incubare per 30 min a 4 ° C al buio. </li><li> Lavare 2 volte con PBSA. Aggiungere 2 ml di soluzione all&#39;1% PFA ai campioni. Lasciare le cellule rimangono nella soluzione PFA al 476; C al buio fino al momento dell&#39;analisi FACS. </li><li> Immediatamente prima di eseguire i campioni nella macchina FACS, lavare le cellule 2 volte con PBSA (300 xg per 5 minuti a 4 ° C). Campioni risospendere in 1 ml di PBS e mantenere a 4 ° C (o su ghiaccio), protetto dalla luce, prima della separazione sul citometro a flusso. </li><li> Fare l&#39;ordinamento FACS secondo il protocollo del citofluorimetro produttore. </li></ol> 5. PCR individuazione del DNA Adenovirus in isolati tonsillare linfociti B e T Nota 1: Le adenovirus hexon primer gene sono AdRJC1 (5&#39;-GACATGACTTTCGAGGTCGATCCCATGGA-3 &#39;) e AdRJC2 (5&#39;-CCGGCTGAGAAGGGTGTGCGCAGGTA-3&#39;) 11. Questi primer generano un amplicone di 139 bp. Il padrone di casa gene 18S rRNA può essere rilevato con primer tp206 (5&#39;-CCCCTCGATGCTCTTAGCTG-3 &#39;) e TP207 (5&#39;-TCGTCTTCGAACCTCCGACT-3&#39;). La dimensione prevista amplicone è di 300 bp. Nota 2: Ogni PCRcorsa comprende un controllo negativo (distillata H 2 O) e un controllo DNA positivo ottenuto da linea di cellule B umane (BJAB) infettate con il tipo di adenovirus umano 5 12. <ol><li> Estrarre il DNA (da almeno 1 x 10 6 cellule, passo 3.11) con membrana silicea metodo di purificazione basato su colonne. Estrarre RNA utilizzando fenolo e guanidina isotiocianato soluzione 13. </li><li> Aggiungere 100 ng di DNA da linfociti B e T di una miscela di reazione contenente tampone 1x HF, 0,2 mM di mix trifosfato di deossinucleotide (dNTP), 0,25 mM di ciascun primer e 1 U di alta fedeltà polimerasi DNA in un volume totale di 20 microlitri. </li><li> Eseguire amplificazione PCR con le seguenti condizioni di ciclo: 30 sec di denaturazione a 98 ° C, seguita da 30 cicli di 98 ° C per 10 sec, 67 ° C (hexon) o 58 ° C (18S rRNA) per 30 sec e 72 ° C per 30 sec. La reazione di PCR è stata conclusa con un passo estensione finale di 7 min a 72 ° C. </li><li> Separare il conseguente amplif PCRprodotti icazione su un gel di agarosio 1,5% in TBE 1x tampone e visualizzare le bande previsti dalla colorazione con colorante acido nucleico. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Uno dei fattori più importanti che influenzano il risultato di questo protocollo è l&#39;uso di materiale fresco tonsillare come materiale di partenza. Pertanto, i campioni di tonsille devono essere trattati entro 3 ore dopo l&#39;intervento chirurgico. Tonsille possono essere ottenuti da adulti e bambini. Il materiale tonsillare dai bambini è di solito più piccoli a causa della rimozione chirurgica parziale delle tonsille (tonsillotomy). Pertanto, il numero di multinazionali ottenuti da campioni tonsillotomia (1 x 10 <...

Le tonsille sono raccolte di tessuti linfoidi incapsulati in modo incompleto che si trovano sotto e a contatto con l'epitelio nel tratto aero-digestivo superiore. Solitamente il termine "tonsille" si riferisce alle tonsille palatine situate alle pareti laterali della parte orale della faringe. Le tonsille palatine accoppiate insieme alla tonsilla nasofaringea (adenoide), alle tonsille tubariche appaiate e alle tonsille linguali costituiscono il cosiddetto "anello di Waldeyer". Quest'ultimo è responsabile del contatto iniziale tra gli agenti patogeni inalati o ingeriti e i tessuti linfoidi del tratto aerodigestivo1,2. Infatti, numerosi studi hanno dimostrato che sia gli antigeni batterici che quelli virali possono essere rilevati nei campioni di tessuto delle tonsille palatino2-6.
Le tonsille palatine sono composte da un denso tessuto linfoide ricoperto da un epitelio stratificato squamoso non cheratinizzante. Le tonsille presentano numerose cripte, invaginazioni epiteliali, che penetrano nel parenchima aumentandone la superficie. Istologicamente, le tonsille palatine contengono numerosi follicoli linfoidi con centri germinali, che sono i siti di maturazione e differenziazione delle cellule B (aree delle cellule B). Allo stesso modo, le tonsille palatine inglobano le cellule T, che si trovano principalmente nelle regioni extrafollicolari (aree delle cellule T). Oltre alle cellule B e T, anche varie cellule dendritiche follicolari possono essere rilevate nelle tonsille palatine1,2. 
Grazie alla loro posizione anatomica, le tonsille palatine sono facilmente accessibili con interventi chirurgici. Ad esempio, la rimozione chirurgica delle tonsille, nota come tonsillectomia, viene eseguita di routine in tutto il mondo7. Nei bambini con iperplasia tonsillare, a volte viene utilizzata una rimozione chirurgica parziale delle tonsille (tonsillotomia), causando meno dolore postoperatorio ai pazienti. Considerando l'accumulo di vari agenti patogeni nelle tonsille, le tonsille rimosse chirurgicamente offrono un'opportunità unica per studiare l'influenza di agenti virali e batterici sulle funzioni dei linfociti tonsillari2,8. Inoltre, è possibile studiare se alcuni patogeni preferiscono risiedere in specifiche sottopopolazioni cellulari9. Inoltre, poiché le tonsille sono una ricca fonte di linfociti B, i linfociti B tonsillari isolati possono essere utilizzati in modo efficiente per studiare l'attività di diverse sottopopolazioni di cellule B10. Tuttavia, poiché le tonsille palatine contengono una miscela di tipi di cellule, è necessario un metodo efficiente per separare le diverse sottopopolazioni cellulari. 
Qui, descriviamo un metodo semplice per isolare in modo efficiente e rapido le popolazioni di cellule B e T tonsillari dalle tonsille palatine umane utilizzando una tecnica di separazione cellulare attivata magneticamente (Figura 1). Il metodo qui descritto è utile per gli scienziati che vogliono valutare il ruolo di diversi agenti infettivi negli organi linfoidi umani come le tonsille palatine.

<table><tbody><tr><td>Soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14175-053</td><td>Contiene il 5% di siero fetale bovino (FBS), 10 mM di glutammina, 0,05 mg/ml di gentamicina e 1% di miscela antibiotico-antimicotica</td></tr><tr>Mezzo <td></td><td></td><td>di congelamento</td><td>90% FBS e 10% DMSO tampone</td></tr><tr><td>MACS</td><td></td><td></td><td>PBS (pH 7,2), 0,5% BSA e 2mM EDTA</td></tr><tr><td>PBSA&nbsp;</td><td></td><td></td><td>PBS contenente lo 0,2% di BSA</td></tr><tr><td>, PFA</td><td></td><td></td><td>PBS contenente l'1% di paraformaldeide (PFA). Prepara fresco. Il PFA è sospettato di essere cancerogeno. Indossare guanti e occhiali.</td></tr><tr><td>Miscela antibiotico-antimicotica</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Petridish</td><td>Nunc</td><td>150326</td><td></td></tr><tr><td>Forbici da dissezione Fisher</td><td></td><td>Scientific 1381241</td><td></td></tr><tr><td>Forbici per iride diritte</td><td>Fisher Scientific</td><td>12912055</td><td></td></tr><tr><td>bisturi monouso</td><td>Swann-Morton</td><td>REF 0501</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; m filtro cellulare in plastica</td><td>Corning Life Sciences</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; m filtri per celle in plastica&nbsp;</td><td>Corning Life Sciences</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Siringa in plastica da 2 ml</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td></td><td></td>300185</tr><tr><td>provette da centrifuga coniche da 15 ml</td><td>SARSTEDT</td><td>62554502</td><td></td></tr><tr><td>provette da centrifuga coniche da 50 ml</td><td>SARSTEDT</td><td>62547254</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga a bassa velocità con rotore ad angolo fisso o a secchiello oscillante</td><td>Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ficoll&ndash; Hypaque</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5415-50ML</td><td>Ficoll soluzione</td></tr><tr><td>Fetale di vitello Biological</td><td>industries</td><td>040071A</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil solfossido (DMSO)</td><td>SIGMA</td><td>D2650-5X5ML MACS</td><td></td></tr><tr><td>MS colonne&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Microsfere CD3 umane MACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-881</td><td></td></tr><tr><td>Separatore MACS (Octo MACS)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-109</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>Merck Millipore</td><td>1120180100</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>AnalaR NORMAPUR</td><td>20302.293</td><td></td></tr><tr><td>CD2 coniugato alloficocianina ( CD2-APC)&nbsp;</td><td>BD Bioscienze&nbsp;</td><td></td><td></td>560642</tr><tr><td>CD20 coniugato all'isotiocianato di fluoresceina (CD20-FITC)&nbsp;</td><td>BD Bioscienze&nbsp;</td><td></td><td></td>556632</tr><tr><td>Siero umano&nbsp;</td><td>Rockland Immunochemicals</td><td>D119-0100</td><td></td></tr><tr><td>Phusion DNA polimerasi ad alta fedeltà</td><td>Thermo Scientific</td><td>F-530L</td><td></td></tr><tr><td>tubi FACS</td><td>BD Falcon</td><td>352003</td><td></td></tr><tr><td>Cryotube</td><td>SARSTEDT</td><td>72379</td><td></td></tr><tr><td>BD LSRII citometro</td><td>a flusso BD Biosciences&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva 4.1 software</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sangue Nucleospin&nbsp;</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740951.50</td><td>Kit di isolamento del DNA</td></tr><tr><td>Reagente TRIzol&nbsp;</td><td>Tecnologie di vita</td><td>15596</td><td>Reagente di isolamento dell'RNA</td></tr><tr><td>Emocitometro</td><td>The Paul Marienfeld GmbH & Co. KG</td><td>0610030</td><td>dispositivo contacellule</td></tr><tr><td>GelRed</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td>Colorazione su gel di acido nucleico&nbsp;</td></tr></tbody></table>

efficiente protocollo isolamento da b e t linfociti umani da palatine tonsille

Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils

Le tonsille formano una parte del sistema immunitario che fornisce la prima linea di difesa contro gli agenti patogeni inalati. Solitamente il termine "tonsille" si riferisce alle tonsille palatine situate alle pareti laterali della parte orale della faringe. Le tonsille palatine rimosse chirurgicamente forniscono una comoda fonte accessibile di linfociti B e T per studiare l'interazione tra agenti patogeni estranei e il sistema immunitario dell'ospite. Questo protocollo video descrive la dissezione e l'elaborazione delle tonsille palatine umane rimosse chirurgicamente, seguite dall'isolamento delle singole popolazioni di cellule B e T dallo stesso campione di tessuto. Presentiamo un metodo che separa in modo efficiente i linfociti tonsillari B e T utilizzando un protocollo di affinità anticorpo-dipendente. Inoltre, utilizziamo il metodo per dimostrare che l'adenovirus umano infetta specificamente la frazione di cellule T tonsillari. Il protocollo stabilito è generalmente applicabile per isolare in modo efficiente e rapido le popolazioni di cellule B e T tonsillari per studiare il ruolo di diversi tipi di patogeni nelle risposte immunitarie tonsillari.

Una separazione efficace dei tonsillari MNC risultati in sottopopolazioni altamente purificate di linfociti B e T. Ciò è stato confermato mediante analisi FACS utilizzando anti-CD20 e anti-CD2 per rilevare B T linfociti popolazioni, rispettivamente (Figura 3A). Al contrario, una separazione efficiente di MNC risultati in frazioni cellulari che sono una miscela di cellule di entrambe le sottopopolazioni di linfociti B e T (Figura 3B). Il linfociti T (...

Le tonsille palatine sono una ricca fonte di linfociti B e T. Qui forniamo un protocollo facile, efficiente e rapido per isolare i linfociti B e T dalle tonsille palatine umane. Il metodo descritto è stato specificamente adattato per gli studi sull'eziologia virale dell'infiammazione delle tonsille nota come tonsillite.

Efficiente protocollo Isolamento da B e T linfociti umani da Palatine Tonsille

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to ...

L'obiettivo generale di questa procedura è ottenere frazioni di linfociti BNT da campioni di tonsille umane. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della virologia, come ad esempio quali sono i ruoli delle frazioni di linfociti BT nella patogenesi delle malattie virali. Entro tre ore dal loro prelievo chirurgico, trasportare il tessuto tonsillare in laboratorio in una provetta centrifuga da 50 millilitri riempita con HBSS sterile e ghiacciato contenente integratori.Quindi, utilizzando le appropriate procedure di biosicurezza raccomandate per la manipolazione di tessuti umani, inumidire il tessuto con HBSS fresco contenente integratori e trasferire le tonsille in una piastra di coltura cellulare plastica da 60 millimetri posta su ghiaccio. Utilizzando pinzette, rimuovere eventuali coaguli di sangue visibili e i tessuti adiposi e connettivi, quindi trasferire le tonsille in una nuova piastra da 60 millimetri contenente cinque millilitri di HBSS con integratori.Successivamente, tagliare l'aggregato di tessuto tonsillare in frammenti di tre-dieci millimetri, quindi trasferire i frammenti in un filtro cellulare in plastica da 100 micrometri posto in una nuova piastra per colture cellulari da 60 millimetri contenente 10 millilitri di HBSS fresco con integratori, utilizzando delicatamente l'estremità del pistone di una siringa in plastica. Spingere i frammenti di tessuto attraverso il filtro cellulare, assicurandosi che i frammenti tonsillari rimangano completamente immersi nell'HBSS; una volta macerato tutto il tessuto, scartare il filtro e trasferire la sospensione cellulare ottenuta in un tubo da centrifuga in plastica da 50 millilitri posto sul ghiaccio.Portare la soluzione cellulare a un volume finale di 35 millilitri con HBSS fresco contenente integratori, quindi aggiungere 10 millilitri di soluzione a gradiente di densità a temperatura ambiente in alcuni tubi conici da 50 millilitri. Sovrapporre delicatamente le sospensioni cellulari sopra i gradienti di densità, avendo cura di non mescolare le soluzioni, quindi separare le cellule mediante centrifugazione. Le cellule mononucleate si separeranno formando uno strato bianco soffice all'interfaccia, mentre i globuli rossi, i fibroblasti e i detriti cellulari si troveranno nel sedimento in fondo al tubo.Utilizzando una pipetta da 10 millilitri, raccogliere con attenzione lo strato di cellule mononucleate e trasferire le cellule mononucleate in un nuovo tubo da 50 millilitri. Successivamente, lavare le cellule tre volte con 25 millilitri di PBS freddo ghiacciato per ogni lavaggio e risospendere il pellet finale in 15 millilitri di PBS. Dopo aver contato il numero di cellule vitali, porre le cellule sul ghiaccio per isolare le cellule T tonsillari mediante separazione con microsfere magnetiche.Centrifugare la sospensione di cellule mononucleate e risospendere il pellet in 80 microlitri di buffer di separazione ghiacciato per 1×10⁷ cellule. Trasferire quindi la sospensione cellulare in un tubo sterile da due millilitri e incubare con 20 microlitri di anticorpo magnetico CD3 per un'ora a quattro gradi Celsius con mescolamento delicato continuo. Al termine dell'incubazione, trasferire le cellule in un tubo da 15 millilitri contenente cinque millilitri di buffer di separazione ghiacciato e lavarle durante il lavaggio. Applicare il separatore magnetico sul supporto e caricare una colonna sul magnete.Lavare la colonna con 500 microlitri di tampone di separazione freddo di ghiaccio, quindi posizionare un filtro da 40 micrometri sulla sommità della colonna. Ri-sospendere ora il pellet cellulare in 500 microlitri di tampone di separazione fresco e caricare le cellule attraverso il filtro sulla colonna, raccogliendo l'EIT contenente linfociti B in un tubo conico da 15 millilitri. Mettere sul ghiaccio quando tutte le cellule sono passate nel tubo di raccolta.Lavare la colonna quattro volte con 500 microlitri di buffer di separazione per ogni volta 10 alla sette cellule, attendendo che il serbatoio della colonna si svuoti prima di applicare il successivo lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, trasferire la colonna in un nuovo tubo da raccolta da 15 millilitri. Quindi, utilizzando lo stantuffo della colonna, spingere due millilitri di buffer di separazione attraverso la colonna fino al tubo per raccogliere la frazione di linfociti T CD3 positivi.Per analizzare le frazioni cellulari di linfociti B e cellule T isolate, centrifugare le frazioni cellulari positive per CD3 e negative per CD3 e lavare entrambi i gruppi cellulari con un millilitro di PBS integrato con 0,2% di BSA o PBSA dopo la seconda centrifugazione. Distribuire aliquote di 100 microlitri di cellule e PBSA nel numero appropriato di provette per l'etichettatura mediante citofluorimetria e aggiungere la quantità appropriata di anticorpo monoclonale o di controllo coniugato con fluoro 4 a ciascuna provetta. Successivamente, vortexare brevemente le provette e incubarle per 30 minuti a quattro gradi Celsius al buio. Al termine dell'incubazione,Lavare i tubi due volte con PBSA fresco e quindi fissare la colorazione cellulare con paraformaldeide al 1% per rilevare la presenza di DNA di adenovirus nelle cellule mediante PCR. Eseguire l'amplificazione PCR nelle condizioni di termociclaggio appropriate, separando i prodotti di amplificazione PCR risultanti su un gel di agarosio al 1,5% in tampone EDTA. Infine, visualizzare le bande risultanti con un adeguato colorante per acidi nucleici.Secondo protocolli standard, una corretta separazione delle cellule mononucleate tonsillari porta a sottopopolazioni altamente purificate di linfociti BNT, come confermato dall'analisi citofluorimetrica mediante l'uso di anticorpi anti-CD20 e anti-CD2 per rilevare rispettivamente le popolazioni di linfociti B e T. Al contrario, una separazione inefficiente delle cellule mononucleate produce frazioni cellulari costituite da una miscela di cellule appartenenti sia ai linfociti B che ai linfociti T. Le sottopopolazioni, nonché il DNA e l'RNA, possono essere estratti dai linfociti B e T separati mediante microsferette magnetiche per analisi successive, come appena dimostrato.Ad esempio, qui viene mostrata la rilevazione specifica del DNA di adenovirus nei linfociti T TONSOR, rilevata mediante PCR, con citoplasma di qualità. L'RNA può essere estratto anche dai linfociti B NT tonsillari isolati. Una volta ottenuti, due campioni di tonsille possono essere processati entro sei ore, se la tecnica viene eseguita correttamente.Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante processare i campioni tonsillari il più rapidamente possibile. Il numero dei passaggi di lavaggio e il volume del tampone di lavaggio sono anche parametri critici per ottenere un buon risultato. Seguendo questa procedura, altri metodi come la QPCR e la R-T-Q-P-C-R potrebbero essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande sulla presenza quantitativa di DNA e mRNA virale dopo il suo sviluppo.Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della virologia per esplorare la patogenesi e la latenza di diverse specie virali nei tessuti linfoidi umani. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come isolare frazioni di linfociti BT da campioni di tonsille umane. Non dimenticare che lavorare con materiali umani non sottoposti a screening, come sangue e tessuti, può essere estremamente pericoloso.Pertanto, si dovrebbero seguire pratiche di sicurezza adeguate.

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

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Con le funzioni effettrici distinto da altri sottoinsiemi di cellule T, le cellule Th17 sono stati implicati nel centro di autoimmunità infiammatoria. Questo protocollo vitro la differenziazione in Th17 fornisce un mezzo per determinare se naïve linfociti T CD4 + in grado di differenziarsi in cellule Th17, e di esaminare ulteriormente il loro ruolo nella autoimmunità e risposta dell'ospite.

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Isolamento e<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura di Vδ1<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; Celle γδ T, un Extrathymic αβT-cellule progenitrici

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L&#39;isolamento, la differenziazione e quantificazione di Human anticorpo-secernenti cellule B da sanguigno: ELISpot come una lettura funzionale del umorale immunità

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Isolamento delle cellule mononucleari del Tonsillar per studiare le risposte immunitarie innate Ex Vivo in un tessuto linfoide mucosale umano

Impara un protocollo rapido per isolare linfociti B e T da tonsille palatine umane. Questo metodo efficiente supporta la ricerca virologica sulle cause virali della tonsillite entro tre ore.

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