Efficiente protocollo Isolamento da B e T linfociti umani da Palatine Tonsille

L'obiettivo generale di questa procedura è ottenere frazioni di linfociti BNT da campioni di tonsille umane. Questo metodo può aiutare a rispondere alle domande chiave nel campo della virologia, come ad esempio quali sono i ruoli delle frazioni di linfociti BT nella patogenesi delle malattie virali Entro tre ore dalla loro rimozione chirurgica. Trasporta il tessuto tonsillare in laboratorio in una provetta da centrifuga da 50 millilitri riempita con HBSS sterile ghiacciato contenente integratori.

Quindi utilizzando le procedure di biosicurezza appropriate raccomandate per la manipolazione di tessuti umani. Inumidire il tessuto con un integratore fresco contenente HBSS e trasferire le tonsille su una piastra di coltura cellulare di plastica da 60 millimetri su ghiaccio. Usando una pinza, rimuovere eventuali coaguli di sangue visibili o tessuti adiposi e connettivi, quindi trasferire le tonsille in una nuova piastra da 60 millimetri contenente cinque millilitri di HBSS con integratori.

Quindi, taglia. Il tessuto tonsillare si aggrega in frammenti da tre a 10 millimetri, seguiti dal trasferimento dei frammenti in un colino cellulare di plastica da 100 micrometri in una nuova piastra di coltura cellulare da 60 millimetri contenente 10 millilitri di HBSS fresco con integratori utilizzando l'estremità dello stantuffo di una siringa di plastica senza problemi. Spremere i frammenti di tessuto attraverso il colino cellulare, assicurandosi che i frammenti tonsilari rimangano totalmente immersi nell'HBSS quando tutto il tessuto è stato macerato, scartare il colino e trasferire la sospensione cellulare risultante in una provetta da centrifuga di plastica da 50 millilitri su ghiaccio.

Portare la soluzione cellulare a un volume finale di 35 millilitri con integratori freschi contenenti HBSS, quindi aggiungere 10 millilitri di soluzione a gradiente di densità a temperatura ambiente in alcune provette coniche da 50 millilitri. Sovrapporre delicatamente le sospensioni cellulari sopra i gradienti di densità, facendo attenzione a non mescolare le soluzioni e quindi separare le cellule mediante centrifugazione. Le cellule mononucleate si separeranno in un soffice strato bianco all'interfaccia con i globuli rossi, i fibroblasti e i detriti cellulari situati nel sedimento sul fondo del tubo.

Utilizzando una pipetta da 10 millilitri, raccogliere con cura lo strato di cellule mononucleate ed estrarre le cellule mononucleate in una nuova provetta da 50 millilitri. Quindi lavare le celle tre volte in 25 millilitri di PBS ghiacciato per ogni lavaggio e risospendere il pellet finale in 15 millilitri di PBS. Dopo aver contato il numero di cellule vitali, posizionare le cellule sul ghiaccio per isolare le cellule T tonsoriali mediante separazione magnetica delle microsfere.

Abbassare la sospensione di celle mononucleate e risospendere il pellet in 80 microlitri di tampone di separazione ghiacciato per una volta 10 per le sette cellule. Quindi trasferire la sospensione cellulare in una provetta sterile da due millilitri e incubare in 20 microlitri di CD tre anticorpi magnetici per un'ora a quattro gradi Celsius con una miscelazione delicata continua per mantenere le cellule e la sospensione alla fine dell'incubazione, trasferire le cellule in una provetta da 15 millilitri contenente cinque millilitri di tampone di separazione ghiacciato e lavarle durante il lavaggio. Fissare il separatore magnetico al supporto e caricare una colonna sul magnete.

Lavare la colonna con 500 microlitri di tampone di separazione ghiacciato, quindi posizionare un colino da 40 micrometri sopra la colonna. Ora sospendi nuovamente il pellet della cella in 500 microlitri di tampone di separazione fresco e carica le celle attraverso il filtro sulla colonna raccogliendo la cella B contenente EIT in un conico da 15 millilitri. Due buche di ghiaccio quando tutte le cellule sono passate nella provetta di raccolta.

Lavare la colonna quattro volte con 500 microlitri di tampone di separazione per una volta da 10 a sette celle aspettando che il serbatoio della colonna sia vuoto prima di applicare il lavaggio successivo. Dopo l'ultimo lavaggio, trasferire la colonna in una nuova provetta di raccolta da 15 millilitri. Quindi, utilizzando lo stantuffo della colonna, premere due millilitri di tampone di separazione attraverso la colonna nella provetta per raccogliere la frazione di tre cellule T positive CD.

Per analizzare le frazioni isolate delle cellule del tonsone B e t, pellettare le frazioni cellulari CD tre positive e CD tre negative e lavare entrambi i set di cellule in un millilitro di PBS integrato con 0,2% BSA o PBSA dopo la seconda centrifuga. Distribuire aliquote da 100 microlitri di cellule e PBSA nel numero appropriato di provette per l'etichettatura via fax e aggiungere la quantità appropriata di anticorpi monoclonali coniugati al fluoro quattro o di controllo a ciascuna provetta. Quindi agitare brevemente i tubi e incubarli per 30 minuti a quattro gradi Celsius al buio alla fine dell'incubazione.

Lavare le provette due volte con PBSA fresco e quindi fissare la colorazione cellulare con aldeide paraforme all'1% per rilevare la presenza di DNA adenovirale nelle cellule mediante PCR. Eseguire l'amplificazione PCR nelle condizioni di ciclo appropriate, separando i prodotti di amplificazione PCR risultanti su un gel AGROS all'1,5% e un tampone EDTA interestate. Infine, visualizza le bande risultanti con la colorazione di acido nucleico appropriata.

Secondo i protocolli standard, una separazione riuscita delle cellule mononucleate tonsoriali si traduce in sottopopolazioni altamente purificate di linfociti BNT, come confermato dall'analisi citofluorimetrica utilizzando anticorpi anti CD 20 e anti CD due per rilevare rispettivamente le popolazioni di linfociti b e t. Al contrario, una separazione inefficiente delle cellule mononucleate si traduce in frazioni cellulari che sono una miscela di cellule dei linfociti b e t. Le sottopopolazioni, il DNA e l'RNA, possono essere estratti dai linfociti b e t separati da biglie magnetiche per l'analisi a valle, come appena dimostrato.

Ad esempio, qui, la rilevazione specifica del DNA dell'adenovirus nei linfociti TONSOR T rilevata mediante PCR si è dimostrata citoplasmatica di qualità. L'RNA può essere estratto anche da linfociti NT tonsoriali isolati. Una volta mostruosa, due campioni di tonsille possono essere elaborati entro sei ore se la tecnica viene eseguita correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante elaborare i campioni di tonsille il più velocemente possibile. Anche il numero delle fasi di lavaggio e il volume del tampone di lavaggio sono parametri critici per un buon risultato. Seguendo questa procedura, potrebbero essere eseguiti altri metodi come la QPCR e la R-T-Q-P-C-R per rispondere a ulteriori domande sulla presenza quantitativa di DNA virale e mRNA dopo il suo sviluppo.

Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della virologia per esplorare la patogenesi e la latenza di diverse specie virali nei tessuti linfoidi umani. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare le frazioni di linfociti BT da campioni di tonsille umane. Non dimenticare che lavorare con materiali non schermati di origine umana come sangue e tessuti potrebbe essere estremamente pericoloso.

Pertanto, dovrebbero essere seguite adeguate pratiche di sicurezza.