Specifiche Step-ordinamento di mouse spermatidi mediante citometria di flusso

L'obiettivo generale di questa procedura è separare gli spermatidi di topo in quattro popolazioni distinte, consentendo lo studio molecolare della spermiogenesi. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo della riproduzione cellulare, come ad esempio quale sia l'impatto della modellizzazione cromatica sull'integrità genomica. Il vantaggio principale di questa tecnica è che permette la separazione degli spermatozoi in popolazioni cellulari pure senza contaminazione incrociata.

L'idea per questo metodo è nata quando abbiamo osservato variazioni significative nell'intensità della colorazione del DNA durante il rimodellamento della cromatina in parametri aploidi. Il giorno prima dell'ordinamento cellulare, aggiungere uno o due millilitri di FBS inattivato per riscaldamento a provette coniche in polipropilene da cinque millilitri a fondo rotondo e da 15 e 50 millilitri. Il giorno successivo, ricoprire lentamente le provette mediante inversione notturna a quattro gradi Celsius su un agitatore rotante.

Versare con attenzione il FBS utilizzando una pipetta P200 per rimuovere eventuali residui di FBS dai tubi da 15 e 50 millilitri, lasciando un piccolo volume residuo di 100-200 microlitri di FBS nei tubi da 5 millilitri per raccogliere le cellule purificate nel giorno della separazione cellulare. Tritare i pezzi di tessuto incapsulati in 500 microlitri di buffer di separazione. Successivamente, trasferire i frammenti di tessuto in un tubo da 1,5 millilitro utilizzando una punta di pipetta microtronca.

Sciacquare le cellule germinali dai tubuli seminiferi con pipettaggi delicati su e giù, seguiti da un risciacquo con una punta integra. Successivamente, utilizzare un filtro cellulare da 40 micron per rimuovere detriti e aggregati, raccogliendo il filtrato in un tubo conico da 50 millilitri rivestito con FBS. Lavare il filtro una volta con buffer di sorting fino a un volume totale di tre millilitri e trasferire il filtrato in un tubo conico da 15 millilitri rivestito con FBS.

Quindi aggiungere 16 microlitri di EDTA per millilitro di sospensione cellulare alle cellule e utilizzare una pipetta da 10 millilitri per fissare lentamente le cellule nell'arco di un minuto con tre volumi di etanolo al 100% ghiacciato, vortexando a bassa velocità; dopo la fissazione, la sospensione diventerà lattescente. Incubare le cellule sul ghiaccio per 15 minuti con inversioni occasionali. Quindi centrifugare la sospensione cellulare, risospendere il pellet in due millilitri di buffer di sorting e colorare le cellule germinali con quattro microlitri di cyto 16 DNAD immediatamente prima dell'ordinamento.

Filtrare le cellule attraverso un filtro da 50 micron in un tubo FACS rivestito con FBS e lavare accuratamente il filtro con uno o due millilitri di buffer di sorting. Caricare le cellule germinali fissate su un citofluorimetro dotato di laser a 488 nanometri. Successivamente, visualizzare gli eventi totali con un istogramma che rappresenti il numero di eventi rispetto all'area del segnale Alexa Fluor 488 e selezionare le cellule con colorazione positiva per il DNA.

Quindi visualizzare le cellule da questo gate in un grafico di dispersione laterale (area) contro dispersione anteriore (area) e definire un gate. Le cellule così selezionate vanno visualizzate in un grafico di dispersione anteriore (area) contro area di Alexa Fluor 488, quindi definire un ulteriore gate. Successivamente, visualizzare queste popolazioni selezionate in grafici separati di larghezza di Alexa Fluor 488 contro area di Alexa Fluor 488.

Le fasi della spermiogenesi da uno a nove e da dieci a dodici. I spermatidi possono quindi essere selezionati per l'ordinamento al fine di raccogliere le fasi da tredici a quattordici e da quindici a sedici. I spermatidi mostrano le cellule del primo gate in un grafico dell'area dello scatter in avanti rispetto all'area EXOR 4 88 e del gate.

Le popolazioni cellulari come indicato. Quindi visualizzare questi parametri in singoli Alexa. Larghezza del pavimento 4 88 rispetto ai grafici dell'area del pavimento Alexa 4 88 e impostare il parametro.

Passaggi da 13 a 14 e da 15 a 16 per il sorting degli spermatozoi. Infine, raccogliere le frazioni purificate in 100-200 microlitri di FBS in singoli tubi rotondi da cinque millilitri rivestiti con FBS e mantenuti sul ghiaccio. In queste immagini è mostrata la colorazione dappy delle popolazioni di spermatozoi separate mediante flow sorting.

I passaggi della spermiogenesi da uno a nove mostrano tipicamente nuclei di forma rotonda che appaiono ovali durante la spermiogenesi. I spermatidi del passaggio nove, e quelli osservati come uncini allungati nei passaggi da 10 a 12. I spermatidi nei passaggi della spermiogenesi da 13 a 14 e da 15 a 16 presentano nuclei con una forma simile, ma con una leggermente diversa intensità di colorazione del DNA, che permette di identificare queste distinte popolazioni di spermi durante il loro ordinamento mediante citometria a flusso.

Secondo il protocollo dimostrato, la purezza delle singole popolazioni sperimentali di S può essere compresa tra il 95 e il 100%. Questa tecnica può essere completata in sei-otto ore, a condizione che ogni passaggio venga seguito correttamente. È importante ricordare di mantenere sempre le cellule sul ghiaccio durante tutta la procedura; seguendo questa procedura, è possibile ottenere popolazioni distinte di spermatozoi, fornendo una quantità sufficiente di materiale per analisi molecolari, come la caratterizzazione del drammatico processo di rimodellamento della cromatina o lo studio dell'impatto genetico di questa transizione.