Specifiche Step-ordinamento di mouse spermatidi mediante citometria di flusso

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di separare gli spermatidi di topo in quattro popolazioni distinte, consentendo lo studio molecolare della spermiogenesi. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della riproduzione speculare, come ad esempio qual è l'impatto della modellazione cromatica sull'integrità genomica. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce la separazione degli spermatozoi in una popolazione di cellule pure senza contaminazione incrociata.

Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando abbiamo osservato importanti variazioni nell'intensità della colorazione DN durante il rimodellamento della cromatina nei parametri dell'aplo il giorno prima dello smistamento cellulare. Aggiungere uno o due millilitri di FBS inattivato a caldo a fondo tondo in polipropilene da cinque millilitri e tubi conici in polipropilene da 15 e 50 millilitri. Quindi rivestire lentamente i tubi mediante inversione notturna a quattro gradi Celsius su un rotatore il giorno successivo.

Decantare accuratamente l'FBS utilizzando una pipetta P 200 per rimuovere eventuali residui di FBS dalle provette da 15 e 50 millilitri e lasciando un piccolo volume residuo di 100-200 microlitri di FBS nelle provette da cinque millilitri per la raccolta delle cellule purificate il giorno della cellula. Smistamento, tritare i pezzi di prova incapsulati in 500 microlitri di tampone di smistamento. Quindi trasferire i frammenti di tessuto in una provetta da 1,5 millilitri utilizzando una punta per micropipetta troncata.

Lavare le cellule germinali dai tubuli seminiferi con un pipettaggio delicato su e giù, seguito da un lavaggio con una punta intatta. Successivamente, utilizzare un filtro cellulare da 40 micron per rimuovere i detriti e i grumi che raccolgono il filtrato in un tubo conico da 50 millilitri rivestito in FBS. Lavare una volta il filtro con un tampone di selezione fino a un volume totale di tre millilitri e trasferire il filtrato in un tubo conico da 15 millilitri rivestito in FBS.

Quindi aggiungere 16 microlitri di EDTA per millilitro di sospensione cellulare alle cellule e utilizzare una pipetta da 10 millilitri per fissare lentamente le cellule nell'arco di un minuto con tre volumi di etanolo ghiacciato al 100% mentre a bassa velocità, la sospensione diventerà lattiginosa dopo la fissazione. Incubare le cellule sul ghiaccio per 15 minuti con inversione occasionale. Quindi centrifugare la sospensione cellulare, risospendere il pallet in due millilitri di tampone di selezione e colorare le cellule germinali con quattro microlitri di cyto 16 DNAD immediatamente prima della cernita.

Filtrare le celle attraverso un filtro da 50 micron in un tubo fax rivestito in FBS e lavare accuratamente il filtro con uno o due millilitri di tampone di selezione. Caricare le cellule germinali fissate su una selezionatrice di celle dotata di laser a 488 nanometri. Successivamente, visualizza gli eventi totali con un istogramma che rappresenta il numero di eventi rispetto all'area Alexa floor 4 88 e controlla le cellule di colorazione del DNA positive.

Quindi visualizza le celle da questo gate in un'area di dispersione laterale rispetto a un grafico e un gate dell'area di dispersione in avanti. Le celle, come indicato, visualizzano queste celle gate in un'area di dispersione in avanti rispetto a un'area Alexa floor 4 88, tracciano e cancellano. Le celle visualizzano nuovamente questi cancelli in grafici separati del piano Alexa 4 88 di larghezza rispetto al piano Alexa 4 88

Le fasi della spermiogenesi da uno a nove e da 10 a 12. Gli spermatidi possono quindi essere selezionati per lo smistamento per raccogliere i passaggi da 13 a 14 e da 15 a 16. Gli spermatidi mostrano le cellule dal primo gate in un'area di scatter in avanti rispetto a un grafico e un gate di area EXOR 4 88.

Le popolazioni cellulari come indicato. Quindi visualizza questi cancelli in Alexa individuale. Piano 4 88 larghezza contro Alexa piano 4 88 aree trame e cancello.

I passaggi da 13 a 14 e da 15 a 16 spermatozoi per lo smistamento. Infine, raccogliere le frazioni purificate in 100-200 microlitri di FBS in singoli tubi a fondo tondo da cinque millilitri rivestiti di FBS su ghiaccio. In queste immagini viene mostrata la colorazione dappy delle popolazioni colpite ordinate a flusso.

I passaggi da uno a nove spermatidi della spermiogenesi mostrano tipicamente nuclei di forma rotonda che appaiono di forma ovale nella spermiogenesi. Fase nove spermatidi, e che si osservano come uncini allungati nei passaggi da 10 a 12. Gli spermatidi mostrano nuclei con una forma simile, ma con un'intensità di colorazione del DNA leggermente diversa, che consente di identificare queste distinte popolazioni di sper durante il loro smistamento mediante citometria a flusso.

Seguendo il protocollo dimostrato, ci si può aspettare che la purezza delle singole popolazioni sperimentate di S sia compresa tra il 95 e il 100%. Se ogni passaggio viene seguito correttamente. È da ricordare di mantenere sempre le cellule in ghiaccio durante tutta la procedura seguendo questa procedura per ottenere popolazioni distinte di spermatozoi, fornendo una quantità sufficiente di materiale per l'analisi molecolare, come caratterizzare il drammatico processo di rimodellamento o per studiare l'impatto genetico di questa transizione.