2.14: Quantificazione della durata della vita degli invertebrati

Gli esperimenti di quantificazione della durata della vita consentono agli scienziati di esaminare le influenze genetiche e ambientali sulla durata della vita di un organismo. Gli organismi modello di invertebrati, come il moscerino della frutta Drosophila melanogaster e il nematode Caenorhabditis elegans, si sono dimostrati estremamente utili in questo senso. Eseguendo esperimenti che misurano e manipolano la durata della vita in questi organismi, gli scienziati hanno iniziato a capire i fattori che influenzano il processo di invecchiamento.

In questo video imparerai alcuni principi alla base della durata della vita e dell'invecchiamento, i protocolli di base per misurare la durata della vita nel verme e nel moscerino della frutta e i modi in cui questi esperimenti vengono applicati.

Prima di esaminare le procedure sperimentali per misurare la durata della vita, è importante capire cosa sono la durata della vita e l'invecchiamento.

La durata della vita è la quantità di tempo in cui un organismo vive e funziona, tra la nascita e la morte. Alcuni organismi, come molte piante, potrebbero teoricamente vivere per sempre. Nel frattempo, la maggior parte degli animali smetterebbe naturalmente di crescere, anche in condizioni ideali, dopodiché invecchieranno o "senescranno" fino alla morte.

Gli scienziati non hanno ancora capito completamente perché gli organismi invecchiano. Diversi fattori, tra cui le radiazioni e i danni chimici dall'ambiente e i sottoprodotti tossici dei nostri processi metabolici, sono stati tutti suggeriti per svolgere un ruolo nell'invecchiamento.

Per studiare questi fattori, i ricercatori hanno sfruttato i brevi tempi di generazione di organismi modello di invertebrati, come vermi e mosche, che consentono agli scienziati di osservare più generazioni nell'arco di giorni o settimane, piuttosto che mesi, come nel caso di modelli di mammiferi come i topi. Sono anche abbastanza suscettibili alla manipolazione genetica, con molti strumenti disponibili che consentono di attivare o disattivare facilmente geni specifici per osservare i loro effetti sul processo di invecchiamento.

Ora che abbiamo appreso perché i modelli di invertebrati sono molto suscettibili di studi sull'invecchiamento, diamo un'occhiata a come vengono eseguiti gli esperimenti per misurare la durata della vita nei vermi. In breve, questi esperimenti prevedono la raccolta di vermi genitori, la sincronizzazione dell'età della loro progenie, il trattamento dei vermi larvali con un farmaco per inibire la riproduzione e infine il trasferimento dei vermi su piastre di prova e il conteggio dei vermi vivi o morti.

All'inizio della procedura, è necessario ottenere un numero sufficiente di animali della stessa età sincronizzando un lotto di vermi per deporre tutte le uova contemporaneamente. Per fare ciò, i primi vermi vengono lasciati sulla stessa piastra di coltura per circa una settimana, consentendo loro di consumare tutto il cibo disponibile e inducendo così la fame. Alcune delle larve di vermi che muoiono di fame entreranno in uno stato resistente e di arresto della crescita chiamato "dauer". Quindi, queste larve di dauer vengono spostate su un piatto fresco. In questo ambiente ricco di cibo, le larve di dauer riprenderanno il loro ciclo vitale e diventeranno giovani adulti maturi dal punto di vista riproduttivo.

Infine, dopo due giorni, questi vermi adulti vengono trasferiti su un altro piatto fresco e lasciati deporre le uova per un massimo di 24 ore. Una volta acquisito un numero sufficiente di uova, gli adulti vengono rimossi dal piatto e le uova vengono incubate a 20? C per 2-3 giorni per consentire ai vermi di schiudersi e crescere fino allo stadio larvale L4.

Per misurare la durata della vita dei vermi, queste larve vengono trasferite su piastre contenenti il farmaco FUDR, che sopprime la riproduzione dei vermi senza influire sulla durata della vita adulta. Nel corso dell'esperimento, per determinare se i vermi sono vivi o morti, la piastra può essere picchiettata per osservare il movimento dei vermi. Per i vermi più anziani, potrebbe essere necessario pungolare delicatamente la testa del verme per suscitare una risposta. Rimuovi i vermi morti e registra il numero di vermi morti e vivi. Gli animali devono essere trasferiti in piatti freschi ogni 2-3 giorni per evitare la fame.

Ora che ti abbiamo mostrato la quantificazione della durata della vita nei vermi, esaminiamo come viene eseguita nei moscerini della frutta. In breve, la procedura prevede di consentire alle femmine di deporre le uova in una gabbia speciale, raccogliere le uova, consentire alle larve di svilupparsi in mosche, ordinare le mosche in base al sesso e infine contare le mosche morte che compaiono nel tempo.

Per ottenere mosche di pari età, le mosche adulte vengono poste in una gabbia di raccolta delle uova, che contiene piastre di succo di frutta e agar striate di pasta di lievito. Le uova raccolte vengono lavate, messe in bottiglie di crescita larvale e incubate per circa 10 giorni per lo sviluppo delle mosche. I moscerini adulti di un giorno vengono quindi trasferiti in bottiglie di cibo per adulti e incubati per due giorni per consentire loro di raggiungere la maturità sessuale.

Questi moscerini vengono quindi raccolti, anestetizzati e smistati in maschi e femmine per evitare di confondere le misurazioni della durata della vita con fattori specifici del sesso. Successivamente, le mosche dello stesso sesso vengono messe in fiale di crescita. Ogni due giorni, le mosche dovrebbero essere "girate" in nuove fiale con cibo fresco. Le mosche morte vengono valutate contando quelle rimaste nella vecchia fiala, così come quelle che sono cadute nella nuova fiala.

Ora che hai appreso i protocolli di base per misurare la durata della vita nei modelli di invertebrati, diamo un'occhiata a come gli scienziati stanno adattando queste tecniche allo studio della biologia dell'invecchiamento e della longevità.

I ricercatori stanno studiando gli effetti di diversi fattori, come la temperatura e i farmaci, sulla durata della vita. In questo particolare studio, gli scienziati hanno coltivato vermi in terreni liquidi in piastre per microtitolazione a 96 pozzetti, in modo da poter testare contemporaneamente gli effetti di più sostanze e condizioni di crescita. Hanno scoperto che, ad esempio, far crescere i vermi a 25 anni? C, piuttosto che 20? C, ha diminuito la durata della vita dei vermi, così come le alte concentrazioni del farmaco antidepressivo Mirtazepina.

I saggi della durata della vita possono anche essere combinati con tecniche come l'interferenza dell'RNA, o RNAi, per identificare i geni che influenzano la sopravvivenza degli animali. L'RNAi è una potente tecnica sperimentale che utilizza RNA corti per diminuire, o "abbattere", il livello di espressione di un gene bersaglio. Qui, gli scienziati hanno trattato i vermi con RNAi contro il gene bec-1, quindi li hanno infettati con il batterio patogeno Salmonella e hanno eseguito un test di sopravvivenza. I vermi con bec-1 abbattuto hanno mostrato una marcata diminuzione della durata della vita rispetto ai vermi in cui il gene si esprime normalmente.

Infine, gli esperimenti di quantificazione della durata della vita vengono utilizzati per valutare l'effetto di diverse condizioni di crescita sulla longevità degli animali. In questo esperimento, gli scienziati hanno coltivato vermi di pari età su una serie di piastre con quantità variabili di cibo batterico. È stato osservato che questo regime di crescita, chiamato restrizione calorica o dietetica, ha un effetto significativo sulla durata della vita dei vermi.

Hai appena visto il video di JoVE sulla quantificazione della durata della vita nei modelli di invertebrati. Questo video ha discusso alcuni dei principi alla base dell'invecchiamento e della durata della vita, i protocolli per misurare la durata della vita in vermi e mosche e alcune applicazioni degli esperimenti di misurazione della durata della vita. In definitiva, la speranza è che questi esperimenti aiutino gli scienziati a trovare i fattori e i percorsi che controllano l'invecchiamento e consentano lo sviluppo di terapie per affrontare le malattie legate all'età, come l'Alzheimer e le malattie cardiovascolari. Grazie per l'attenzione!