Name: Sintesi di nanofibre cheratina-based per Ingegneria Biomedica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 43 s
Description: Scopri la sintesi di nanofibre a base di cheratina per applicazioni biomedicali mediante elettrofilatura. Questo metodo economico ed efficiente supporta la crescita cellulare e offre potenzialità in ingegneria tissutale, rigenerazione cutanea e rilascio controllato di farmaci.

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Gli autori desiderano ringraziare National Science Foundation attraverso Ingegneria Centro di Ricerca per rivoluzionare metallici Biomateriali (ERC-0.812.348) e delle nanotecnologie Undergraduate Education (CEE 1.242.139) per il finanziamento di sostegno.

Tutti protocollo segue le linee guida del North Carolina A &amp; T State University Office of Compliance Research ed etica. 1. preparazione chimica per la cheratina estrazione 4 <ol><li> Per preparare 1.000 ml di 2% peso / volume soluzione di acido peracetico (PAS), sotto una cappa aspirante aggiungere 20 ml di acido peracetico a 980 ml di acqua deionizzata (DI). </li><li> Per preparare 1.000 ml di soluzione di base 100 mM Tris (TBS), aggiungere 12,2 g di Tris Base a 1.000 ml di acqua deionizzata e mescolare fino a completa dissoluzione. </li><li> Preparare la soluzione diluita di acido cloridrico (DHAS) in una cappa aspirante versando 4 ml di acido cloridrico concentrato in 30 ml di acqua deionizzata. </li><li> Procurarsi circa 20 g di ritagli di capelli umani che non sono stati trattati chimicamente o alterati. I capelli possono essere di qualsiasi lunghezza. </li><li> Lavare completamente i capelli, a mano, con acqua calda e sapone. Utilizzare acqua deionizzata (DI) per il risciacquo finale. </li><li> Mettere i capelli in due 600 ml bicchieri e posto in un 80 ° C oven per 1 ora. </li><li> Scolate il liquido dal fondo del bicchiere e posizionare in forno finché i capelli è completamente asciutto. </li><li> Divide asciugato i capelli in modo uniforme tra i 600 ml bicchieri, mettendo 10 g di capelli in ogni bicchiere. Non consentire i capelli per riempire più di 500 ml. </li><li> Versare 500 ml di PAS in ciascun bicchiere facendo attenzione a coprire tutti i capelli. Coprire i bicchieri con parafilm e conservare per 12 ore. </li></ol> 2. Preparazione di cheratina Estratto Solution <ol><li> Separare i capelli dal PAS usando un setaccio da 500 micron. Raccogliere il PAS rifiuti in un contenitore separato. Lavare i capelli accuratamente con acqua deionizzata per eliminare ogni residuo PAS. </li><li> Posizionare i capelli risciacquati in un pallone da 500 ml. Versare 400 ml di TBS nel pallone, facendo in modo che i capelli sono coperti. Posto pallone in un bagno di agitazione impostato a 38 ° C, 65 giri al minuto per 1 ora. </li><li> Dopo 1 ora, togliere dal scuotendo bagno e versare il liquido, circa 400 ml di soluzione di estrazione di cheratina (KES), into un bicchiere da 1.000 ml. </li><li> Versare 400 ml di acqua deionizzata nel pallone contenente i capelli in modo che i capelli sono coperti e posto di nuovo nel bagno agitazione per 1 ora. Togliere il pallone dal bagno agitazione e versare i restanti 400 ml di KES nel becher 1.000 ml con il KES raccolti in precedenza. I capelli non è più necessario e può essere scaricato dal pallone e scartato nel recipiente cestino più vicino. </li></ol> 3. La concentrazione di cheratina Estratto Solution <ol><li> Riempire il bagno rotodistiller alla linea superiore con acqua distillata e impostare a 90 ° C. Impostare velocità di rotazione di 200 rpm. Accendere il liquido di raffreddamento chiller-pompa e impostare a -10 ° C. </li><li> Usando un misuratore di pH per controllare il pH della KES, utilizzare una pipetta per aggiungere lentamente 1 mM DHAS al KES fino a raggiungere un pH 7,0. Mescolare lentamente mentre si aggiunge la soluzione. </li><li> Versare il KES neutralizzato nelle 500 ml pallone a base tonda fino circa un quarto pieno. Eseguire il distillatore secondo il fornitore diprotocollo per 1,25 ore. <ol><li> Ripetere il punto 3.3 fino a quando tutto il KES è stato distillato. Assicurarsi che il pallone viene collegato strettamente. </li></ol></li></ol> 4. Dialisi di cheratina Estratto Solution <ol><li> Versare soluzione KES equamente in 12 tubi coniche 14 ml separati. Centrifugare le provette a 1.050 g per 10 min. </li><li> Versare il KES centrifugato in un bicchiere pulito, avendo cura di versare via dai detriti raccolti. Ripetere finché tutti i KES è stato centrifugato. </li><li> Riempire un 2.000 ml cilindro graduato con acqua deionizzata. </li><li> Tagliare dialisi membrana tubo cellulosa a 24 pollici, e la clip un&#39;estremità del tubo per tenerlo chiuso. </li><li> Immergere la lunghezza del tubo nel cilindro di acqua deionizzata per rendere più flessibile e più facile da aprire. </li><li> Aprire l&#39;estremità non tagliata della membrana di cellulosa tubo di dialisi e versare lentamente 60 ml di soluzione KES centrifugato nel tubo. Utilizzare un altro clip per chiudere questa estremità del tubo. </li><li> Mettere il ditubo ALISI nel cilindro 2.000 ml di acqua deionizzata e lasciare riposare per 24 h. Cambiare l&#39;acqua deionizzata nel cilindro ogni 3 o 4 ore. </li><li> Dopo il periodo di 24 ore, svuotare la soluzione KES dializzata in vasetti innevate, avendo cura di lasciare spazio nella parte superiore e mettere in freezer a -20 ° C per 24 ore. </li></ol> 5. liofilizzazione di cheratina Estratto Solution <ol><li> Impostare il liofilizzatore a -86 ° C. </li><li> Togliere i vasetti contenenti KES congelato dal congelatore, prendere i tappi fuori dei vasi, e metterli in fiale liofilizzatore. Mettere i sigilli sulle fiale e ruotare la manopola per creare una pressione di vuoto di 0,133 mbar. Lyophilize i campioni per circa 48 ore, fino a quando tutta l&#39;umidità è andato. </li></ol> 6. Preparazione di electrospinning Solutions (10% in peso cheratina Solution) <ol><li> Rimuovere la polvere cheratina dalla liofilizzatore e si pesa. </li><li> Aggiungere acqua deionizzata alla polvere cheratina per creare un 10% peso / pesosoluzione cheratina. </li></ol> 7. Preparazione del 10% in peso PCL Soluzione <ol><li> Ottenere PCL (polimero ε-caprolattone, Mn 70 - 90 kDa), e trifluoroetanolo (TFE). Preparare un 10% in peso PCL in TFE agitando O / N e ottenere una miscela omogenea. </li></ol> 8. Preparazione della soluzione cheratina / PCL <ol><li> Ottenere la soluzione PCL 10% in peso precedentemente preparato e il 10% in peso soluzione cheratina. Aggiungere cheratina nella soluzione goccia PCL saggia per creare 10 ml soluzioni cheratina PCL / di 90:10, 80:20, 70:30 e 60:40 ratios. </li><li> Utilizzare un vortex per ottenere una miscela omogenea di soluzione PCL / cheratina prima electrospinning. </li></ol> 9. Produzione di elettrofilate PCL / fibra cheratina <ol><li> Posizionare circa 8 ml della / soluzione cheratina PCL in una siringa monouso da 10 ml dotato di un tubo di plastica del diametro di 0,5 mm. Posizionare la siringa in una pompa a siringa in cui la portata è impostato per essere di 2,5 ml / hr. </li><li&gt; Applicare tensione alla punta dell&#39;ago collegata al tubo (posizionato ~ 23 cm dalla fibra raccolta tamburo, e ~ 30 gradi rispetto all&#39;orizzontale). Applicare un 19 - tensione kV 22 al tubo e ruotare il tamburo collettore a circa 200 rpm. <ol><li> Avvolgere il tamburo collettore con un foglio di alluminio prima di eseguire l&#39;esempio. Assicurarsi che il foglio di alluminio è stabile applicando il nastro con etichette su entrambe le estremità. Nota: Le fibre formeranno sul foglio di alluminio (vedere Figura 2), memorizzare il foglio rivestito fibra alla RT. </li></ol></li></ol> 10. Analisi meccanica di PCL / cheratina Nanofibre <ol><li> Tagliare il campione in 60 millimetri da 8 mm. Assicurarsi di registrare lo spessore utilizzando micrometrica digitale. Per ogni composizione preparato, utilizzare cinque campioni. </li><li> Fissare il campione di 60 x 8 mm nel tester di trazione. Usare un supporto esemplare personalizzato progettato per attaccare il campione. Sandwich il campione tra i titolari dei campioni che è fatto da una scheda con doppionastro biadesivo. Applicare la cella 10 N carico con una velocità di spostamento di 10 mm / min. Nota: Il titolare campione è stato progettato per di 62 mm per 40 mm con una finestra interna di 50 mm per 38 mm. </li><li> Record estensione e valori di carico attraverso il software in base al protocollo del software. </li><li> Calcolare lo stress dividendo la forza per area del campione testato. Successivamente, calcolare ceppo dividendo la variazione di lunghezza per lunghezza iniziale. </li><li> Generare la curva sforzo-deformazione riportando lo stress in asse y per il valore corrispondente ceppo in asse x. </li><li> Calcolare il modulo di Young della regione lineare dove pendenza pari al modulo di elasticità. Determinare resistenza alla trazione dalla trama ceppo di stress prendendo offset ceppo 0,2% e tracciando una linea parallela alla curva regione lineare. </li><li> Eseguire l&#39;analisi statistica dei dati meccanici ottenuti in triplice copia in precedenza utilizzando analisi della varianza ad una via utilizzando il software di analisi 8. Valori di p &lt;0.05 siamori considerato statisticamente significativo. </li></ol> 11. Superficie Morfologia e strutturale Caratterizzazione <ol><li> Utilizzare microscopio elettronico a scansione (SEM) con i parametri di tensione di accelerazione di 15 kV e la corrente di 5 μA per osservare la morfologia delle fibre elettrofilate. <ol><li> Prima di imaging con SEM, tagliare una sezione 2 di 2 cm di fibra e collegarlo a una fase di SEM utilizzando nastro di rame. Posizionare il palco all&#39;interno del dispositivo a induzione polverizzazione e il cappotto con l&#39;oro a 15 mA per 1 min e 30 sec per creare uno strato d&#39;oro di circa 11 nm di spessore. Caricare il campione nella camera del SEM. Osservare i campioni di fibre. </li></ol></li><li> Utilizzare trasformata di Fourier spettroscopia infrarossa (FTIR) caratterizzare il legame chimico tra il PCL e cheratina. Posizionare la sezione 2 cm 2 della membrana elettrofilate nanofibre in un supporto magnetico e spurgare il sistema con aria secca prima del test. Ottenere spettri per 200 scansioni e analizzare gli spettri utilizzando STAsoftware ndard secondo il protocollo del software. </li><li> Eseguire l&#39;analisi dello spettro usando software standard e utilizzare triplicati di ogni rapporto di nanofibre secondo il protocollo del produttore. </li></ol> 12. Studio di interazione Cell-fibra <ol><li> Tagliare le fibre in 16 mm 2 campioni. Utilizzare un collante biocompatibile a base di silicone per fissare ogni campione di vetrini con un diametro di 12 mm. </li><li> Colla un&#39;estremità del campione fibra al retro del vetrino, avvolgere il campione intorno coprioggetti, poi incollare l&#39;estremità libera del campione al retro del vetrino e, lasciando all&#39;inizio della slittamento coperto con il solo campione di fibra. </li><li> Mettere i campioni di fibre in una piastra da 24 pozzetti. Sterilizzare i campioni immergendo in 80% etanolo per 1 ora. </li><li> Risciacquare l&#39;etanolo dai campioni utilizzando acqua deionizzata. Poi, pipetta 2 ml di terreno di base sui campioni, facendo attenzione a coprire l&#39;intero campione. Rimuovere il supporto dopo 5 min. </li><li> Uso dei fibroblasti 3cellule T3 per seminare i campioni di fibre. Sospendere le cellule in terreno Dulbecco modificato Eagle (DMEM) supplementato con antibiotici e siero fetale bovino 10% (FBS) in modo che ci sono circa 62.000 cellule / cm 2 per 1 ml di DMEM. </li><li> Goccia 1 ml della soluzione di cellule contenente 3T3 DMEM in ciascun piatto ben garantire che ogni campione fibra è coperto con circa 62.000 cellule / cm 2. Incubare le oltre piastre per 24 ore a 37 ° C e 5% CO 2. Nota: Uso 5% CO 2 perché questo livello può di solito mantenere il pH del supporto cella range fisiologico per giorni. </li></ol> 13. La degradazione di nanofibre Matrix <ol><li> Cut asciugato PCL / membrane nanofibre di cheratina in piazza di 30 mm x 30 mm. </li><li> Sterilizzare i campioni di 900 mm 2 con 80% di alcol per un periodo di incubazione di 10 minuti e lavare accuratamente con acqua deionizzata. Incubare i campioni in 15 ml di PBS, pH 7,5, a 37 ° C. Sostituire il buffer ogni 3 giorni. </li><li> Prendere le membrane dalla soluzione a intervalli specifici, 1 settimana e 7 settimane, e risciacquare con acqua deionizzata. </li><li> Posizionare i campioni di membrana in fiale liofilizzatore. Mettere i sigilli sulle fiale e ruotare la manopola per creare un vuoto. Liofilizzato per 24 ore, fino a completa asciugatura. </li><li> Fissare il campione essiccato ad una fase di SEM utilizzando nastro di rame. Posizionare il palco all&#39;interno del dispositivo a induzione polverizzazione e il cappotto con l&#39;oro a 15 mA per 1 min e 30 sec. </li><li> Caricare il campione nella camera del SEM. Osservare i campioni di fibre ad una tensione di accelerazione di 1,5 kV e 5 μA di corrente. </li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Estrazione di cheratina da capelli umani è stato raggiunto con successo. L&#39;acido peracetico agito come agente ossidante sui capelli umani, permettendo la cheratina da estrarre dal Tris Base. La produzione di polvere di cheratina era piccola scala a causa del fatto che è stato fatto soltanto per scopi di ricerca. Questa procedura è già stato stabilito nel settore per la produzione su larga scala. Lo scopo di estrarre la cheratina su piccola scala è stato quello di controllare la contaminazione, la variabilità dei lot...

Electrospinning è riconosciuto come metodo prevalente di realizzare nanofibre polimeriche. Le fibre possono essere prodotte su nanoscala e le fibre sono personalizzabili 1. Questi sviluppi e le caratteristiche di nanofibre elettrofilate sono stati particolarmente interessanti per le loro applicazioni in Ingegneria Biomedica soprattutto in ingegneria dei tessuti. Le nanofibre elettrofilate presenta analogie con la matrice extracellulare e favorire in tal modo l&#39;adesione cellulare, la migrazione e la proliferazione 2. A causa di questa somiglianza alla matrice extracellulare (ECM), fibre elettrofilate possono essere utilizzati come materiali per aiutare nella medicazione, somministrazione di farmaci, e per i tessuti tecnici come fegato, osso, cuore e muscolo 3. Una varietà di diversi polimeri di origine sintetica e naturale sono stati utilizzati per creare fibre elettrofilate per le diverse applicazioni di ingegneria biomedica 4. Recentemente vi è stata in crescita inTERESSE nello sviluppo di nanofibre compositi miscelando sintetiche e polimeri naturali 4. In queste composizioni i prodotti finali tipicamente ereditano la resistenza meccanica associata con il polimero sintetico pur adottando spunti e proprietà biologiche dal polimero naturale. In questo esperimento, PCL e cheratina sono presentati come i polimeri sintetici e naturali da utilizzare per la sintesi di un nanofibre composito. Cheratina è un polimero naturale che si trova nei capelli, lana e unghie. Esso contiene molti residui amminoacidici; Di notevole interesse è la cisteina 4,5. Idealmente un polimero naturale sarebbe biorenewable, biocompatibile e biodegradabile. Cheratina possiede tutte e tre queste caratteristiche ma anche di migliorare la proliferazione cellulare e l&#39;attaccamento ai biomateriali è stato incorporato in 6. Policaprolattone (PCL) è un polimero riassorbibile, sintetica che è significativo iningegneria dei tessuti 4. Questo polimero è stato precedentemente apprezzato per la sua stabilità strutturale e meccanica, tuttavia, manca affinità cellulare e presenta una velocità di degradazione lunga. La natura idrofoba di PCL è probabilmente responsabile per la mancanza di affinità cellule 7. Tuttavia, PCL compensa suoi limiti essendo altamente miscibile con altri polimeri. A PCL / composito cheratina dovrebbe dimostrare le proprietà meccaniche del PCL e incorporare le proprietà biologiche di cheratina, lo rende la scelta ideale per varie applicazioni biomediche.

<table><tbody><tr><td>Capelli umani&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Ottenuto dal barbiere locale di Greensboro</td></tr><tr><td>Acido peracetico</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCL (polimero e-caprolattone)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>502-44-3</td><td>Mn 70-90 kDa</td></tr><tr><td>Trifluoroetanolo (TFE)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>75-89-8</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base (TrizmaTM Base Powder)</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>>99,9% cristallino</td></tr><tr><td>Acido cloridrico</td><td>Fischer Scientific</td><td>A144C-212 Lotto 093601</td><td>Waltham, MA</td></tr><tr><td>Kwik-Sil</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td>Sarasota, FL</td></tr><tr><td>Membrana di cellulosa</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>12 - 14 kDa microscopio ottico a taglio molecolare</td></tr><tr><td></td><td>Olympus BX51M</td><td>BX51M</td><td>Giappone</td></tr><tr><td>microscopio elettronico a scansione</td><td>Hitachi SU8000</td><td>SU8000</td><td></td></tr><tr><td>Macchina Shimadzu da tavolo</td><td>giapponese Nord America Strumenti analitici e di misura Serie AGS-X Serie</td><td>AGS-X&nbsp;</td><td>Columbia, MD</td></tr><tr><td>Spettroscopia infrarossa in trasformata di Fourier</td><td>Bruker Tensor 2 Instrument&nbsp;</td><td></td><td>Billerica, MA</td></tr><tr><td>Microcal Origin software</td><td></td><td></td><td>Northampton, MA</td></tr><tr><td>diffrazione di raggi X (XRD)</td><td>Diffrattometro a raggi X avanzato Bruker AXS D8</td><td>Madison, WI</td>Fibroblast 3T3&nbsp; cell American Tissue Type Culture Collection Manassas, VA Dulbecco's modificato Eagle's medium (DMEM Invitrogen Grand Island,<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> NY</td></tr><tr><td>Spectra max Gemini XPS lettore di micropiastre</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Sunnyvale, CA</td></tr><tr><td>Studente - Newman-Keuls test post hoc</td><td>software</td><td></td><td></td> SigmaPlot 12</tr></tbody></table>

sintesi di nanofibre cheratina-based per ingegneria biomedica

Synthesis of Keratin-based Nanofiber for Biomedical Engineering

Electrospinning, grazie alla sua versatilità e potenziale per le applicazioni in vari campi, viene frequentemente utilizzato per fabbricare nanofibre. La produzione di queste nanofibre porosi è di grande interesse a causa delle loro proprietà fisico-chimiche uniche. Qui abbiamo approfondire la fabbricazione di cheratina contenente poli (ε-caprolattone) (PCL) nanofibre (ad esempio, PCL / cheratina fibre composite). L&#39;acqua cheratina solubile è stato estratto da capelli umani e mescolato con PCL in diversi rapporti. La soluzione mista di PCL / cheratina è stato trasformato in membrane nanofibrous utilizzando un laboratorio progettato elettrospinning istituito. Fibra morfologia e le proprietà meccaniche del nanofibre ottenute sono state osservate e valutate utilizzando la microscopia elettronica a scansione e tester di trazione. Inoltre, degradabilità e chimiche del nanofibre sono stati studiati da FTIR. immagini SEM hanno mostrato morfologia superficiale uniforme per le fibre PCL / cheratina di composizioni diverse. Questi PCL / keratifibre n hanno mostrato eccellenti proprietà meccaniche come modulo di Young e fallimento point. fibroblasti sono stati in grado di collegare e proliferare in tal modo dimostrando buona vitalità cellulare. Sulla base delle caratteristiche di cui sopra, possiamo fortemente sostenere che le nanofibre miscelate di polimeri naturali e sintetici possono rappresentare un eccellente sviluppo di materiali compositi che possono essere utilizzati per diverse applicazioni biomediche.

fibra Morfologia immagini SEM delle fibre sono stati ottenuti per tutte le composizioni di fibre. Vedere Figura 3. Immagine Fiber conferma che le fibre sono orientate in modo casuale. prove meccaniche Meccanicamente fibre forti sono generalmente richiesti per varie applicazioni di ingegneria tissutale. Queste fibre dovrebbero conservare la forza sufficie...

nanofibre elettrofilate hanno una elevata area superficiale al rapporto di peso, eccellente integrità meccanica, e sostenere la crescita e la proliferazione cellulare. Questi nanofibre hanno una vasta gamma di applicazioni biomediche. Qui ci fabbrichiamo cheratina / nanofibre PCL, utilizzando la tecnica electrospinning, e caratterizzare le fibre per le possibili applicazioni in ingegneria dei tessuti.

Sintesi di nanofibre cheratina-based per Ingegneria Biomedica

Electrospinning, due to its versatility and potential for applications in various fields, is being frequently used to fabricate nanofibers. Production of ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è sintetizzare e caratterizzare nanofibre a base di cheratina per applicazioni biomediche. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'ingegneria biomedica, come la guarigione delle ferite, il rilascio di farmaci e i tessuti ingegnerizzati, ad esempio fegato, osso e muscolo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è economica, efficiente e può essere adattata per una produzione su larga scala.Le implicazioni di questa tecnica riguardano il trattamento delle ferite e il rilascio di farmaci per la rigenerazione dei tessuti. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sui vantaggi dell'uso di nanofibre elettrofilate, può essere applicato anche ad altri sistemi, come la rigenerazione tissutale. In generale, le persone alle prime armi con questo metodo incontreranno difficoltà perché è complesso preparare una sostanza polimerica in grado di generare nanofibre.Procacciare circa 20 grammi di ritagli di capelli umani che non siano stati trattati chimicamente o alterati. I capelli possono avere qualsiasi lunghezza. Lavare accuratamente i capelli a mano con acqua calda e sapone.Utilizzare acqua deionizzata per l'ultimo risciacquo. Mettere i capelli in due becher da 600 millilitri e collocarli in un forno a 80 °C per un'ora. Una volta asciutti, dividere i capelli secchi uniformemente tra i becher da 600 millilitri, inserendo 10 grammi di capelli in ciascun becher.Non permettere che i capelli riempiano più di 500 millilitri. Successivamente, versare 500 millilitri di soluzione di acido peracetico, o PAS, in ciascun becher, assicurandosi di ricoprire completamente i capelli. Coprire i becher con Parafilm e conservare per 12 ore.Separare i capelli dal PAS utilizzando un setaccio da 500 micron, raccogliendo il PAS di scarto in un contenitore separato. Sciacquare accuratamente i capelli con acqua deionizzata per rimuovere qualsiasi residuo di PAS. Dopo aver collocato i capelli sciacquati in un matraccio da 500 millilitri, versare nel matraccio 400 millilitri di soluzione di Tris Base 100 millimolare, o TBS, assicurandosi che i capelli siano completamente ricoperti.Successivamente, posizionare il matraccio in un bagno agitato impostato a 38 gradi Celsius e 65 giri al minuto per un'ora. Trascorsa un'ora, rimuovere il matraccio dal bagno agitato. Versare il liquido, pari a circa 400 millilitri di soluzione di estrazione della cheratina (KES), in un becher da 1000 millilitri.Versare 400 millilitri di acqua deionizzata nel flacone contenente i capelli, assicurandosi che i capelli siano completamente ricoperti, quindi rimettere il flacone nel bagno agitatore per un'ora. Rimuovere il flacone dal bagno agitatore e versare i restanti 400 millilitri di KES nel becher da 1000 millilitri contenente il KES raccolto in precedenza. I capelli non sono più necessari e possono essere smaltiti nel cestino più vicino.Dopo aver neutralizzato il KES raccolto come descritto nel protocollo del testo, versare la soluzione nel pallone da 500 millilitri a fondo rotondo fino a riempirlo per circa un quarto. Eseguire il distillatore secondo il protocollo del produttore per 1,25 ore, assicurandosi che il pallone sia collegato saldamente. Ripetere questo processo fino a quando tutto il KES non è stato distillato.Versare la soluzione di KES distillata in parti uguali in 12 tubi conici separati da 14 millilitri. Centrifugare i tubi a 1.050 ×g per 10 minuti. Versare il KES centrifugato in un becher pulito, avendo cura di versare lontano dai detriti raccolti.Ripetere fino a quando tutto il KES è stato centrifugato. Successivamente, tagliare la membrana in cellulosa del tubo da dialisi a 24 pollici e fissare un'estremità del tubo con una molletta per mantenerla chiusa. Aprire l'estremità non fissata del tubo da dialisi in cellulosa e versare lentamente 60 millilitri di soluzione di KES centrifugata all'interno del tubo.Utilizzare un'altra clip per chiudere questa estremità del tubo. Immergere il tubo di dialisi in un cilindro da 2.000 millilitri contenente acqua deionizzata e lasciarlo a riposo per 24 ore, cambiando l'acqua deionizzata nel cilindro ogni tre o quattro ore. Successivamente, versare la soluzione di KES dializzata in barattoli con tappo, avendo cura di lasciare dello spazio in cima.Posizionare i barattoli con tappo in un congelatore a meno 20 gradi Celsius per 24 ore. Trascorso il periodo di congelamento di 24 ore, rimuovere i tappi dai barattoli e posizionarli nei fiale per liofilizzatore. Applicare le chiusure alle fiale e ruotare la manopola per creare una pressione sotto vuoto di 0,133 millibar.Liofilizzare i campioni per circa 48 ore fino a quando tutta l'umidità non sarà evaporata. Preparare una soluzione di cheratina in PCL aggiungendo goccia a goccia una soluzione di cheratina al 10% in peso in una soluzione di PCL al 10% in peso, al fine di ottenere soluzioni da 10 millilitri con rapporti PCL:cheratina di 90:10, 80:20, 70:30 e 60:40. Versare circa otto millilitri della soluzione di PCL/cheratina omogeneizzata in una siringa monouso da 10 millilitri, munita di un tubo di plastica dal diametro di 0,5 millimetri.Posizionare la siringa in una pompa per siringhe in cui la portata è impostata a 2,5 millilitri all'ora. Applicare una tensione alla punta dell'ago collegato al tubo. Applicare una tensione compresa tra 19 e 22 chilovolt al tubo e ruotare il tamburo del collettore a circa 200 giri al minuto.Tagliare le fibre in campioni di 16 millimetri quadrati. Utilizzare una colla biocompatibile a base di silicone per fissare ciascun campione su coprioggetti con un diametro di 12 millimetri. Incollare un'estremità del campione di fibra sul retro del coprioggetto e avvolgere il campione intorno al coprioggetto.Quindi, incollare anche l'estremità libera del campione sul retro del coprioggetto, lasciando la parte superiore del coprioggetto coperta soltanto dal campione di fibra. Posizionare i campioni di fibra in una piastra a 24 pozzetti. Sterilizzare i campioni immergendoli in etanolo al 80% per un'ora.Risciacquare l'etanolo dai campioni utilizzando acqua deionizzata. Quindi, pipettare 2 millilitri di mezzo basale sui campioni, assicurandosi di coprire completamente il campione per cinque minuti. Utilizzare cellule fibroblastiche 3T3 per seminare i campioni di fibra.Sospendere le cellule in DMEM, integrato con antibiotici e 10% di siero fetale bovino, in modo che ci siano circa 62.000 cellule per centimetro quadrato per ogni millilitro di DMEM. Aggiungere un millilitro della soluzione di DMEM contenente le cellule 3T3 in ciascun pozzetto della piastra, assicurandosi che ogni campione di fibra sia ricoperto con circa 62.000 cellule per centimetro quadrato. Incubare le piastre per 24 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.Dopo aver tagliato le membrane di nanofibre secche di PCL/cheratina, sterilizzare i campioni di 900 millimetri quadrati con alcol al 80% per un periodo di incubazione di 10 minuti. Successivamente, lavare accuratamente le membrane con acqua deionizzata. Poi, incubare i campioni in 15 millilitri di PBS, pH 7.5, a 37 gradi Celsius, sostituendo il tampone ogni tre giorni.Prelevare le membrane dalla soluzione a intervalli prestabiliti di una settimana e sette settimane. Risciacquare con acqua deionizzata. Posizionare i campioni di membrana in ampolle per il liofilizzatore.Posizionare i sigilli sulle ampolle e creare un vuoto per liofilizzare i campioni per 24 ore fino a completa essiccazione. Successivamente, fissare il campione essiccato su un portacampioni per microscopio elettronico a scansione, o SEM, utilizzando nastro di rame. Inserire il portacampioni all'interno del sputter coater e rivestire con oro a 15 milliampere per un minuto e trenta secondi.Caricare il campione nella camera del microscopio elettronico a scansione (SEM). Osservare i campioni di fibra a una tensione di accelerazione di 1,5 kilovolt e una corrente di cinque microampere. Di seguito sono mostrate immagini rappresentative di nanofibre a base di PCL/cheratina ottenute con successo mediante elettrofilatura da soluzioni con rapporti PCL/cheratina di 70 a 30, 80 a 20 e 90 a 10.È stato riscontrato che le fibre elettrofilate presentano moduli di Young simili a quelli del tessuto nativo. I moduli di Young diminuiscono all'aumentare del rapporto tra cheratina. Il grafico mostra l'andamento grafico della variazione del modulo di Young in funzione del rapporto PCL/cheratina.Gli spettri di spettroscopia infrarossa a trasformata di Fourier mostrati qui confermano il legame del PCL alla cheratina. Il picco principale, misurato a 1.722 cm⁻¹, è in accordo con le misurazioni di riferimento standard della banda di assorbimento del PCL ed è visibile in tutti gli spettri. L'adesione e la proliferazione cellulare sulle fibre di cheratina di PCL confermano che le fibre non sono tossiche e forniscono un supporto per la crescita cellulare.La crescita dei filopodi lungo le nanofibre indica un'interazione favorevole tra i fibroblasti e le fibre di PCL/cheratina. Una volta padroneggiata, questa tecnica di sintesi delle nanofibre può essere completata in 24 ore se eseguita correttamente. Durante l'esecuzione della procedura di elettrofilatura, è importante tenere presente la viscosità della soluzione polimerica, la velocità di flusso della soluzione, la tensione applicata, la velocità del tamburo rotante e i passaggi per la coltura cellulare dei fibroblasti.Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come sintetizzare nanofibre a base di PCL/cheratina e della loro importanza nel campo dell'ingegneria biomedica. Seguendo questa procedura, altri metodi come il test di vitalità cellulare e la valutazione della degradazione in vivo possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande riguardo la risposta tossicologica nei tessuti, la crescita del tessuto e la degradazione delle fibre. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'ingegneria rigenerativa per esplorare settori come la rigenerazione della pelle, la cicatrizzazione delle ferite e il rilascio di farmaci.Non dimenticare che lavorare con solventi organici, come il TFE, e con alte tensioni può essere estremamente pericoloso, e che durante l'esecuzione di questa procedura è sempre necessario adottare precauzioni come indossare occhiali di sicurezza, camici da laboratorio e guanti, oltre a smaltire correttamente i solventi.

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JoVE Journal

Bioengineering

Bioingegneria

Un approccio efficace per la preparazione di nanofibre decorate con gruppi funzionali in grado di interagire specificamente con proteine ​​è descritto. Il primo approccio richiede la preparazione di un polimero funzionalizzato con gruppo funzionale adeguata. Il polimero funzionale è realizzato in nanofibre da electrospinning. L'efficacia del legame delle nanofibre con una proteina viene studiata tramite microscopia confocale.

Procedimento per la realizzazione di nanofibre Biofunzionali

Ponteggi elettrofilate possono essere trattati post-produzione per applicazioni di ingegneria tissutale. Qui si descrivono i metodi per la filatura ponteggi complessi (da spinning consecutivi), per rendere più spessi (da ponteggi multi-layering che utilizza il calore o vapore ricottura), per ottenere la sterilità (produzione asettica o di post produzione la sterilizzazione) e per il raggiungimento di adeguate proprietà biomeccaniche.

Elaborazione Postproduzione di fibre elettrofilate per l&#39;ingegneria tissutale

Un metodo per ottenere nanofibre e nanostrutture complesse da proteine ​​singole o multiple della matrice extracellulare è descritto. Questo metodo utilizza interazioni proteina-superficie per creare materiali a base di proteine-free-standing con la composizione sintonizzabile e l'architettura per l'uso in una vasta gamma di applicazioni di ingegneria tissutale e delle biotecnologie.

Nanofibre ECM proteine ​​e Nanostrutture Engineered Uso Assembly-Surface avviato

È stata riportata la sintesi e la fabbricazione di fibre lunghe elettrofilate coprono un'area più grande deposito tramite un collettore di nuova concezione da un polimero biodegradabile romanzo chiamato poli (glicerolo-dodecanoato) (PGD). Le fibre sono in grado di sostenere la crescita di cellule derivate da cellule staminali pluripotenti di topo.

Elettrofilate Fibrosa Ponteggi di Poli (glicerolo-dodecanedioate) per l&#39;ingegneria neurale tessuti da cellule staminali embrionali di topo

Qui, vi presentiamo un protocollo per fabbricare scaffold elettrofilate nanofibre con organizzazione sfumati di fibre e di esplorare le loro applicazioni nella regolazione della morfologia delle cellule / orientamento. Gradienti per quanto riguarda le proprietà fisiche e chimiche dei ponteggi nanofibre offrono un'ampia varietà di applicazioni in campo biomedico.

Elettrofilate nanofibre Ponteggi con gradazioni Organizzazione Fiber

I materiali polimerici superidrofobici bidimensionali e tridimensionali sono preparati mediante elettrofilatura o elettrospruzzatura di polimeri biodegradabili miscelati con un polimero a bassa energia superficiale di composizione simile.

Realizzazione superidrofobiche Materiali Polimerici per applicazioni biomediche

Questo manoscritto descrive la procedura per fabbricare e caratterizzare fibre elettrofilate per volta Griffithsin poli (acido lattico-co-glicolico) che illustrano le attività di adesivo ed antivirale potente contro l'infezione di tipo 1 del virus dell'immunodeficienza umana in vitro. Metodi utilizzati per sintetizzare, superficie-modificare e caratterizzare la morfologia risultante, coniugazione, e desorbimento di Griffithsin dalle fibre modificate in superficie sono descritti.

Fabbricazione e caratterizzazione di fibra Griffithsin-modificato ponteggi per la prevenzione delle infezioni sessualmente trasmesse

L'obiettivo di questo protocollo è mostrare l'assemblaggio di una nanomatrice biomimetica (NM) con nanotubi di base Janus (JBNT) e fibronectina (FN). Quando sono co-coltivate con cellule staminali mesenchimali umane (hSPC), le TM mostrano un'eccellente bioattività nell'incoraggiare l'adesione degli HMSC.

Fabbricazione di una nanoma matrice biomimetica con nanotubi di base Janus e fibronectina per l'adesione delle cellule staminali

Gli inserti per colture tissutali con membrane in plastica sono lo standard d'oro nei laboratori di coltura cellulare come supporti permeabili per stabilire strati cellulari e modelli di tessuti barriera. Qui, presentiamo un metodo semplice per sostituire la membrana di plastica con una membrana biologicamente più rilevante costituita da una proteina di seta di ragno funzionalizzata ricombinante.

Mimic della membrana basale nanofibrillare in seta di ragno funzionalizzata ricombinante in inserti di coltura tissutale su misura

Il seguente protocollo presenta un metodo di estrusione basato sul taglio per la fabbricazione di idrogel di collagene con fibrille modellate su scala nanometrica, che può essere applicato a un'ampia gamma di applicazioni di ingegneria tissutale.

Produzione di collagene nanofibrillare per l'ingegneria tissutale

Scopri la sintesi di nanofibre a base di cheratina per applicazioni biomedicali mediante elettrofilatura. Questo metodo economico ed efficiente supporta la crescita cellulare e offre potenzialità in ingegneria tissutale, rigenerazione cutanea e rilascio controllato di farmaci.

Sintesi di nanofibre cheratina-based per Ingegneria Biomedica

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