Sintesi di nanofibre cheratina-based per Ingegneria Biomedica

L'obiettivo generale di questo esperimento è sintetizzare e caratterizzare nanofibre a base di cheratina per applicazioni biomediche. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'ingegneria biomedica, come la guarigione delle ferite, la somministrazione di farmaci e i tessuti ingegnerizzati, come fegato, ossa e muscoli. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è economica, efficiente e può essere aggiornata alla produzione su larga scala.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono al trattamento delle ferite e alla somministrazione di farmaci per la rigenerazione dei tessuti. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sui vantaggi dell'utilizzo di nanofibre elettrofilate, può essere applicato anche ad altri sistemi, come la rigenerazione dei tessuti. In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché è difficile realizzare una sostanza polimerica in grado di generare nanofibre.

Procurati circa 20 grammi di ritagli di capelli umani che non sono stati trattati chimicamente o alterati. I capelli possono essere di qualsiasi lunghezza. Lavare accuratamente i capelli a mano con acqua tiepida e sapone.

Utilizzare acqua deionizzata per il risciacquo finale. Mettere i capelli in due bicchieri da 600 millilitri e metterli in forno a 80 gradi Celsius per un'ora. Una volta asciutti, dividere i capelli asciutti in modo uniforme tra i becher da 600 millilitri, inserendo 10 grammi di capelli in ogni becher.

Non lasciare che i capelli riempiano più di 500 millilitri. Quindi, versare 500 millilitri di soluzione di acido peracetico, o PAS, in ogni bicchiere, assicurandosi di coprire tutti i capelli. Coprire i bicchieri con Parafilm e conservare per 12 ore.

Separare i peli dal PAS utilizzando un setaccio da 500 micron, raccogliendo i rifiuti di PAS in un contenitore separato. Sciacquare accuratamente i capelli con acqua deionizzata per rimuovere eventuali residui di PAS. Dopo aver messo i capelli risciacquati in un pallone da 500 millilitri, versare 400 millilitri di soluzione Tris Base 100 millimolare, o TBS, nel pallone, assicurandosi che i capelli siano coperti.

Quindi, immergere il pallone in un bagno di agitazione impostato a 38 gradi Celsius, 65 giri/min, per un'ora. Dopo un'ora, togliere il pallone dal bagno di agitazione. Versare il liquido, che è costituito da circa 400 millilitri di soluzione di estrazione della cheratina, o KES, in un becher da 1000 millilitri.

Versare 400 millilitri di acqua deionizzata nel pallone contenente i capelli, assicurandosi che i capelli siano coperti prima di rimettere il pallone nel bagno di agitazione per un'ora. Togliere il pallone dal bagno di agitazione e versare i restanti 400 millilitri di KES nel becher da 1000 millilitri con il KES precedentemente raccolto. I capelli non sono più necessari e possono essere gettati nel contenitore della spazzatura più vicino.

Dopo aver neutralizzato il KES raccolto come descritto nel protocollo di testo, versare la soluzione nel pallone a fondo tondo da 500 millilitri fino a riempirlo per circa un quarto. Far funzionare il distillatore secondo il protocollo del produttore per 1,25 ore, assicurandosi che il pallone sia collegato saldamente. Ripetere questo processo fino a quando tutto il KES non è stato distillato.

Versare la soluzione distillata di KES in modo uniforme in 12 tubi conici separati da 14 millilitri. Centrifugare le provette a 1,050 volte G per 10 minuti. Versare il KES centrifugato in un becher pulito, assicurandosi di versare lontano dai detriti raccolti.

Ripetere fino a quando tutto il KES è stato centrifugato. Quindi, tagliare la membrana di cellulosa del tubo per dialisi a 24 pollici e agganciare un'estremità del tubo per tenerla chiusa. Aprire l'estremità non tagliata della membrana di cellulosa del tubo per dialisi e versare lentamente 60 millilitri di soluzione di KES centrifugata nel tubo.

Utilizzare un'altra clip per chiudere questa estremità del tubo. Metti la provetta per dialisi in un cilindro da 2.000 millilitri di acqua deionizzata e lasciala riposare per 24 ore, cambiando l'acqua deionizzata nel cilindro ogni tre o quattro ore. Quindi, svuotare la soluzione KES dialitizzata in barattoli tappati, assicurandosi di lasciare spazio nella parte superiore.

Metti i barattoli tappati in un congelatore a meno 20 gradi Celsius per 24 ore. Dopo il periodo di congelamento di 24 ore, togliere i tappi dai barattoli e metterli nelle fiale del liofilizzatore. Posizionare i sigilli sulle fiale e ruotare la manopola per creare una pressione del vuoto di 0,133 millibar.

Liofilizzare i campioni per circa 48 ore fino a quando tutta l'umidità non è sparita. Preparare una soluzione di cheratina PCL aggiungendo una soluzione di cheratina da 10 pesi in una soluzione PCL da 10 pesi goccia a goccia per creare soluzioni da 10 millilitri con rapporti PCL/cheratina da 90 a 10, da 80 a 20, da 70 a 30 e da 60 a 40. Mettere circa otto millilitri della soluzione vortex di PCL/cheratina in una siringa monouso da 10 millilitri, dotata di un tubo di plastica di 0,5 millimetri di diametro.

Posizionare la siringa in una pompa a siringa dove la portata è impostata su 2,5 millilitri all'ora. Applicare tensione alla punta dell'ago collegato al tubo. Applicare una tensione da 19 a 22 kilovolt al tubo e ruotare il tamburo del collettore a circa 200 giri/min.

Tagliare le fibre in campioni di 16 millimetri quadrati. Utilizzare una colla biocompatibile a base di silicone per fissare ogni campione per coprire i vetrini con un diametro di 12 millimetri. Incollare un'estremità del campione di fibra sul retro del vetrino coprioggetti e avvolgere il campione attorno al vetrino coprioggetti.

Quindi, incolla anche l'estremità libera del campione sul retro del vetrino coprioggetti, lasciando la parte superiore del vetrino coperta solo con il campione di fibra. Posizionare i campioni di fibre in una piastra a 24 pozzetti. Sterilizzare i campioni immergendoli in etanolo all'80% per un'ora.

Sciacquare l'etanolo dai campioni utilizzando acqua deionizzata. Quindi, pipettare 2 millilitri di terreno basale sui campioni, assicurandosi di coprire l'intero campione per cinque minuti. Utilizzare le cellule di fibroblasti 3T3 per seminare i campioni di fibre.

Sospendi le cellule in DMEM, integrato con antiobiotici e siero fetale bovino al 10% in modo che ci siano circa 62.000 cellule per centimetro quadrato per un millilitro di DMEM. Far cadere un millilitro della cella 3T3 contenente la soluzione DMEM in ciascuna piastra a pozzetti, assicurandosi che ogni campione di fibra sia coperto con circa 62.000 cellule per centimetro quadrato. Incubare le piastre a pozzetti per 24 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.

Dopo aver tagliato le membrane in nanofibra di PCL/cheratina essiccate, sterilizzare i campioni di 900 millimetri quadrati con alcol all'80% per un periodo di incubazione di 10 minuti. Quindi, lavare accuratamente le membrane con acqua deionizzata. Successivamente, incubare i campioni in 15 millilitri di PBS, pH 7,5, a 37 gradi Celsius, sostituendo il tampone ogni tre giorni.

Estrarre le membrane dalla soluzione a intervalli specificati di una settimana e sette settimane. Risciacquare con acqua deionizzata. Posizionare i campioni di membrana nelle fiale del liofilizzatore.

Posizionare i sigilli sulle fiale e creare un vuoto per liopolizzare i campioni per 24 ore fino a completa asciugatura. Quindi, collegare il campione essiccato a un microscopio elettronico a scansione, o SEM, utilizzando un nastro di rame. Posizionare il tavolino all'interno del rivestimento sputter e ricoprire con oro a 15 milliampere per un minuto e 30 secondi.

Caricare il campione nella camera del SEM. Osservare i campioni di fibra a una tensione di accelerazione di 1,5 kilovolt e cinque microampere di corrente. Qui sono mostrate immagini rappresentative di nanofibre a base di PCL/cheratina elettrofilate con successo da soluzioni con rapporti PCL/chertaina da 70 a 30, da 80 a 20 e da 90 a 10.

Si è scoperto che le fibre elettrofilate hanno moduli di Young vicini a quelli del tessuto nativo. I moduli di Young diminuivano con l'aumento del rapporto di cheratina. La figura mostra un andamento grafico della variazione del modulo di Young rispetto al rapporto PCL/cheratina.

Gli spettri della spettroscopia infrarossa in trasformata di Fourier qui visualizzati confermano il legame del PCL con la cheratina. Il picco maggiore, misurato a 1.722 centimetri inversi, concorda con le misure di base standard della banda di assorbimento del LCP ed è visibile in tutti gli spettri. L'adesione e la proliferazione cellulare sulle fibre di cheratina PCL confermano che le fibre non sono tossiche e forniscono supporto per la crescita cellulare.

La crescita dei filopodi lungo le nanofibre indica un'interazione favorevole tra i fibroblasti e le fibre PCL/cheratina. Una volta padroneggiata, questa tecnica di sintesi delle nanofibre può essere eseguita in 24 ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di elettrofilatura, è importante ricordare la viscosità della soluzione polimerica, la velocità di flusso della soluzione, la tensione applicata, la velocità del tamburo rotante e le fasi per la coltura cellulare dei fibroblasti.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come sintetizzare in nanofibre a base di PCL/kertain-based e della sua importanza nel campo dell'ingegneria biomedica. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la vitalità cellulare e i test di degradazione in vivo per rispondere a ulteriori domande sulla risposta di tossicità ai tessuti, sulla crescita dei tessuti e sulla degradazione delle fibre. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'ingegneria rigenerativa per esplorare campi come la rigenerazione della pelle, la guarigione delle ferite e la somministrazione di farmaci.

Non dimenticare che lavorare con solventi organici, come il TFE, e alte tensioni può essere estremamente pericoloso e precauzioni come indossare occhiali di sicurezza, camici da laboratorio e guanti e il corretto smaltimento dei solventi devono essere sempre prese durante l'esecuzione di questa procedura.