Generazione e Cultura Sangue escrescenza endoteliali cellule da sangue periferico umano

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di generare in modo affidabile cellule endoteliali di crescita del sangue dal sangue periferico umano. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia vascolare, come ad esempio il modo in cui la disfunzione delle cellule endoteliali contribuisce alle malattie cardiovascolari, tra cui l'ipertensione arteriosa polmonare o la malattia di von Willebrand. Il vantaggio principale di questa tecnica è che genera costantemente una popolazione stabile di cellule endoteliali di crescita del sangue da un piccolo volume di sangue periferico adulto A dimostrare la procedura sarà Christopher Wang, lo studente laureato del mio laboratorio e il professor Nicholas Morrell di laboratorio.

Per iniziare questa procedura. Per ogni donatore, aggiungere tre millilitri di citrato di sodio a ciascuna delle due provette da centrifuga coniche da 50 millilitri. Quindi aggiungere 30 millilitri del sangue raccolto in ciascuna provetta.

Capovolgere delicatamente i tubi due o tre volte per mescolare. Successivamente, diluire 60 millilitri di sangue con DPBS in un rapporto di uno a uno inclinando la provetta contenente il gradiente di densità. Centrifugare il terreno con un angolo di 20 gradi rispetto al piano di lavoro utilizzando un pipetta e una pipetta sierologica da 25 millilitri.

Sovrapporre lentamente 21 millilitri di sangue diluito sopra il terreno. Successivamente, centrifugare i campioni a 400 volte G per 35 minuti a temperatura ambiente con l'acceleratore e la rottura Durante la centrifugazione riparare una soluzione di collagene a 50 microgrammi per millilitro diluendo il brodo. Collagene di tipo uno in 10 millilitri di acido acetico 0,02 molare sterile.

Filtrare la sospensione di collagene prima dell'uso. Quindi, aggiungere 7,5 millilitri di soluzione di collagene a un pallone per colture cellulari T 75. Lasciare rivestire il pallone per un'ora a temperatura ambiente.

Dopo un'ora di rivestimento, aspirare la soluzione di collagene e pipettare 10 millilitri di DPBS nel pallone per lavare via l'acido acetico residuo. Aspirare il DPBS e ripetere il lavaggio ancora una volta. Quindi aggiungere cinque millilitri di terreno di generazione BOEC al pallone per evitare che il rivestimento di collagene si asciughi fino a quando la sospensione cellulare non è pronta per la placcatura.

Dopo la centrifugazione con gradiente di densità, raccogliere con cura lo strato di buffy coat utilizzando una pipetta di trasferimento in plastica sterile ed evitare di trasferire il mezzo di gradiente di densità. La raccolta di buffy coat dovrebbe produrre circa 20 millilitri di sospensione di cel e plasma da ciascuna provetta. Successivamente, diluire la sospensione di cellule mononucleate in DPBS in un rapporto di uno a uno e capovolgere per mescolare, quindi centrifugare a temperatura ambiente per 20 minuti a 300 volte G con il freno e l'acceleratore impostati al massimo dopo la centrifugazione, aspirare il surnatante e risospendere le cellule aggiungendo un millilitro di terreno di generazione BOEC a ciascun pellet e pipettando ripetutamente su e giù, unire tutte le sospensioni cellulari e rabboccare il volume totale a 10 millilitri con il mezzo rimanente.

Per ottenere una stima del numero totale di cellule, diluire 10 microlitri della sospensione cellulare con 490 microlitri di soluzione turca per limare i globuli rossi. Quindi contare un campione da 10 microlitri della sospensione cellulare diluita utilizzando un emocitometro. Successivamente placcare la sospensione cellulare in un singolo pallone T 75 rivestito di collagene.

Rabboccare il volume medio fino a 15 millilitri per pallone e coltura. Le celle a 37 gradi Celsius in un'atmosfera umidificata contenente il 5% di CO2. Ora cambia il mezzo ogni due giorni aggiungendo 15 millilitri di BOEC fresco di generazione, medio alla coltura per i fine settimana, i cambi medi possono essere ritardati a ogni tre giorni.

Monitorare il pallone di coltura BOEC dal settimo al quattordicesimo giorno per la comparsa di colonie in crescita. Identificare le colonie come gruppi circolari di cellule che esibiscono la classica morfologia endoteliale del ciottolo. Una volta identificata una o più colonie nel pallone, continuare con i cambiamenti medi e lasciare che le colonie crescano fino a circa 1000-2000 cellule per colonia.

Prima del confezionamento, determinare il numero di cellule per colonia attraverso una stima visiva approssimativa. Quindi far passare le celle sciacquando due volte i palloni con 10 millilitri di DPBS. Aggiungere cinque millilitri di un tripsin EDTA e incubare in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per cinque minuti.

Dopo cinque minuti, neutralizzare la tripsina con 10 millilitri di terreno contenente FBS e portare le cellule in sospensione con pipettaggio ripetuto. Quindi centrifugare la sospensione a 300 volte G per cinque minuti. Risospendere le cellule in 15 millilitri di BOEC fresco, terreno e placcare l'intera sospensione cellulare in un nuovo pallone T 75 senza rivestimento di collagene. Continuare.

Il mezzo cambia fino a quando le cellule sono confluenti e passano. Le celle come descritto in precedenza per la piastra di imballaggio continua. Non meno di 750.000 cellule per pallone T 75, poiché una bassa densità cellulare può causare l'arresto della proliferazione delle cellule BO.

In questa procedura, la tripsina osserva le cellule e le centrifuga a 300 volte G per cinque minuti. Successivamente, aspirare la trappola e risospendere le cellule in 10 millilitri di terreno. Raccogliere un campione da 10 microlitri della sospensione cellulare ed eseguire una conta cellulare manuale.

Quindi, centrifugare nuovamente il campione e risospenderlo in un mezzo di crioconservazione ghiacciato a due volte 10 per sei cellule per millilitro. Aggiungere 0,5 millilitri di sospensione cellulare a ciascuna fiala e posizionare le fiale in un recipiente di crioconservazione a base di isopropanolo ghiacciato. Quindi posizionare il recipiente in un congelatore a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius per almeno due ore prima di trasferirlo in azoto liquido.

Per scongelare le cellule, aggiungere 10 millilitri di terreno di preriscaldamento a una provetta da centrifuga conica da 15 millilitri. Rimuovere le cellule dall'azoto liquido e scongelarle in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius con una leggera agitazione fino a quando non rimane solo un piccolo cristallo di ghiaccio nella fiala. Quindi aggiungere il contenuto della fiala goccia a goccia alla provetta da centrifuga conica e centrifugare a 300 volte G per cinque minuti.

Successivamente, aspirare il surnatante e sospendere nuovamente il pellet cellulare. Aggiungere la sospensione cellulare al pallone T 75 e rabboccare il terreno a 15 millilitri. In questa immagine, le colonie di outgrowth, che appaiono come raccolte di cellule endoteliali sono disposte in un monostrato di ciottoli e proliferano radialmente da un punto centrale che circonda le colonie di outgrowth, sono le cellule monocitiche aderenti che costituiscono la stragrande maggioranza delle cellule nelle prime colture Dopo l'impacchettamento, i bo Oecs altamente proliferativi prendono il sopravvento sulla coltura poiché le cellule monocitiche non proliferative muoiono o non riescono a riattaccarsi.

Ecco un'immagine rappresentativa in immunofluorescenza di Bo Oecs immunos colorata con un anticorpo contro il marcatore della superficie delle cellule endoteliali CD 1 44. E in questa immagine i B oec erano immunocoloranti con un anticorpo contro il fattore di von Willebrand della glicoproteina nel sangue. Una volta padroneggiata, questa tecnica poteva essere eseguita in meno di due ore se eseguita correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di elaborare i campioni di sangue il prima possibile e preferibilmente entro due ore dalla raccolta. Seguendo questa procedura, le cellule possono essere utilizzate per studiare la funzione delle cellule endoteliali in salute e malattia o riprogrammate in potenti cellule staminali flury indotte per l'uso in studi di differenziazione, modellazione della malattia o terapia cellulare dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ci ha spianato la strada per studiare l'impatto delle mutazioni nel recettore della proteina morfogenetica ossea di tipo due sulla patogenesi dell'ipertensione arteriosa polmonare sia nelle cellule endoteliali di crescita del sangue dei pazienti che nelle cellule muscolari dell'umore derivate dall'IPSC.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare e caratterizzare cellule endoteliali stabili di crescita del sangue da un piccolo volume di sangue periferico. Non dimenticare che lavorare con sangue umano non controllato può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario indossare sempre dispositivi di protezione individuale, inclusi guanti e camice da laboratorio.