Name: Ad alta risoluzione quantificazione del comportamento Odor-guidata Drosophila melanogaster Utilizzo della Flywalk Paradigm (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 31 s
Description: Scopri la quantificazione ad alta risoluzione del comportamento guidato dagli odori in Drosophila melanogaster utilizzando il sistema Flywalk. Questo metodo automatizzato permette di studiare l'olfatto degli insetti con precisione temporale elevata.

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Ringraziamo Daniel Veit per l&#39;assistenza tecnica e Pedro Gouveia a Electricidade Em Pò (electricidadeempo.net) per la personalizzazione del software di monitoraggio per le nostre richieste. Ringraziamo anche Tom Retzke per il supporto durante il processo di ripresa. Questo studio è stato sostenuto dalla Max Planck Society.

La costruzione e dettagli tecnici di Flywalk sono state descritte altrove 26 (in caso di eventuali problemi di stabilire questo set up, ulteriori informazioni possono essere ottenute da MK). Qui ci concentriamo su istruzioni dettagliate sulla gestione del paradigma che aiuterà ad ottenere risultati affidabili. 1. Fly Handling <ol><li> Posteriore vola in basso a culture media densità su supporto alimentare 27 sotto una 12 ore: 12 ore di luce: regime buio a 23-25 ​​° C e 70% di umidità relativa. A tal fine, lasciare 20-30 adulto di recente è emerso vola a riprodurre in una grande fiala cibo per 1 settimana, poi scarta mosche adulte e aspettare che la prole di emergere. </li><li> Raccogliere 30-40 nuovi emersi (età &lt;24 ore) mosche adulte e invecchiare in in nuovo un flaconcino contenente mezzo cibo 27 per 3-5 giorni. </li><li> Ventiquattro ore prima dell&#39;inizio dell&#39;esperimento comportamentale: Trasferire tutto 30-40 precedentemente raccolto 3-5 d vecchio (vedi 2.2) vola a un nuovo VIAl contenente un tappo di gomma di schiuma umida o un fazzolettino di carta umida con un aspiratore. NOTA: non anestetizzare le mosche con CO 2. </li></ol> 2. Preparazione del Setup Flywalk <ol><li> Utilizzare bottiglie da 250 ml come umidificatori. Riempire umidificatori con 100 ml di acqua distillata. </li><li> Preparare fiale odore. <ol><li> Preparare 500 microlitri 10 -3 diluizioni del odori puri acetato di etile, butirrato di etile, acetato e 2,3-isopentil butanedione in olio minerale solvente. </li><li> Collegare due valvole di ritegno a sfera per l&#39;odore fiala. Notare che il check valvole consentono solo per il flusso d&#39;aria unidirezionale. Pertanto, collegare valvole di ritegno in modo tale che l&#39;aria possa entrare nel flaconcino da un lato e lasciarla sull&#39;altro lato. </li><li> Rimuovere il coperchio di un tubo di reazione 200 microlitri PCR. Pipetta 100 ml di ogni diluizione odore in un tubo di reazione separata e posizionare i tubi in flaconi odore separati. Anche preparare un flaconcino contenente solo l&#39;odore oi minerali solventel. </li><li> Strettamente sigillare le fiale odore chiudendo utilizzando tasselli in acciaio inox e guarnizioni in gomma. </li><li> Collegare i 5 flaconcini odore (4 contenente odori e 1 contenenti olio minerale) al sistema di erogazione odore. Assicurati di collegarli in direzione del flusso destra. Un collegamento errato non solo compromettere l&#39;esperimento previsto, ma può anche contaminare il sistema di erogazione. </li></ol></li><li> Controllare eventuali perdite sigillando l&#39;uscita della camera di miscelazione del dispositivo stimolo. Assicurarsi che tutti i flussi d&#39;aria prima che il dispositivo di stimolo ora progressivamente scendono a zero. In caso contrario, controllare le perdite che possono ora essere identificati con il sibilo dell&#39;aria in uscita dal sistema. </li><li> Trasferire accuratamente 15 mosche individuali a 15 tubi in vetro individuo che usa un aspiratore e tubi di vetro chiudere su entrambi i lati con le schede corrispondenti. Nota: Poiché il sistema è chiuso ermeticamente per esperimenti di successo, in modo che le schede si adattano tubi di vetro ermeticamentee notare che tubi di vetro può rompersi durante questa fase. Fare attenzione per evitare lesioni indossando guanti e occhiali protettivi. </li><li> Collegare i tubi di vetro al setup Flywalk e, da qui in poi, attendere almeno 15 minuti prima di iniziare l&#39;esperimento per consentire le mosche abituare al nuovo ambiente. </li><li> Dopo aver collegato i tubi di vetro: controllare le letture dei misuratori di portata a valle digitali sul computer 1 se i 16 flussi d&#39;aria dopo i tubi di vetro si sommano al flusso d&#39;aria che entra nel sistema. Verificate anche sul computer 1, se l&#39;umidità è tra il 60% e l&#39;80%. </li><li> Progettazione protocollo stimolo controllare la sequenza e la tempistica di stimoli odore presentati alle mosche. Per ottenere ad esempio i dati descritti, presenti 4 odori e controllo (olio minerale) e singolarmente tutti i possibili ternari e quaternari miscele degli odori contemporaneamente per 40 volte ciascuno. Impostare la durata dell&#39;impulso di 500 ms ad un intervallo di 90 secondi interstimulus e casuale sequenza di stimolo. </li><li> Accendere il lifonte GHT (-cluster LED; λ = 630). Assicurati di fornire abbastanza luce per il monitoraggio efficiente senza aumentare la temperatura all&#39;interno dei tubi di vetro. </li><li> Impostare una regione di interesse del sistema di tracciamento trascinando una cornice all&#39;interno dell&#39;area da monitorare in modo tale che tutti i tubi di vetro 15 sono inclusi e sono esclusi circa 5 mm dei bordi dei tubi. </li><li> Impostare 14 linee di separazione parallele tra singoli tubi del sistema di tracciamento modificando le loro posizioni Y nello script corrispondente per mantenere individuale vola identificabile tutto l&#39;esperimento. Assicurarsi di posizionarli in modo tale che vi sia sempre un tubo di vetro tra due di tali linee di separazione, perché solo uno volare verrà tracciato tra qualsiasi insieme di due linee. </li><li> Assicurarsi di impostare i parametri della telecamera in modo tale che le mosche sono tracciati affidabile durante i tubi di vetro. Se mosche sono persi ai bordi della regione di interesse, aumentare la luminosità o guadagno del monitoraggio software. Evitare vibrazioni meccaniche del sistema di tracciamento. Traccia utilizzando il software commerciale secondo il protocollo del produttore. </li><li> Inizia esperimento avviando il protocollo stimolo. Record flies&#39; XY-coordinate a 20 fps (fotogrammi al secondo) e accedere in combinazione con lo stato della valvola odore in file di testo. </li></ol> Analisi 3. Dati NOTA: Le seguenti operazioni nell&#39;analisi dei dati sono automatizzate utilizza le routine custom scritti programmati in R. Poiché questi passaggi sono fondamentali per ottenere risultati significativi l&#39;analisi sarà comunque presentata in modo step-by-step. I dati grezzi per l&#39;analisi sono CSV-file contenenti informazioni sincronizzate sullo stato della valvola odore, il numero di impulsi nell&#39;esperimento e 15 fly x posizioni in cm su un asse temporale comune per un odore ciclo di stimolazione. Codice personalizzato per l&#39;analisi dei dati può essere fornita su richiesta. <ol><li> Aperto .csv file, trovare il tempo-punto di apertura della valvola significato da un chaESN nella colonna che rappresenta lo stato della valvola. </li><li> Calcolare la funzione lineare della posizione dell&#39;odore della forma f (t) = s * t + i dove t è il tempo nel ciclo di stimolazione, s è la velocità del vento (qui 20 cm / sec) e l&#39;intercetta i può essere calcolata usando il time-point l&#39;odore entra nelle provette a posizione 0 (apertura della valvola più ritardo). </li><li> Trovare il punto in cui l&#39;odore tempo e volare x-position si intersecano per ogni mosca e impostare questo time-point a 0. Nota: In questo modo le posizioni mosca sono allineate ad ogni individual&#39;s incontro con l&#39;odore. </li><li> Escludi mosche seduti ai bordi molto della regione di interesse. </li><li> Calcolare la velocità da X-posizioni dividendo spostamento lungo l&#39;asse x per l&#39;intervallo di tempo (100 msec) e ripetere la procedura per ogni ciclo di stimolazione. </li><li> Per ottenere temporali corsi velocità come mostrato nella Figura 2E calcolare medio di time-course velocità per ogni mosca e odore e da quelle del time-course medio per un determinato odore. </li><li> Per ottenere lo spostamento netto come mostrato in Figura 3C calcolare lo spostamento netto entro 4 secondi dopo l&#39;impulso odori per ogni evento di inseguimento e successivamente lo spostamento netto medio per volo e odore. </li></ol> 4. Procedura di pulizia <ol><li> Clean Glass Tubes <ol><li> Rimuovere le mosche e gli adattatori da tubi di vetro e godersi tubi di vetro con detergente. </li><li> Sciacquare tubi di vetro con acqua corrente distillata e asciugarle con aria compressa. </li><li> Tubi di vetro termico a 200 ° C per 8 ore. </li></ol></li><li> Pulire Odore Delivery System <ol><li> Rimuovere tutti i flaconi di odori e tubi dalla camera di miscelazione centrale. </li><li> Rimuovere adattatori tubi dalla camera di miscelazione. </li><li> Pulire camera di miscelazione con il risciacquo con soluzione detergente laboratorio e solventi (ad esempio etanolo, acetone). Eseguire queste operazioni sotto il cofano di laboratorio. </li><li> Camera di miscelazione a secco con aria pressurizzata e riscaldarlo a 200 ° C per 8 ore. </li></ol></li><li> Pulire Odore Fiale e Valvole <ol><li> Togliere il tappo in acciaio (guarnizione in gomma di scarto) e valvole di non ritorno di fiale di odori e godersi tutti i componenti nella soluzione detergente laboratorio. </li><li> Componenti Sonicare in un bagno a ultrasuoni e sciacquare con acqua distillata. </li><li> Pulire tutti i componenti ad eccezione di valvole di non ritorno con etanolo e acetone. Eseguire queste operazioni sotto il cofano di laboratorio. </li><li> Componenti asciugare con aria compressa e di riscaldare a 200 ° C per 8 ore. </li><li> Valvole di ritegno pulito dentro di loro lavaggio con etanolo e acetone utilizzando una siringa (ritengono direzione del flusso). Eseguire queste operazioni sotto il cofano laboratorio indossare occhiali di laboratorio. Perché acetone attacca parti in gomma, immediatamente valvole di ritegno a secco da vampate di calore con aria compressa. </li><li> Rimuovere odori residui da pulsare aria attraverso le valvole di ritegno per diversi giorni. Utilizzare un incubatore a 60 ° C ed aria 1 sec acceso / 1 sec aria fuori regime per questa fase di pulizia. </li></ol&gt; </li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Anche se il sistema Flywalk appare piuttosto sofisticato, a prima vista, una volta istituito e funzionante, è facile da usare e produce risultati molto robusti. Per sottolineare la coerenza dei risultati ottenuti con il saggio biologico si può dire che i risultati rappresentativi riportati sono stati ottenuti quasi 2 anni dopo alcuni dei risultati riportati in un precedente studio 29 con una configurazione modificata utilizzando un nuovo software di monitoraggio e la sorgente luminosa. Tuttavia, le risposte s...

L&#39;obiettivo primario di ogni ricerca neuroethological è di stabilire un nesso di causalità tra gli stati di attività dei singoli neuroni o circuiti neuronali e il comportamento di un organismo. Per raggiungere questo obiettivo l&#39;attività neuronale e comportamento devono essere monitorati in condizioni di stimolo identiche e queste condizioni di stimolo dovrebbe idealmente essere simili a quelle del sistema nervoso sotto controllo evoluto per dare un senso. Soprattutto quando si tratta di saggi biologici comportamentali, questi requisiti hanno storicamente dimostrato abbastanza esigente in Drosophila melanogaster neuroetologia olfattiva. Una volta liberato dalla fonte, pennacchi odore rapidamente si disgregano in filamenti sottili con diffusione turbolenta causato dal movimento dell&#39;aria è il principale determinante della distribuzione odori 1. Come risultato, un insetto navigazione verso una fonte di odore sperimenta stimolazione intermittente con pacchetti odore intervallati da intervalli variabili di aria pulita. Entrambe le particamminare e insetti volanti - tra Drosophila - sono stati dimostrati per sfruttare questo regime stimolazione intermittente per la navigazione da aumento di bolina su incontro pennacchio e prevalentemente in movimento vento di traverso, in assenza di odori 2 - 5. Considerando che le procedure di stimolazione negli esperimenti fisiologici ampiamente imitare quelli di un insetto che si verifichi nel suo ambiente naturale dovendo provvedere a singoli sbuffi di odori intervallati da lunghi periodi di aria pulita o sequenze di stimolazione dinamiche 6 - 11, molti test biologici comportamentali utilizzate in Drosophila neuroetologia quali test trappola , arene campo aperto o T-labirinto si affidano a odori-gradienti di 12 - 15. Tuttavia, perché gradienti odore per definizione sono variabili in concentrazione in funzione della distanza dalla sorgente di odore, un particolare comportamento non può essere attribuito ad una concentrazione di odore preciso usando questi paradigmi. Inoltre, la pendenzaun gradiente di odore dipende in modo critico sulle proprietà fisico-chimiche del odorizzante. Un gradiente di un composto altamente volatile sarà meno profonda di quella generata da un composto meno volatile e quindi anche più difficile da monitorare per un organismo basandosi sulla misurazione differenze di concentrazione nello spazio come unico mezzo di navigazione 16 - 20, che può portare ad una errata interpretazione delle preferenze olfattive particolarmente nei saggi di scelta. Questo effetto è anche molto dannoso nell&#39;ambito delle indagini comportamento verso miscele odore perché porta a rapporti dei componenti si fondono diverse in ogni punto dello spazio e quindi di nuovo preclude una chiara correlazione tra fisiologia e del comportamento. Mentre le mosche aceto tendono ad aggregarsi in fermentazione di frutta, che sono solitari nella loro navigazione verso fonti di cibo e siti deposizione delle uova. Tuttavia, invece di test singoli animali molti paradigmi comportamentali utilizzati in Drosophila neuroethology esaminare il comportamento di odore-guidata delle coorti di mosche e di attrazione è segnato come la frazione di mosche che scelgono l&#39;odore su uno stimolo di controllo. Questi esperimenti di coorte hanno contribuito notevolmente alla comprensione della mosca neuroetologia e molte delle osservazioni fatte con il loro impiego potrebbe essere confermato in esperimenti di singolo-fly. Tuttavia, è stato osservato che vola può influenzare ogni decisione other&#39;s 21 e in casi estremi la valutazione di un odore può passare da indifferenza all&#39;annullamento seconda densità di popolazione 22. Inoltre, i risultati di questi tipi di esperimenti spesso forniscono solo il punto finale di una sequenza di decisioni comportamentali piuttosto che osservando ciò al volo sta facendo mentre lo fa, che sarebbe desiderabile quando si tenta di correlare comportamento con attività neuronale. Questi esperimenti di coorte piuttosto bassa risoluzione si contrappongono ad alta risoluzione metodi single-fly, come arene dei voli frenati e tapis roulant che permettonoper l&#39;osservazione diretta delle risposte comportamentali al momento lo stimolo viene presentato 20,23,24. Tuttavia, gli esperimenti di coorte sono ancora popolari, perché sono molto efficienti e di risultati solidi anche a dimensioni comparabile bassa del campione perché la variabilità inter-individuale e inter-trial sono parzialmente in media a causa all&#39;osservazione delle popolazioni per lunghi periodi di tempo prolungati. Mentre volo tethered e tapis roulant probabilmente offrono il gold standard per quanto riguarda la presentazione dello stimolo e risoluzione temporale, arene utilizzati sono progettati per singoli animali ed è quindi in termini di tempo per ottenere le dimensioni necessarie campione per un&#39;analisi statistica. Molti altri approcci sono stati recentemente sviluppato che permettono una efficiente acquisizione di dati comportamentali ad alta risoluzione in combinazione con un regime di stimolo ben definita. Questi includono non supervisionato tracking 3D di più mosche di aceto in una galleria del vento in combinazione con un accurato modello 3D del pennacchio odore di 5 </sup&gt;, il monitoraggio di più mosche singoli nelle camere a scelta in dotazione con correnti d&#39;aria da entrambi i lati 25 e il paradigma Flywalk 26. In Flywalk, 15 mosche individuali si trovano in tubi di vetro di piccole e costantemente monitorate da una telecamera dall&#39;alto in condizioni a luci rosse. Gli odori vengono aggiunti ad un flusso d&#39;aria continuo di 20 cm / sec e viaggiano attraverso i tubi di vetro ad una velocità costante. Il flusso d&#39;aria viene umidificata mediante passaggio 250 ml bottiglie contenenti acqua distillata (umidificatori) prima di entrare nel sistema di erogazione odore. Le posizioni flies&#39; vengono registrati all&#39;interno di una regione quadrata di interesse (ROI) comprendente la maggior parte della lunghezza dei tubi di odore (esclusi i bordi esterni dei tubi (circa 5 mm su ciascun lato) dove le mosche non possono muoversi ulteriormente alto o sottovento) intorno al momento della presentazione dell&#39;odore (Figura 1A, B). Fly identità sono mantenuti costanti dal sistema di tracciamento tel corso l&#39;esperimento sulla base delle loro posizioni Y (vale a dire i loro limiti tubo di vetro). Stimolazione odore si ottiene utilizzando un dispositivo di stimolo multi-componente che permette la presentazione di fino a 8 singoli odori e tutte le possibili miscele 26,29 (Figura 1B). Il corso di un esperimento è controllato da un computer regolando il sistema di erogazione odore e raccolta di temperatura e umidità informazioni (computer 1, Figura 1C). Questo computer controlla anche un datalogger (avvio / arresto della registrazione) su un secondo computer, che registra continuamente posizioni mosca a 20 fotogrammi al secondo (computer 2). Vola posizioni, stato della valvola odore (cioè il tempo-punto di apertura della valvola), ID odore, temperatura e umidità intorno cicli di stimolazione odore è registrato sul computer 2. In questo modo le informazioni su odore e volare posizioni sono sincronizzati ed esportati come file .csv-che possono essere ulteriormente elaborati e analizzati utilizzando routine di analisi-custom scritta. Perchél&#39;intero sistema è controllato da computer, è necessario alcun intervento umano durante una sessione sperimentale.

<table><tbody><tr><td>Installazione Flywalk</td> Dettagli <td>personalizzati</td><td></td><td>disponibili su richiesta</td></tr><tr><td>Dispositivo di stimolo</td> Dettagli <td>personalizzati</td><td></td><td>disponibili su richiesta</td></tr><tr><td>Cluster LED</td> Dettagli <td>personalizzati</td><td></td><td>disponibili su richiesta</td></tr><tr><td>Webcam HD Pro C920</td><td>Logitech, Losanna, Svizzera</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 Computer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flywalk Reloaded v1.0 software</td><td>Electricidade Em P&oacute; (electricidadeempo.net)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software Labview 11.0</td><td>National Instruments, Austin, TX</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cibo per mosche standard</td><td>personalizzato</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiale per mosche standard</td><td>Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen, Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiale per mosche standard</td><td>Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen, Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>aspiratore</td><td>Personalizzato</td><td></td><td></td></tr><tr><td>olio minerale</td><td>Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>odori</td><td>Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 &; micro; l Provette di reazione PCR</td><td>Biozym Scientific GmbH, Oldendorf, Germania</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ad alta risoluzione quantificazione del comportamento odor-guidata<em&gt; drosophila melanogaster</em&gt; utilizzo della<em&gt; flywalk</em&gt; paradigm

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

Nel loro ambiente naturale, insetti come l&#39;aceto mosca Drosophila melanogaster sono bombardati da una quantità enorme di odoranti chimicamente distinti. Per complicare ulteriormente le cose, gli odori rilevati dal sistema nervoso degli insetti non sono solitamente composti singoli ma miscele la cui composizione e rapporti di concentrazione variare. Questo porta ad una quantità quasi infinita di diversi stimoli olfattivi che devono essere valutata dal sistema nervoso. Per capire quali aspetti di uno stimolo odore determinano la sua valutazione da parte del volo, è pertanto auspicabile esaminare in modo efficiente il comportamento odore-guidati verso molte odoranti e miscele odore. Per correlare direttamente comportamento da attività neuronale, comportamento dovrebbe essere quantificato in un lasso di tempo comparabile e in condizioni di stimolo identiche in esperimenti neurofisiologici. Tuttavia, molti test biologici olfattivi attualmente utilizzati in Drosophila neuroetologia sono piuttosto speciazato sia verso l&#39;efficienza e verso la risoluzione. Flywalk, un sistema di erogazione di odore e automatizzato di monitoraggio, colma il divario tra efficienza e risoluzione. Esso permette di determinare esattamente quando un pacchetto odore stimolato una mosca liberamente a piedi, ea quali per animali da reazione dinamica comportamentale.

Poiché mosche possono distribuire liberamente all&#39;interno dei tubi di vetro tra impulsi odore e l&#39;impulso odore viaggia attraverso i tubi di vetro ad una velocità costante mosche incontrano l&#39;odore in tempi diversi a seconda della loro posizione x al momento della stimolazione. Come risultato, le esacerbazioni delle traiettorie controvento evocati da un impulso di 500 msec di un attraente 10 -3 diluizione di acetato di etile sono ritardate di circa 1 sec per mosche alla fine sottovento loro tubi d...

Il Flywalk sistema automatizzato di monitoraggio è utilizzato per ad alta risoluzione quantificazione del comportamento odore guidati in Drosophila melanogaster.

Ad alta risoluzione quantificazione del comportamento Odor-guidata<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Utilizzo della<em&gt; Flywalk</em&gt; Paradigm

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To ...

L'obiettivo generale di questo bioassaggio comportamentale è studiare il comportamento guidato dagli odori nelle mosche dell'aceto. Fly Walk è un sistema ad alto rendimento che traccia e analizza automaticamente le risposte comportamentali di singole mosche multiple a stimoli olfattivi. Questa nuova tecnica può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'olfatto negli insetti.Come si presenta l'equilibrio edonico di un odore, oppure cosa comporta l'aggiunta di ulteriori odoranti a questo equilibrio? Il vantaggio principale di questo esperimento è che possiamo monitorare il comportamento guidato dall'odore con un'elevata risoluzione temporale, utilizzando stimoli odorosi simili a quelli che gli insetti sperimentano in natura o a quelli impiegati anche nelle registrazioni elettrofisiologiche. In generale, chi tenta di utilizzare questo metodo potrebbe incontrare difficoltà, poiché è essenziale disporre di un sistema ermetico: bisogna conoscere con precisione il percorso dell'aria ed essere certi che non vi siano assolutamente perdite attraverso cui l'aria possa fuoriuscire dal sistema. Per questi esperimenti, è importante allevare le mosche in un ciclo luce-buio 12:12 in colture a densità bassa o media contenenti un mezzo nutritivo normale.Mantenere la temperatura ambiente tra 23 e 25 gradi Celsius e l'umidità relativa intorno al 70% in preparazione. Utilizzare provette di coltura grandi per ottenere da 20 a 30 adulti per una settimana e raccogliere gruppi di 30-40 prole di sesso misto per formare un gruppo sperimentale. Quando un gruppo ha un'età compresa tra due e quattro giorni, trasferirlo in una nuova provetta contenente un tappo di spugna umida o un foglio di carta assorbente inumidito.Fare digiunare le mosche in questa provetta per 24 ore prima del test. È fondamentale che le mosche non vengano anestetizzate durante questo trasferimento. Per questa configurazione, bottiglie da 250 millilitri fungono da numerosi umidificatori.Riempire ogni bottiglia con 100 millilitri di acqua distillata. Successivamente, preparare stock di lavoro da mezzo millilitro per ciascun odorante, effettuando un’ulteriore diluizione 1000 volte rispetto agli odori puri in olio minerale. Analogamente, preparare un tubo PCR contenente soltanto olio minerale da utilizzare come controllo negativo.Ora preparare il sistema di somministrazione degli odori per ciascun odorante nell'esperimento. Collegare due valvole di non ritorno a ogni provetta per odore.Assicurarsi di collegare le fiale degli odori nel corretto senso di flusso. Un collegamento errato non solo comprometterebbe l'esperimento pianificato, ma potrebbe anche contaminare il sistema di erogazione. Successivamente, verificare il sistema per eventuali perdite.Prima, sigillare l'uscita della camera di miscelazione. Quindi verificare che tutta la portata d'aria prima del dispositivo di stimolo scenda a zero. Se ci sono perdite nel sistema, ascoltare per individuarle.Di solito possono essere risolti sostituendo le guarnizioni in gomma nei collegamenti cruciali o sostituendo i tubi in teflon. Per il primo passaggio di questa procedura, esiste il rischio di rottura del vetro, quindi indossare l'equipaggiamento di protezione. Trasferire con attenzione 15 moscerini singoli nei singoli tubi di vetro utilizzando un aspiratore, quindi chiudere i tubi di vetro su entrambe le estremità con gli appositi adattatori, che devono aderire perfettamente.Successivamente, collegare i tubi di vetro caricati al dispositivo fly walk. Una volta attaccati tutti i tubi, lasciare che le mosche si abituino al nuovo ambiente per almeno 15 minuti prima di iniziare l'esperimento. Ora accendere la sorgente luminosa.Assicurarsi di fornire una quantità di luce sufficiente per un monitoraggio efficiente senza aumentare la temperatura all'interno dei tubi di vetro. A questo punto, tutte le provette per gli odori devono essere collegate per creare un sistema chiuso. Il periodo di abituazione dipende da un sistema chiuso privo di perdite, in modo che la portata d'aria attraverso i tubi sia alla stessa velocità rispetto ai periodi di prova.Verificare il flusso d'aria del computer, collegandolo ai flussimetri digitali. I flussi d'aria totali in uscita dal sistema devono essere uguali al flusso d'aria in ingresso nel sistema. In caso contrario, è presente una perdita.La perdita influirà sul flusso d'aria in tutti i tubi, ma il tubo problematico di solito è quello che mostra la maggiore riduzione del flusso d'aria. Se viene identificata una nuova perdita, di solito è causata da un tubo di vetro rotto all'interno dell'adattatore, oppure da frammenti di vetro negli adattatori provenienti da esperimenti precedenti. Durante questo processo, assicurarsi che l'umidità dell'aria in uscita dal sistema sia compresa tra il 60 e l'80%. Dopo che le mosche si sono ambientate nei loro tubi, è possibile avviare l'esperimento.In linea di principio, qualsiasi sequenza di odori può essere presentata finora. I migliori risultati si ottengono randomizzando gli stimoli e separandoli di almeno 90 secondi. In totale.Somministrare ogni odore 40 volte mediante impulsi di 500 millisecondi. Successivamente, impostare una regione di interesse trascinando un riquadro sull'area da monitorare. Includere tutti e 15 i tubi di vetro nel riquadro, escludendo però i cinque millimetri esterni delle estremità dei tubi.Il passo successivo consiste nel disattivare il software di tracciamento ed effettuare delle modifiche allo script. Questo modificherà la posizione sull'asse Y delle 14 linee parallele che separano le singole provette. Quando il software di tracciamento verrà riattivato, tra due linee dovrebbe essere presente un solo moscerino.Successivamente, assicurarsi che i parametri della telecamera siano impostati in modo che le mosche vengano tracciate in modo affidabile lungo tutta la lunghezza dei tubi di vetro. Se le mosche vengono perse ai margini della regione di interesse, aumentare la luminosità o il guadagno del software di tracciamento. Ora che il sistema è completamente preparato, avviare il protocollo di stimolo.Registrare le posizioni delle mosche a una frequenza di 20 fotogrammi al secondo e registrare queste coordinate insieme allo stato della valvola dell'odore in file di testo. Poiché l'esperimento è molto sensibile agli odori, è necessaria una pulizia regolare per pulire i tubi di vetro, immergerli in detergente e quindi risciacquarli con acqua distillata corrente. Dopo il risciacquo, asciugare i tubi con aria sotto pressione e quindi riscaldarli a 200 gradi Celsius per otto ore.Per pulire per prima cosa il sistema di somministrazione degli odori, rimuovere tutte le provette degli odori e i tubi dalla camera centrale di miscelazione. Successivamente, rimuovere gli adattatori dei tubi dalla camera di miscelazione. Pulire la camera vuota sciacquandola con un solvente sotto cappa, come si fa per i tubi.Asciugare la camera di miscelazione utilizzando aria pressurizzata e riscaldarla a 200 gradi Celsius per otto ore. Per pulire le provette degli odori e le valvole, rimuovere i tappi in acciaio, scartare le guarnizioni di gomma ed estrarre le valvole di non ritorno, le valvole di non ritorno per sapone, l'etanolo e gli altri componenti sia dall'etanolo che dall'acetone. Successivamente, sottoporre i componenti in ammollo a ultrasuoni per 30 minuti alla massima potenza e risciacquarli con acqua distillata.Come in precedenza, utilizzare aria compressa per l'essiccazione e riscaldare i componenti a 200 gradi Celsius per otto ore. Lavare i componenti con etanolo quando l'acetone è nel senso del flusso d'aria, poiché l'acetone attacca le parti in gomma; asciugare immediatamente ogni valvola di non ritorno lavata con aria compressa per rimuovere tutti gli odori residui dalle valvole sottoposte a lavaggio. Far passare aria pulsata attraverso di essi per diversi giorni, posizionandoli in un incubatore a 60 gradi Celsius con flusso d'aria che si attiva e disattiva a intervalli di un secondo.15 femmine di moscerini privati di cibo sono stati esposti a butirrato di etile. La barra gialla rappresenta l'impulso di odore. I quadrati blu indicano il movimento controvento entro un intervallo di 100 millisecondi.I quadrati rossi rappresentano in modo corrispondente il movimento sottovento. Le stesse mosche hanno mostrato anche movimenti controvento in risposta alla stimolazione con acetato di isopentile, acetato di etile o due butano d, mediati sulla popolazione. La risposta della mosca all'acetato di etile ha presentato un inizio netto, un'alta ampiezza e una breve durata.Al contrario, la risposta al due tre butano Dion presentava un'inizio medio più tardivo, un'ampiezza inferiore e una durata maggiore. In definitiva, i dati provenienti da ciascun odorante sono stati risolti in questo modo e successivamente analizzati per mostrare che tutti e quattro gli odoranti provocavano uno spostamento verso monte superiore entro quattro secondi rispetto al solvente. Inoltre, aprendo in sincronia le provette degli odoranti, le mosche sono state esposte a tutte le possibili miscele.Dopo aver stimolato le mosche con i quattro singoli odori, le stimolazioni con miscele dei quattro odori sono risultate almeno altrettanto attraenti del composto singolo più attraente presente nella miscela. Una volta acquisita padronanza, è possibile eseguire questo esperimento entro un'ora, dopodiché l'esperimento prosegue per otto ore e già dopo soli 30 minuti è possibile visualizzare i primi risultati. Questo metodo consente quindi di ottenere dati da numerose mosche in breve tempo e con un'elevata risoluzione temporale.Ma fate attenzione. Questo esperimento richiede una pulizia approfondita tra un esperimento e l'altro. Se il vostro sistema è ancora contaminato dalle formiche dell'esperimento precedente, dovrete rinunciare ai vostri risultati nel fly walk.È naturalmente possibile testare anche moscerini geneticamente modificati, permettendo di indagare l'impatto di singoli circuiti neurali o di circuiti specifici sul comportamento guidato dagli OD. Dopo lo sviluppo di questa nuova tecnica, si è aperta la strada alla ricerca in questo settore, la fisiologia degli insetti, per comprendere la codifica di questi odori nel cervello dell'insetto. E cosa importante, utilizzare lo stesso tipo di stimolazione sia per esperimenti comportamentali nella camminata del moscerino che per esperimenti fisiologici significa che possiamo effettivamente confrontare questi due diversi paradigmi sperimentali.Dopo aver visto questo video, dovresti avere un'idea chiara su come impostare la prova di cammino della mosca, e dovresti essere in grado di allestire questo esperimento nel tuo laboratorio e avviare presto i tuoi esperimenti ad alto rendimento sul comportamento degli insetti. Ma non dimenticare che lavorare con vetreria e sostanze chimiche può essere estremamente pericoloso, quindi indossa sempre un camice da laboratorio. Usa occhiali protettivi e guanti.

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