Ad alta risoluzione quantificazione del comportamento Odor-guidata Drosophila melanogaster Utilizzo della Flywalk Paradigm

L'obiettivo generale di questo biotest comportamentale è quello di studiare il comportamento guidato dagli odori nei moscerini dell'aceto. Fly Walk è un sistema ad alto rendimento che traccia e analizza automaticamente le risposte comportamentali di più singoli moscerini agli stimoli olfattivi. Questa nuova tecnica può aiutare a rispondere a domande chiave nell'area dell'olfatto degli insetti.

Ad esempio, qual è l'equilibrio edonistico di un odore, o cosa significa l'aggiunta di odori aggiuntivi a questo equilibrio? Il vantaggio principale di questo esperimento è che possiamo guidare gli odori in alta risoluzione temporanea e utilizziamo stimoli odorosi simili a quelli che gli insetti sperimentano in natura o a quelli che usiamo anche nelle registrazioni elettrofisiologiche. In generale, le persone che cercano di utilizzare questo metodo potrebbero avere difficoltà perché in realtà ha bisogno di un sistema ermetico, quindi è necessario sapere dove passa l'aria e bisogna essere sicuri che non ci siano perdite nel punto in cui l'aria può lasciare il sistema I Per questi esperimenti, è importante allevare le mosche sotto un ciclo di buio chiaro da 12 a 12 in colture da basse a medie contenenti un normale mezzo alimentare.

Mantieni la temperatura ambiente tra i 23 e i 25 gradi Celsius e l'umidità relativa dovrebbe essere intorno al 70% durante la preparazione. L'uso di grandi fiale di coltura ha reso da 20 a 30 adulti per una settimana e ha raccolto gruppi di 30-40 figli di sesso misto per creare una coorte sperimentale. Quando una coorte ha da due a quattro giorni, trasferiscila in una nuova fiala contenente un tappo di schiuma umida o una carta velina umida.

Lascia che le mosche muoiano di fame in questa fiala per 24 ore prima del test. È fondamentale che le mosche non vengano anestetizzate durante questo trasferimento. Per questa configurazione, le bottiglie da 250 millilitri servono come tanti umidificatori.

Riempi ogni bottiglia con 100 millilitri di acqua distillata. Quindi, preparare scorte di lavoro da mezzo millilitro di ciascun odorante come una diluizione di 1000 degli odori puri e dell'olio minerale. Allo stesso modo, prepara una provetta PCR con solo olio minerale per fungere da controllo negativo.

Ora prepara il sistema di erogazione degli odori per ogni odore. Nell'esperimento. Collegare due valvole di ritegno a sfera a ciascuna fiala di odore.

Assicurati di collegare le fiale degli odori nella giusta direzione del flusso. Una connessione errata non solo comprometterà l'esperimento pianificato, ma potrebbe anche contaminare il sistema di consegna. Quindi, controllare che il sistema non presenti perdite.

Innanzitutto, sigillare l'uscita della camera di miscelazione. Quindi controlla che tutto il flusso d'aria prima del dispositivo di stimolo scenda a zero. Se ci sono perdite nel sistema, ascoltarle.

Di solito possono essere risolti sostituendo le guarnizioni in gomma in corrispondenza delle connessioni cruciali o sostituendo i tubi in teflon. Per il primo passo di questa procedura, la rottura del vetro è un problema, quindi indossa un equipaggiamento protettivo. Trasferire con cautela 15 singole mosche di prova nelle singole provette di vetro Utilizzando un aspiratore, chiudere le provette di vetro su entrambi i lati utilizzando gli adattatori corrispondenti, devono adattarsi molto saldamente.

Quindi, collegare i tubi di vetro caricati alla configurazione della camminata di volo. Una volta che tutti i tubi sono collegati, lascia che i moscerini si abituino al nuovo ambiente per almeno 15 minuti prima di iniziare l'esperimento. Ora accendi la fonte di luce.

Assicurati di fornire luce sufficiente per un tracciamento efficiente senza aumentare la temperatura all'interno dei tubi di vetro. Le fiale di odori devono essere tutte collegate a questo punto per creare un sistema chiuso. Il periodo di assuefazione si basa su un sistema chiuso senza perdite, quindi il flusso d'aria attraverso i tubi è alla stessa velocità dei periodi di prova.

Controllare il flusso d'aria sul computer, collegarlo ai flussometri digitali. I flussi d'aria totali in uscita dal sistema devono essere uguali al flusso d'aria in ingresso nel sistema. In caso contrario, è presente una perdita.

La perdita influenzerà il flusso d'aria in tutti i tubi, ma il tubo problematico di solito è quello che mostra il maggiore calo del flusso d'aria. Se viene identificata una nuova perdita, di solito è causata da un tubo di vetro che si è rotto all'interno dell'adattatore, oppure è causata da frammenti di vetro all'interno degli adattatori di esperimenti precedenti. Durante questo processo, assicurarsi che l'umidità dell'aria in uscita dal sistema sia compresa tra il 60 e l'80%Dopo che le mosche si sono acclimatate ai loro tubi, l'esperimento può essere eseguito.

In linea di principio, finora è possibile presentare qualsiasi sequenza di odori. I migliori risultati si ottengono randomizzando gli stimoli e separandoli di almeno 90 secondi. In totale.

Presenta ogni odore 40 volte in impulsi di 500 millisecondi. Quindi, imposta una regione di interesse trascinando un fotogramma sull'area da monitorare. Includi tutti i 15 tubi di vetro nel telaio, ma escludi i cinque millimetri esterni delle estremità dei tubi.

Il passaggio successivo consiste nello disattivare il software di tracciamento e apportare modifiche allo script. Ciò cambierà la posizione dell'asse Y delle 14 linee parallele che separano i singoli tubi. Quando il software di tracciamento è di nuovo attivo, dovrebbe essere presente solo una mosca tra due linee.

Quindi, assicurati che i parametri della fotocamera siano impostati in modo che le mosche siano tracciate in modo affidabile attraverso i tubi di vetro. Se le mosche si perdono ai bordi della regione di interesse, aumentare la luminosità o il guadagno del software di tracciamento. Ora che il sistema è completamente pronto, avviare il protocollo di stimolo.

Registra le posizioni delle mosche a una velocità di 20 fotogrammi al secondo e registra queste posizioni delle coordinate in combinazione con lo stato della valvola degli odori in file di testo. Poiché l'esperimento è molto sensibile agli odori, è necessaria una pulizia regolare per pulire i tubi di vetro, immergerli nel detersivo e poi sciacquarli sotto l'acqua distillata corrente. Dopo il risciacquo, asciugare i tubi sotto pressione e poi riscaldarli a 200 gradi Celsius per otto ore.

Per pulire prima il sistema di erogazione degli odori, rimuovere tutte le fiale e i tubi degli odori dalla camera di miscelazione centrale. Quindi rimuovere gli adattatori dei tubi dalla camera di miscelazione. Pulire la camera di miscelazione svuotata sciacquandola con un solvente sotto una cappa come le provette.

Asciugare la camera di miscelazione con aria pressurizzata e riscaldarla a 200 gradi Celsius per otto ore. Per pulire le fiale degli odori e le valvole, rimuovere i tappi in acciaio, eliminare le guarnizioni in gomma e rimuovere le valvole di ritegno, le valvole di ritegno del sapone e l'etanolo e altri componenti sia in etanolo che in acetone. Quindi, sonicare i componenti imbevuti per 30 minuti al massimo e risciacquarli con acqua distillata.

Come in precedenza, utilizzare aria pressurizzata per l'essiccazione e riscaldare i componenti a 200 gradi Celsius per otto ore. Sciacquarli con etanolo Quando l'acetone nella direzione del flusso d'aria, poiché l'acetone attacca le parti in gomma, asciugare immediatamente ogni valvola di ritegno lavata con aria pressurizzata per rimuovere tutti gli odori residui dalle valvole di ritegno lavate. Pulsare l'aria attraverso di essi per diversi giorni, posizionarli in un'incubatrice a 60 gradi Celsius con flusso d'aria che pulsa su e giù a intervalli di un secondo.

15 mosche femmine affamate sono state esposte al butirrato di etile. La barra gialla rappresenta l'impulso dell'odore. I quadrati blu raffigurano il movimento di bolina in un intervallo di tempo di 100 millisecondi.

Di conseguenza, i quadrati rossi raffigurano il movimento sottovento. Le stesse mosche hanno anche mostrato un movimento sopravento in risposta alla stimolazione con acetato di isop pentile, acetato di etile o due tre butano d in media alla popolazione. La risposta della mosca all'acetato di etile ha avuto un inizio brusco, un'ampiezza elevata e una breve durata.

Al contrario, la risposta a due tre butani Dion ha avuto un esordio medio più tardivo, un'ampiezza inferiore e una durata più lunga. Alla fine, i dati di ciascun odorante sono stati risolti in questo modo e quindi ulteriormente analizzati per mostrare che tutti e quattro gli odori suscitavano uno spostamento di bolina più elevato entro quattro secondi rispetto al solvente. Inoltre, aprendo le fiale odoranti, le mosche sono state esposte in modo sincrono a tutte le possibili miscele.

Dopo aver stimolato le mosche con i quattro odori individuali, le stimolazioni con miscele dei quattro odori erano tutte attraenti almeno quanto il singolo composto più attraente della miscela. Una volta padroneggiato, puoi eseguire questo esperimento entro un'ora, e poi viene eseguito per otto ore e già 30 minuti dopo puoi visualizzare i tuoi primi risultati. Quindi questo metodo consente davvero di ottenere dati da molte mosche in breve tempo con un'alta risoluzione temporanea.

Ma fai attenzione. Questo esperimento richiede un'ampia pulizia tra gli esperimenti. Se il tuo sistema è ancora contaminato dalle formiche dell'ultimo esperimento, puoi dimenticare i tuoi risultati nella camminata al volo.

Naturalmente, è possibile testare anche mosche geneticamente modificate in modo da poter studiare l'impatto di circuiti neurali individuali o di fabbrica sul comportamento guidato OD. Dopo lo sviluppo di questa nuova tecnica, ci ha aperto la strada alla ricerca in questo settore, fazione degli insetti, per comprendere la codifica di questi odori nel cervello dell'insetto. E, soprattutto, l'uso dello stesso tipo di stimolazione per il comportamento nella camminata al volo e per l'esperimento fisiologico significa che possiamo davvero confrontare questi due diversi paradigmi sperimentali.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona idea su come stabilire la camminata della mosca e dovresti essere in grado di stabilire questo esperimento in grembo e iniziare presto i tuoi esperimenti ad alto rendimento sull'affetto degli insetti. Ma non dimenticare che lavorare con vetreria e prodotti chimici può essere estremamente pericoloso, quindi indossa sempre un camice da laboratorio. Usa occhiali e guanti.