Ad alta risoluzione quantificazione del comportamento Odor-guidata

L'obiettivo generale di questo bioassaggio comportamentale è studiare il comportamento guidato dagli odori nelle mosche dell'aceto. Fly Walk è un sistema ad alto rendimento che traccia e analizza automaticamente le risposte comportamentali di singole mosche multiple a stimoli olfattivi. Questa nuova tecnica può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'olfatto negli insetti.

Come si presenta l'equilibrio edonico di un odore, oppure cosa comporta l'aggiunta di ulteriori odoranti a questo equilibrio? Il vantaggio principale di questo esperimento è che possiamo monitorare il comportamento guidato dall'odore con un'elevata risoluzione temporale, utilizzando stimoli odorosi simili a quelli che gli insetti sperimentano in natura o a quelli impiegati anche nelle registrazioni elettrofisiologiche. In generale, chi tenta di utilizzare questo metodo potrebbe incontrare difficoltà, poiché è essenziale disporre di un sistema ermetico: bisogna conoscere con precisione il percorso dell'aria ed essere certi che non vi siano assolutamente perdite attraverso cui l'aria possa fuoriuscire dal sistema. Per questi esperimenti, è importante allevare le mosche in un ciclo luce-buio 12:12 in colture a densità bassa o media contenenti un mezzo nutritivo normale.

Mantenere la temperatura ambiente tra 23 e 25 gradi Celsius e l'umidità relativa intorno al 70% in preparazione. Utilizzare provette di coltura grandi per ottenere da 20 a 30 adulti per una settimana e raccogliere gruppi di 30-40 prole di sesso misto per formare un gruppo sperimentale. Quando un gruppo ha un'età compresa tra due e quattro giorni, trasferirlo in una nuova provetta contenente un tappo di spugna umida o un foglio di carta assorbente inumidito.

Fare digiunare le mosche in questa provetta per 24 ore prima del test. È fondamentale che le mosche non vengano anestetizzate durante questo trasferimento. Per questa configurazione, bottiglie da 250 millilitri fungono da numerosi umidificatori.

Riempire ogni bottiglia con 100 millilitri di acqua distillata. Successivamente, preparare stock di lavoro da mezzo millilitro per ciascun odorante, effettuando un’ulteriore diluizione 1000 volte rispetto agli odori puri in olio minerale. Analogamente, preparare un tubo PCR contenente soltanto olio minerale da utilizzare come controllo negativo.

Ora preparare il sistema di somministrazione degli odori per ciascun odorante nell'esperimento. Collegare due valvole di non ritorno a ogni provetta per odore.

Assicurarsi di collegare le fiale degli odori nel corretto senso di flusso. Un collegamento errato non solo comprometterebbe l'esperimento pianificato, ma potrebbe anche contaminare il sistema di erogazione. Successivamente, verificare il sistema per eventuali perdite.

Prima, sigillare l'uscita della camera di miscelazione. Quindi verificare che tutta la portata d'aria prima del dispositivo di stimolo scenda a zero. Se ci sono perdite nel sistema, ascoltare per individuarle.

Di solito possono essere risolti sostituendo le guarnizioni in gomma nei collegamenti cruciali o sostituendo i tubi in teflon. Per il primo passaggio di questa procedura, esiste il rischio di rottura del vetro, quindi indossare l'equipaggiamento di protezione. Trasferire con attenzione 15 moscerini singoli nei singoli tubi di vetro utilizzando un aspiratore, quindi chiudere i tubi di vetro su entrambe le estremità con gli appositi adattatori, che devono aderire perfettamente.

Successivamente, collegare i tubi di vetro caricati al dispositivo fly walk. Una volta attaccati tutti i tubi, lasciare che le mosche si abituino al nuovo ambiente per almeno 15 minuti prima di iniziare l'esperimento. Ora accendere la sorgente luminosa.

Assicurarsi di fornire una quantità di luce sufficiente per un monitoraggio efficiente senza aumentare la temperatura all'interno dei tubi di vetro. A questo punto, tutte le provette per gli odori devono essere collegate per creare un sistema chiuso. Il periodo di abituazione dipende da un sistema chiuso privo di perdite, in modo che la portata d'aria attraverso i tubi sia alla stessa velocità rispetto ai periodi di prova.

Verificare il flusso d'aria del computer, collegandolo ai flussimetri digitali. I flussi d'aria totali in uscita dal sistema devono essere uguali al flusso d'aria in ingresso nel sistema. In caso contrario, è presente una perdita.

La perdita influirà sul flusso d'aria in tutti i tubi, ma il tubo problematico di solito è quello che mostra la maggiore riduzione del flusso d'aria. Se viene identificata una nuova perdita, di solito è causata da un tubo di vetro rotto all'interno dell'adattatore, oppure da frammenti di vetro negli adattatori provenienti da esperimenti precedenti. Durante questo processo, assicurarsi che l'umidità dell'aria in uscita dal sistema sia compresa tra il 60 e l'80%. Dopo che le mosche si sono ambientate nei loro tubi, è possibile avviare l'esperimento.

In linea di principio, qualsiasi sequenza di odori può essere presentata finora. I migliori risultati si ottengono randomizzando gli stimoli e separandoli di almeno 90 secondi. In totale.

Somministrare ogni odore 40 volte mediante impulsi di 500 millisecondi. Successivamente, impostare una regione di interesse trascinando un riquadro sull'area da monitorare. Includere tutti e 15 i tubi di vetro nel riquadro, escludendo però i cinque millimetri esterni delle estremità dei tubi.

Il passo successivo consiste nel disattivare il software di tracciamento ed effettuare delle modifiche allo script. Questo modificherà la posizione sull'asse Y delle 14 linee parallele che separano le singole provette. Quando il software di tracciamento verrà riattivato, tra due linee dovrebbe essere presente un solo moscerino.

Successivamente, assicurarsi che i parametri della telecamera siano impostati in modo che le mosche vengano tracciate in modo affidabile lungo tutta la lunghezza dei tubi di vetro. Se le mosche vengono perse ai margini della regione di interesse, aumentare la luminosità o il guadagno del software di tracciamento. Ora che il sistema è completamente preparato, avviare il protocollo di stimolo.

Registrare le posizioni delle mosche a una frequenza di 20 fotogrammi al secondo e registrare queste coordinate insieme allo stato della valvola dell'odore in file di testo. Poiché l'esperimento è molto sensibile agli odori, è necessaria una pulizia regolare per pulire i tubi di vetro, immergerli in detergente e quindi risciacquarli con acqua distillata corrente. Dopo il risciacquo, asciugare i tubi con aria sotto pressione e quindi riscaldarli a 200 gradi Celsius per otto ore.

Per pulire per prima cosa il sistema di somministrazione degli odori, rimuovere tutte le provette degli odori e i tubi dalla camera centrale di miscelazione. Successivamente, rimuovere gli adattatori dei tubi dalla camera di miscelazione. Pulire la camera vuota sciacquandola con un solvente sotto cappa, come si fa per i tubi.

Asciugare la camera di miscelazione utilizzando aria pressurizzata e riscaldarla a 200 gradi Celsius per otto ore. Per pulire le provette degli odori e le valvole, rimuovere i tappi in acciaio, scartare le guarnizioni di gomma ed estrarre le valvole di non ritorno, le valvole di non ritorno per sapone, l'etanolo e gli altri componenti sia dall'etanolo che dall'acetone. Successivamente, sottoporre i componenti in ammollo a ultrasuoni per 30 minuti alla massima potenza e risciacquarli con acqua distillata.

Come in precedenza, utilizzare aria compressa per l'essiccazione e riscaldare i componenti a 200 gradi Celsius per otto ore. Lavare i componenti con etanolo quando l'acetone è nel senso del flusso d'aria, poiché l'acetone attacca le parti in gomma; asciugare immediatamente ogni valvola di non ritorno lavata con aria compressa per rimuovere tutti gli odori residui dalle valvole sottoposte a lavaggio. Far passare aria pulsata attraverso di essi per diversi giorni, posizionandoli in un incubatore a 60 gradi Celsius con flusso d'aria che si attiva e disattiva a intervalli di un secondo.

15 femmine di moscerini privati di cibo sono stati esposti a butirrato di etile. La barra gialla rappresenta l'impulso di odore. I quadrati blu indicano il movimento controvento entro un intervallo di 100 millisecondi.

I quadrati rossi rappresentano in modo corrispondente il movimento sottovento. Le stesse mosche hanno mostrato anche movimenti controvento in risposta alla stimolazione con acetato di isopentile, acetato di etile o due butano d, mediati sulla popolazione. La risposta della mosca all'acetato di etile ha presentato un inizio netto, un'alta ampiezza e una breve durata.

Al contrario, la risposta al due tre butano Dion presentava un'inizio medio più tardivo, un'ampiezza inferiore e una durata maggiore. In definitiva, i dati provenienti da ciascun odorante sono stati risolti in questo modo e successivamente analizzati per mostrare che tutti e quattro gli odoranti provocavano uno spostamento verso monte superiore entro quattro secondi rispetto al solvente. Inoltre, aprendo in sincronia le provette degli odoranti, le mosche sono state esposte a tutte le possibili miscele.

Dopo aver stimolato le mosche con i quattro singoli odori, le stimolazioni con miscele dei quattro odori sono risultate almeno altrettanto attraenti del composto singolo più attraente presente nella miscela. Una volta acquisita padronanza, è possibile eseguire questo esperimento entro un'ora, dopodiché l'esperimento prosegue per otto ore e già dopo soli 30 minuti è possibile visualizzare i primi risultati. Questo metodo consente quindi di ottenere dati da numerose mosche in breve tempo e con un'elevata risoluzione temporale.

Ma fate attenzione. Questo esperimento richiede una pulizia approfondita tra un esperimento e l'altro. Se il vostro sistema è ancora contaminato dalle formiche dell'esperimento precedente, dovrete rinunciare ai vostri risultati nel fly walk.

È naturalmente possibile testare anche moscerini geneticamente modificati, permettendo di indagare l'impatto di singoli circuiti neurali o di circuiti specifici sul comportamento guidato dagli OD. Dopo lo sviluppo di questa nuova tecnica, si è aperta la strada alla ricerca in questo settore, la fisiologia degli insetti, per comprendere la codifica di questi odori nel cervello dell'insetto. E cosa importante, utilizzare lo stesso tipo di stimolazione sia per esperimenti comportamentali nella camminata del moscerino che per esperimenti fisiologici significa che possiamo effettivamente confrontare questi due diversi paradigmi sperimentali.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere un'idea chiara su come impostare la prova di cammino della mosca, e dovresti essere in grado di allestire questo esperimento nel tuo laboratorio e avviare presto i tuoi esperimenti ad alto rendimento sul comportamento degli insetti. Ma non dimenticare che lavorare con vetreria e sostanze chimiche può essere estremamente pericoloso, quindi indossa sempre un camice da laboratorio. Usa occhiali protettivi e guanti.