Un nuovo approccio che elimina la gestione per lo studio Aggressione e l'effetto "Loser" in

L'obiettivo generale di questo metodo è indurre la formazione di effetti del perdente e del vincitore in Drosophila melanogaster eliminando la manipolazione delle mosche dalla procedura comportamentale. La maggior parte degli studi comportamentali sugli animali condotti in laboratorio prevede la manipolazione degli animali. Tale manipolazione, a sua volta, di solito induce stress negli animali, e lo stress può interferire con gli studi comportamentali che si intende effettuare; si cerca quindi di eliminare la manipolazione stressante degli animali.

Abbiamo sviluppato una nuova camera per i nostri studi sull'aggressività nei moscerini della frutta che elimina completamente il manipolamento degli animali prima, durante o dopo gli esperimenti. Utilizzando queste nuove camere, tutti i parametri comportamentali che abbiamo misurato si sono rivelati migliori. Con questo metodo, riduciamo al minimo la variabilità comportamentale tra gli individui.

Riduciamo il tempo necessario per generare una chiara relazione di dominanza e siamo stati in grado di indurre forti mentalità di perdente e di vincitore. Queste camere sono facili da usare e possono avere scopi multipli per lo studio di diversi comportamenti del moscerino della frutta. Per iniziare l'esperimento, allevare e mantenere ceppi di moscerini in un incubatore con ciclo luce-buio di 12 ore a 25 gradi Celsius e 50% di umidità relativa.

Successivamente, preparare le provette per l'isolamento riscaldando del nuovo alimento per moscerini fino a quando non si è sciolto. Utilizzando una pipetta Pasteur, trasferire circa 1,5 millilitri di alimento fuso in singole provette di vetro vuote e lasciare solidificare l'alimento con un pennello sottile. Rimuovere delicatamente una pupa maschile in stadio avanzato dalla provetta di riserva e posizionarla sul lato di una provetta contenente alimento appena preparato.

Chiudere i vial di isolamento con cotone e conservare i vial di isolamento nell'incubatrice. Dopo l'isolamento, le mosche sono pronte per essere marcate. Anestetizzare la mosca con anidride carbonica, quindi con uno stuzzicadenti sottile.

Applicare un piccolo punto di vernice acrilica sul torace, evitando di verniciare la testa, le ali, l'addome o le zampe. Lasciare asciugare la vernice per circa 10 secondi e trasferire delicatamente le mosche nei loro originali provette di isolamento. Riporre le provette di isolamento nell'incubatrice.

Proseguire con la preparazione dell'apparato riscaldando del nuovo alimento per moscerini fino a quando non si sarà sciolto. Utilizzare una pipetta posteriore per trasferire 0,8 millilitri di alimento nel coperchio della provetta con tappo a vite e lasciare raffreddare l'alimento. Una volta che l'alimento si sarà raffreddato.

Applicare una piccola goccia di pasta fresca di lievito al centro della superficie della coppetta contenente il cibo. Lavare l'apparato e le singole camere di combattimento con acqua prima di ogni utilizzo e asciugarli con un tovagliolo di carta. Successivamente, applicare una goccia di mastice sulla coppetta del cibo e posizionarla al centro di ciascuna camera di combattimento.

Coprire le camere di combattimento con il coperchio dell'apparato. Posizionare l'apparato coperto sotto una sorgente luminosa e installare una videocamera sopra la struttura. Iniziare gli esperimenti comportamentali inserendo divisori di plastica in ciascuna camera di combattimento.

Rimuovere il tappo di cotone dal tubo di isolamento e posizionare il tubo al di sotto di un foro aperto sul lato dell'apparato. Far entrare la mosca nella camera di combattimento sfruttando l'asse geotassico negativo. Chiudere quindi la parete scorrevole dopo che la mosca è entrata nella camera. Ripetere la procedura per introdurre la seconda mosca nella camera di combattimento sull'altro lato dell'apparato.

Successivamente, riposizionare l'apparato nella posizione illuminata per la ripresa video. Iniziare la registrazione e rimuovere il divisore di plastica per consentire alle mosche di interagire negli esperimenti sull'effetto del perdente. Registrare i primi combattimenti per 20 minuti per garantire la formazione di relazioni di dominanza solide.

Dopo 20 minuti, reinserire delicatamente il divisore di plastica nelle camere di combattimento per separare le mosche e interrompere la registrazione video. Per indurre una forte mentalità da perdente, assicurarsi che le mosche stabiliscano e mantengano una relazione di dominanza durante il primo combattimento, quindi ridurre al minimo il disturbo agli animali durante l'inserimento dei divisori per separare le mosche. Dopo un periodo di riposo di 10 minuti, iniziare la registrazione e rimuovere delicatamente il divisore di plastica.

Lasciare le mosche interagire per ulteriori 20 minuti. Interrompere la registrazione dopo 20 minuti per concludere l'esperimento. Rimuovere le mosche dalle camere comportamentali sfruttando l'asse geotassico negativo, invertendo la procedura descritta prima che il nuovo metodo fosse utilizzato per osservare i primi combattimenti.

In media, il primo incontro viene osservato dopo due minuti. Il primo affondo avviene dopo quattro minuti, e le mosche stabiliscono una relazione di dominanza dopo otto minuti. Durante i restanti 12 minuti, la relazione di dominanza viene rafforzata.

Mentre i vincitori avanzano sempre di più e i perdenti si ritirano sempre di più. Il nuovo approccio è stato utilizzato per quantificare l'effetto del perdente, ovvero la percentuale di perdenti che perdono il secondo combattimento durante i secondi combattimenti. Un effetto significativo viene osservato quando i perdenti precedenti sono accoppiati con vincitori familiari o con vincitori sconosciuti per i loro secondi combattimenti.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di effettuare il saggio di aggressività utilizzando maschi adulti di età compresa tra sei e sette giorni, allevati in isolamento sociale. Una volta padroneggiate, queste camere permettono un facile inserimento, monitoraggio, interazione e separazione delle mosche senza alcun intervento manuale, inducendo un forte effetto di perdente. L'uso di divisori per separare le mosche dopo il primo combattimento consente una variabilità nel protocollo sperimentale.

È possibile mantenere i vincitori e accoppiarli con un avversario diverso nel secondo combattimento per indurre un effetto del vincitore. Con piccole modifiche, le stesse camere possono essere utilizzate per studiare il corteggiamento, la locomozione e altri comportamenti sociali della moscerina della frutta. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire saggi di aggressività e di come indurre un effetto del perdente senza manipolare le mosche prima e durante gli esperimenti.