Controllo RNAi mediata di aflatossine in arachidi: metodo per analizzare produzione di micotossine e transgene espressione nel Peanut / Aspergillus Patosistema

L'obiettivo generale di questo lavoro è fornire un metodo affidabile, accurato, economico e veloce per testare l'efficacia del silenziamento mediato da RNAi dei geni di sintesi dell'aflatossina di aspergillus nelle arachidi transgeniche utilizzando un numero minimo di semi, di solito sono necessari centinaia di grammi di semi per quantificare efficacemente le aflatossine nei campioni. Il vantaggio principale di questa tecnica è che utilizza meno di cinque semi per testare un particolare trattamento 10 giorni prima della preparazione dei semi, allestendo una coltura di aspergillus flavus positivo all'aflatossina, NR RL 3, 3, 5, 7 in ZAP Pex coclea medium. Coltiva questa cultura a 25 gradi Celsius.

Sarà utilizzato per l'inoculazione dei semi. Dopo aver preparato le piante transgeniche che esprimono il RNAI, che è dettagliato nel protocollo di testo, procedere con la raccolta dei loro semi. Per prima cosa, rimuovi la carpa perica usando l'abrasione di un'idropulitrice impostata su un valore basso, oppure raschia via la carpa perica a mano.

Una volta rimossa la carpa peri, identifica il colore della carpa meso posizionando i baccelli su una tavola di maturità nei gruppi appropriati. Ora togliete i buchi e lavorate separatamente i semi gialli e marroni. Calcola il numero di semi necessari per l'esperimento Almeno tre pezzi di semi, il che significa che sono necessarie tre metà di coleadina per ogni linea di arachidi campionata.

Copri il fondo di un becher sterile con uno strato di semi, quindi copri i semi con un volume misurato di etanolo al 75%. Quindi raddoppia quel volume. Lascia incubare i semi in soluzione per 30 secondi, quindi sciacquali in acqua distillata sterilizzata.

Successivamente, trattare i semi con un volume di ipoclorito al 2% come fatto con l'etanolo F. Lasciate che l'incubazione proceda per cinque minuti. Quindi utilizzare tre risciacqui in volumi quintuplicati di acqua distillata sterilizzata.

Per rimuovere l'ipoclorito, è fondamentale che tutta la soluzione di ipoclorito venga lavata via in questa fase. I semi sono ora sterilizzati in superficie. Successivamente, idratare i semi immergendoli in acqua distillata sterilizzata per due ore preparata per mettere i semi idratati su una capsula di Petri sterile.

Tutti i materiali devono essere sterilizzati a questo punto. Rimuovere i rivestimenti dei semi usando una pinza, quindi separare il cohain. Infine, rimuovi gli embrioni con un bisturi.

Gli embrioni possono essere scartati o utilizzati per rigenerare nuove piante. Successivamente, tagliare l'oleina a metà con un bisturi e immergere le metà e l'acqua distillata sterilizzata fino a quando non sono pronte per l'inoculazione. Quindi, tamponare l'acqua in eccesso da metà piombo su carta assorbente sterile e posizionare i pezzi di semi in piastre a coclea separate all'1,5% con divot delle dimensioni del seme e infilare i semi in essi con i lati tagliati verso l'alto per inoculare le metà del piombo di piombo.

Aggiungere due microlitri di 10.000 spore di aspergillus per microlitro di sospensione alle superfici tagliate. Non lasciare che la sospensione scorra lungo i lati della metà del seme. Infine, metti i piatti in un'incubatrice scura a 30 gradi Celsius per uno o quattro giorni fino a quando non vengono testati.

Dopo un giorno, dopo due giorni e dopo tre o quattro giorni di campionamento, i semi rimuovono delicatamente le metà inoculate selezionate a caso, se necessario. Utilizzare un fazzoletto per pulire le spore in eccesso e la coclea e posizionare il campione in una fiala di vetro con tappo a vite. Trasferire i campioni non inoculati in provette da due millilitri per l'analisi R-T-P-C-R.

Campioni gratuiti in azoto liquido e conservare i campioni congelati in un congelatore fino a quando non vengono elaborati. Per l'analisi dell'aflatossina, se necessario, prelevare l'inoculato piombo da mezza cotola in una fiala di vetro con tappo a vite da quattro millilitri. Il campione sarà stabile per molti mesi a -80 gradi Celsius.

Quando i semi sono a temperatura ambiente, estrarre il campione aggiungendo quattro volumi di metanolo e lasciando incubare le provette per una notte al buio a temperatura ambiente senza agitazione. Il giorno successivo, eseguire prima l'UPLC, preparare una mini colonna di propilene da 1,5 millilitri con una fritta abbinata. Quindi aggiungere 200 milligrammi di ossido di alluminio.

E poi, inserisci un'altra fritta. La posizione successiva, A-U-P-L-C autocampiona la fiala sotto e a contatto con la mini colonna per ridurre al minimo l'evaporazione. Ora aggiungi 0,5 millilitri di estratto di metanolo dal campione a un bicchiere usa e getta due non di plastica.

Quindi aggiungere 0,5 millilitri di nitrile di aceto alla provetta e mescolare le soluzioni con una pipetta. Ora applica 0,5 millilitri di miscela sulla mini colonna preparata e raccogli l'EIT usando solo la gravità. Una volta raccolto l'EIT, applicare rapidamente un tappo settico alla fiala di raccolta per l'uso sull'UPLC.

Porre i flaconcini in A-U-P-L-C già preparati con una fase mobile di prova con acqua, metanolo e acedonite. Quindi quantificare il contenuto di aflatossine negli EIT. Per ulteriori dettagli, vedere il protocollo di testo insieme all'analisi UPLC.

Preparare i pezzi di semi utilizzati per l'estrazione in fiale di vetro individuali. Quindi liofilizzare le fiale durante la notte e misurare il peso secco del campione di tessuto al mattino in modo che le concentrazioni di aflatossina possano essere espresse in nanogrammi per grammo di campione. Quindi rimuovere i campioni dal congelatore e aggiungere il triolo e macinare i tessuti congelati con un omogeneizzatore a sfere a 3, 100 giri/min per 40 secondi e procedere all'estrazione dell'RNA, un vettore RNAI che trasporta piccoli frammenti di cinque geni di sintesi dell'aflatossina da un flavis è stato utilizzato per trasformare le piante di arachidi.

I numeri di identificazione corrispondono ai numeri di annotazione del genoma dell'ampio istituto da 99 TRASFORMANTI rigenerati, sette linee positive alla PCR sono state clonate e testate come descritto. Tutti e sette hanno mostrato un accumulo di aflatossine inferiore dal 60 al 100% rispetto alle linee di controllo. Vengono presentati i risultati di due delle sette linee.

Queste due linee RN AI hanno mostrato la presenza di due marcatori selezionabili NPT. Secondo i risultati S-T-N-P-C-R, il controllo negativo utilizzato era una linea negativa PCR che ha attraversato il processo di trasformazione per testare le linee RNAi per la loro capacità di resistere alle aflatossine appena raccolte kedia di un'aflatossina positiva. Una linea di flavis NRRL 3 3 5 7 è stata applicata a mezza culla leadin priva di embrione e testa dopo incubazione fino a 96 ore.

I tessuti inoculati sono stati processati utilizzando l'UPLC per misurare i loro livelli di aflatossina come descritto. Questi risultati sono stati ulteriormente confermati dalla spettrometria di massa per cromatografia liquida. Nel complesso, l'RNAi 2 88 72 ha mostrato una riduzione dal 94 al 100% dell'aflatossina B 2 e una riduzione del 90-100% dell'aflatossina B 1 rispetto al controllo.

Mentre l'RNAi 2 88 74 ha mostrato una riduzione dal 60 al 100% di entrambe le aflatossine. Seguendo questa procedura, gli stessi estratti di semi possono essere utilizzati per analizzare il fito Xin al fine di comprendere meglio la risposta del seme all'invasione fungina. Questo metodo fornirà anche uno strumento unico per aiutare a sviluppare la tecnologia RNAI per il controllo delle micotossine.