A Corsa Versatile Modello murino di Subcortical bianco Materia per lo Studio della assonale degenerazione e bianco Materia Neurobiologia

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di localizzare con precisione un piccolo tratto all'interno della sostanza bianca murina per modellare questa forma comune di ictus della sostanza bianca sottocorticale. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'ictus, come i meccanismi della lesione assonale, la risposta neuronale all'ictus sottocorticale e il modo in cui gli elementi cellulari della sostanza bianca rispondono durante le fasi acute e di riparazione dell'ictus. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può essere utilizzata per localizzare con precisione un tratto sulla sostanza bianca e può essere utilizzata con un'ampia varietà di modelli murini di topo.

In generale, gli individui nuovi a questo metodo avranno difficoltà, a causa della piccola quantità di sostanza bianca che porta all'errata localizzazione dell'ictus. Potrebbero essere necessarie piccole regolazioni dell'angolo di iniezione o delle coordinate stereotassiche per ogni ceppo di topo o una configurazione stereotassica. Inizia fissando prima una pipetta di vetro tirata su un tubo collegato a una linea del vuoto.

Inserire l'estremità tirata nella soluzione di L-Nio o nel tracciante fluorescente L-Nio plus. Avviare l'aspirapolvere e applicare l'aspirazione fino a riempire almeno due millimetri della parte di 0,5 millimetri di diametro della pipetta. Mettere da parte la pipetta piena.

Quindi posizionare il topo in un apparato stereotassico dotato di un microscopio stereotassico. Dopo aver anestetizzato e preparato il topo per l'intervento chirurgico secondo le procedure approvate, controllare la profondità dell'anestesia con un pizzico di punta. Non ci dovrebbe essere alcuna risposta.

Quindi, regolare il braccio di iniezione a 36 gradi. Fissare un supporto per pipetta di vetro estratto all'estremità distale di un sistema di iniezione a bassa pressione a volume e collegarlo al braccio di iniezione. Dopo aver praticato un'incisione del cuoio capelluto sulla linea mediana di 1,5 centimetri per esporre il cranio, asciugare il cranio superficiale con un batuffolo di cotone.

Quindi, mentre si guarda attraverso un microscopio stereotassico, con un ingrandimento da uno a tre X, utilizzare uno strumento micropunto per rimuovere il tessuto periostale sovrastante. Segna Bregma con un pennarello a punta fine. Quindi utilizzare un trapano chirurgico dotato di una punta chirurgica a punta fine per praticare una craniotomia ellittica di due millimetri, che inizia posteriormente alla bregma e si estende anteriormente appena a sinistra della linea mediana.

Rimuovere i frammenti ossei e i tessuti molli sovrastanti in modo che la corteccia cerebrale possa essere visualizzata. Mantenere umida la superficie corticale applicando a intermittenza gocce di soluzione fisiologica sterile. Quindi, fissare la pipetta piena al braccio dell'iniettore.

Allineare l'estremità distale della pipetta con bregma e azzerare le coordinate stereotassiche. Far avanzare la pipetta fino al primo punto di iniezione utilizzando le coordinate anteriore, posteriore e mediale-laterale elencate nella tabella uno. Quindi, far avanzare la pipetta sulla superficie corticale e azzerare la misurazione dorso-ventrale.

Abbassare lentamente la pipetta fino alle coordinate dorso-ventrali. Assicurarsi che l'ingrandimento del microscopio stereotassico sia impostato su tre X e che il reticolo calibrato possa essere visualizzato chiaramente. Osservare la pipetta angolata lateralmente in modo che il menisco del fluido atmosferico abbia una vista sagittale.

Il menisco deve apparire sullo stesso piano focale sia della parete interna che di quella esterna della pipetta. Ora, utilizzando un sistema di iniezione a pressione locale impostato a 20 PSI per impulsi di 20 millisecondi, iniettare 100 nanolitri di L-Nio nel cervello. Dopo aver iniettato il volume totale, attendere cinque minuti per evitare il reflusso lungo il binario della pipetta.

Quindi, prelevare la pipetta e ripetere la procedura di iniezione alla seconda e alla terza serie di coordinate fornite nella tabella uno. Dopo l'iniezione finale, rimuovere la pipetta e posizionare una quantità sufficiente di cera ossea per riempire il sito della craniotomia. Infine, approssimare i bordi della ferita del cuoio capelluto e legare con adesivo dermico.

Dopo aver somministrato l'analgesia postoperatoria, posizionare l'animale in una gabbia pulita. Fornire antibiotici postoperatori nell'acqua potabile per cinque giorni, o fino al sacrificio se meno di cinque giorni. Dopo aver sacrificato e decapitato il topo secondo le procedure approvate, utilizzare forbici sterili per aprire il cranio posteriormente, quindi utilizzare una spatola per rimuovere delicatamente il cranio sovrastante.

Successivamente, inserire una spatola sterile da quattro millimetri nella parte anteriore del cervello per recidere il bulbo olfattivo e i nervi ottici. Quindi, sollevare delicatamente il cervello dal calvario e metterlo in un tampone di dissezione ghiacciato. Usando un blocco cerebrale e lame di rasoio sterili, tagliare fette da due a tre millimetri contenenti la regione interessata e metterle in un tampone di dissezione freddo.

Sotto un microscopio da dissezione, identificare la sostanza bianca sottostante la corteccia motoria nell'emisfero iniettato. A intervalli post-ictus precoci, l'iniezione di L-Nio miscelato con comuni coloranti di laboratorio, come il verde veloce, può consentire l'identificazione visiva dell'ictus. A intervalli post-ictus più lunghi, la regione può essere identificata visivamente dalla necrosi focale e dal pallore mielino.

Una volta identificato, utilizzare un bisturi per sezionare con cura la regione di sostanza bianca contenente il tratto. Rimuovere la corteccia sovrastante e lo striato sottostante, come desiderato. Come mostrato qui, la marcatura in immunofluorescenza per i filamenti neurali, mostrata in rosso, dimostra il grado di perdita assonale sette giorni dopo l'ictus, utilizzando l'approccio mediale.

Utilizzando l'approccio angolato posteriore, la lesione da ictus della sostanza bianca è mirata appena sopra il ventricolo laterale e mostra un'intensa reattività microgliale, come rilevato dall'immunomarcatura per IBA-1. Due marcatori di filamenti intermedi degli astrociti, la vimentina, mostrata in rosso, e la proteina acida fibrillare gliale, mostrata in verde, rivelano cambiamenti nella morfologia degli astrociti della sostanza bianca dopo l'ictus. La coiniezione di destrano ammina fluorescente al momento dell'induzione dell'ictus consente l'identificazione dei singoli neuroni con assoni danneggiati dall'ictus.

La maggior parte della marcatura avviene negli assoni all'interno dei neuroni di strato cinque e sei nelle cortecce sensomotorie primarie che sovrastano l'ictus. Questa immagine rappresenta sette giorni dopo l'ictus. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 45 minuti, se eseguita correttamente.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come produrre un ictus focale della sostanza bianca in un topo e preparare il cervello per una varietà di elaborazioni a valle, utili per rispondere a domande importanti nell'ictus e nella riparazione neurologica.