A Corsa Versatile Modello murino di Subcortical bianco Materia per lo Studio della assonale degenerazione e bianco Materia Neurobiologia
17 marzo 2016
Qui presentiamo la metodologia per la produzione di un ictus focale nella sostanza bianca murina mediante iniezione locale di un inibitore irreversibile dell'ossido nitrico sintasi endoteliale (eNOS) (L-Nio). Vengono presentate due varianti stereotassiche, il tracciamento neuronale retrogrado e la marcatura e dissezione di tessuti freschi che ampliano le potenziali applicazioni di questa tecnica.
L'obiettivo generale di questa procedura è localizzare con precisione un piccolo ictus nella sostanza bianca murina, al fine di modellare questa comune forma di ictus sottocorticale della sostanza bianca. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'ictus, come i meccanismi del danno assonale, la risposta neuronale all'ictus sottocorticale e il modo in cui gli elementi cellulari della sostanza bianca rispondono sia durante la fase acuta sia durante quella di riparazione dell'ictus. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente di localizzare con precisione l'ictus nella sostanza bianca ed è applicabile a una vasta gamma di modelli murini.
Generalmente, le persone nuove a questo metodo incontreranno difficoltà a causa della piccola quantità di sostanza bianca, che porta a un'errata localizzazione dell'ictus. Potrebbero essere necessari piccoli aggiustamenti dell'angolo di iniezione o delle coordinate stereotassiche per ciascun ceppo di topo, oppure per la configurazione stereotassica. Iniziare fissando innanzitutto una pipetta di vetro tirata a un tubo collegato a una linea di vuoto.
Inserire l'estremità tirata nella soluzione di L-Nio, oppure nella soluzione di L-Nio più tracciante fluorescente. Avviare il vuoto ed applicare aspirazione finché almeno due millimetri della porzione della pipetta con diametro di 0,5 millimetri risulta riempita. Mettere da parte la pipetta riempita.
Quindi posizionare il topo in un apparato stereotassico dotato di microscopio stereotassico. Dopo aver anestetizzato e preparato il topo per l'intervento chirurgico secondo le procedure approvate, verificare la profondità dell'anestesia con una pinzatura del dito del piede. Non dovrebbe esserci alcuna risposta.
Successivamente, regolare il braccio di iniezione a 36 gradi. Fissare un porta pipetta di vetro tirata all'estremità distale di un sistema di iniezione a basso volume con pressione e collegarlo al braccio di iniezione. Dopo aver praticato un'incisione mediana del cuoio capelluto di 1,5 centimetri per esporre il cranio, asciugare la superficie del cranio con un bastoncino di cotone.
Quindi, osservando attraverso un microscopio stereotassico con un ingrandimento da uno a tre volte, utilizzare uno strumento micropuntale per rimuovere eventuali tessuti periostei sovrastanti. Contrassegnare il bregma con un pennarello a punta fine. Successivamente, utilizzare un trapano chirurgico dotato di una punta chirurgica fine per eseguire una craniotomia ellittica di due millimetri, iniziando posteriormente dal bregma e proseguendo anteriormente appena a sinistra della linea mediana.
Rimuovere i frammenti ossei e i tessuti molli sovrastanti in modo da poter visualizzare la corteccia cerebrale. Mantenere la superficie corticale umida applicando a intervalli regolari gocce di soluzione salina sterile. Successivamente, fissare la pipetta riempita al braccio dell'iniettore.
Allineare l'estremità distale della pipetta con il bregma e azzerare le coordinate stereotassiche. Portare avanti la pipetta fino al primo punto di iniezione utilizzando le coordinate anteriore, posteriore e mediale-laterale riportate nella tabella uno. Successivamente, avanzare la pipetta fino alla superficie corticale e azzerare la misurazione dorso-ventrale.
Abbassare lentamente la pipetta fino alle coordinate dorso-ventrali. Assicurarsi che l'ingrandimento del microscopio stereotassico sia impostato su tre X e che il reticolo calibrato sia chiaramente visibile. Osservare la pipetta inclinata lateralmente in modo da avere una vista sagittale del menisco tra aria e liquido.
Il menisco deve apparire nello stesso piano focale sia della parete interna che di quella esterna della pipetta. Ora, utilizzando un sistema di iniezione locale con pressione impostata a 20 PSI per impulsi di 20 millisecondi, iniettare 100 nanolitri di L-Nio nel cervello. Dopo aver iniettato il volume totale, attendere cinque minuti per prevenire il reflusso lungo il tracciato della pipetta.
Quindi, ritirare la pipetta e ripetere la procedura di iniezione nel secondo e terzo set di coordinate indicati nella tabella uno. Dopo l'ultima iniezione, rimuovere la pipetta e applicare una quantità sufficiente di cera ossea per riempire il sito della craniotomia. Infine, avvicinare i margini della ferita del cuoio capelluto e fissarli con un adesivo dermico.
Dopo aver somministrato l'analgesia postoperatoria, posizionare l'animale in una gabbia pulita. Somministrare antibiotici postoperatori nell'acqua da bere per cinque giorni, oppure fino all'eutanasia se inferiore a cinque giorni. Dopo aver praticato l'eutanasia e decapitato il topo seguendo le procedure approvate, utilizzare forbici sterili per aprire il cranio in senso posteriore, quindi usare una spatola per rimuovere delicatamente il cranio sovrastante.
Successivamente, inserire una spatola sterile di quattro millimetri nella parte anteriore del cervello per recidere il bulbo olfattivo e i nervi ottici. Quindi, sollevare delicatamente il cervello dalla calotta cranica e collocarlo in un buffer di dissezione freddo. Utilizzando un blocco cerebrale e lame di rasoio sterili, tagliare fette di due-tre millimetri contenenti la regione interessata e collocarle nel buffer di dissezione freddo.
Sotto un microscopio stereoscopico, identificare la sostanza bianca sottostante la corteccia motoria nell'emisfero iniettato. In fasi precoci dopo l'ictus, l'iniezione di L-Nio mescolato con coloranti di laboratorio comuni, come il verde brillante, può consentire l'identificazione visiva dell'ictus. In fasi più tardive dopo l'ictus, la regione può essere identificata visivamente mediante necrosi focale e pallorizzazione della mielina.
Dopo aver identificato la zona, utilizzare un bisturi per dissezionare con attenzione la regione di sostanza bianca contenente l'ictus. Rimuovere, a seconda delle necessità, la corteccia sovrastante e lo striato sottostante. Come mostrato qui, la marcatura immunofluorescente per i neurofilamenti, mostrata in rosso, dimostra il grado di perdita assonale sette giorni dopo l'ictus, utilizzando l'approccio mediale.
Utilizzando l'approccio angolato posteriore, la lesione da ictus della sostanza bianca viene colpita appena al di sopra dei ventricoli laterali e mostra un'intensa reattività microgliale, come rilevato mediante immunomarcatura per IBA-1. Due marcatori dei filamenti intermedi astrocitari, la vimentina, mostrata in rosso, e la proteina acida fibrillare gliale, mostrata in verde, rivelano cambiamenti nella morfologia degli astrociti della sostanza bianca dopo l'ictus. La coiniezione di ammina fluorescente di destrano al momento dell'induzione dell'ictus permette l'identificazione di singoli neuroni con assoni danneggiati dall'ictus.
La maggior parte della marcatura avviene negli assoni all'interno dei neuroni dei livelli cinque e sei delle cortecce sensorimotorie primarie sovrastanti l'area colpita dall'ictus. Questa immagine rappresenta sette giorni dopo l'ictus. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 45 minuti, se svolta correttamente.
Dopo aver visionato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come indurre un ictus focale nel tessuto bianco cerebrale di un topo e preparare il cervello per diverse analisi successive, utili per rispondere a domande fondamentali nell'ambito dell'ictus e della riparazione neurologica.
Visualizza la trascrizione completa e accedi a migliaia di video scientifici
Panoramica
In questo articolo viene presentata una metodologia per indurre un ictus focale nella sostanza bianca murina mediante iniezione locale di un inibitore irreversibile dell'eNOS (L-Nio). La tecnica comprende variazioni stereotassiche e marcatura di tessuto fresco per potenziarne le applicazioni nella ricerca sull'ictus.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Ricerca sull'ictus
- Modelli murini
Sfondo
- Le lesioni focali nella sostanza bianca sono comuni nei modelli di ictus sottocorticale.
- Comprendere il danno assonale e le risposte neuronali è fondamentale nella ricerca sull'ictus.
- Una localizzazione precisa delle lesioni cerebrali può migliorare i risultati sperimentali.
- Le variazioni tra ceppi di topi potrebbero richiedere aggiustamenti nella tecnica.
Scopo dello studio
- Modellare con precisione l’ictus della sostanza bianca sottocorticale nei topi.
- Indagare i meccanismi di danno assonale e le risposte neuronali.
- Esplorare le risposte cellulari durante le fasi acute e di riparazione dell’ictus.
Metodi Utilizzati
- Iniezione di L-Nio mediante un apparato stereotassico.
- Preparazione del topo e procedure chirurgiche per l'induzione dell'ictus.
- Dissezione ed etichettatura del tessuto cerebrale per l'analisi.
- Etichettatura immunofluorescente per valutare la perdita assonale e la reattività microgliale.
Risultati principali
- Localizzazione riuscita delle lesioni da ictus nella sostanza bianca murina.
- Identificazione del danno assonale e dell'attivazione microgliale dopo l'ictus.
- Identificazione visiva dell'ictus mediante traccianti fluorescenti.
- Dimostrazione dei cambiamenti astrocitari in risposta all'ictus.
Conclusioni
- Questa tecnica consente una modellizzazione precisa degli ictus della sostanza bianca.
- Fornisce informazioni sui meccanismi cellulari del danno da ictus.
- Applicazioni future potrebbero migliorare la comprensione dei processi di recupero dopo l'ictus.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La modellizzazione dell'ictus focale della sostanza bianca nei topi affronta una lacuna critica nella ricerca preclinica sull'ictus, consentendo la riduzione del rischio meccanicistico dei percorsi di degenerazione assonale. Questo modello supporta la validazione degli obiettivi fornendo un sistema rilevante per la malattia, in cui studiare le risposte neuroinfiammatorie e di riparazione associate alla demenza vascolare e al carico di infarti silenti. Una localizzazione precisa della lesione aumenta la fiducia predittiva nella fase iniziale della scoperta, riducendo la variabilità biologica nei risultati degli esami successivi.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche relative ai meccanismi di danno assonale nelle patologie della sostanza bianca.
- Valore operativo: Offre una piattaforma compatibile con modelli murini per la validazione funzionale di bersagli mediante strumenti neurobiologici consolidati.
- Valore scientifico: Favorisce la riduzione del rischio biologico modellando il contributo degli infarti silenti alla progressione della demenza vascolare.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera endpoint istologici quantificabili, come la perdita assonale e la reattività microgliale, per la standardizzazione dei saggi.
- Valore operativo: Facilita la preparazione di sezioni di tessuto validate per analisi riproducibili mediante immunofluorescenza e tracciamento con traccianti.
- Valore scientifico: Consente la predisposizione per lo screening mediante induzione di lesioni focali compatibili con il tracciamento neuronale retrogrado e la marcatura di tessuto fresco.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Si allinea a sistemi rilevanti per la malattia modellando un ictus del midollo bianco sottocorticale che contribuisce alla demenza vascolare.
- Valore operativo: Garantisce continuità dalla fase di scoperta alla validazione preclinica mediante somministrazione stereotassica e processamento dei tessuti standardizzati.
- Valore scientifico: Supporta decisioni di avanzamento aggiustate per il rischio, collegando la localizzazione della lesione ai profili di risposta cellulare nelle fasi acuta e di riparazione.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nei flussi di lavoro della fase iniziale di scoperta consentendo la verifica di ipotesi sui meccanismi dello ictus specifici della sostanza bianca prima degli sforzi di identificazione del composto guida.
- Biologia della scoperta: Supporta la chiarificazione dei percorsi mediante l'induzione mirata di lesioni nei tratti della sostanza bianca nei modelli murini.
- Screening: Fornisce tessuti pronti per il saggio con output quantificabili, come l'attivazione microgliale IBA-1+ e la perdita dei filamenti assonali.
- Analisi: Offre variabili dipendenti misurabili, inclusa l'intensità di fluorescenza dei marcatori del neurofilamento e degli astrociti, per l'analisi comparativa delle condizioni.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica attraverso la modellizzazione delle fasi dell'ictus rilevanti per il deterioramento cognitivo vascolare.
- Riutilizzo aziendale: Offre un framework stereotassico riutilizzabile, adattabile a diverse linee di topi e combinazioni di traccianti per studi longitudinali.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi riducendo l'ambiguità meccanicistica nei modelli di lesione della sostanza bianca.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità attraverso coordinate standardizzate, parametri di iniezione e protocolli di dissezione del tessuto.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione dello sviluppo consentendo una valutazione precoce dell'interazione con l'obiettivo nelle vie di degenerazione assonale.
- Impatto sul portafoglio: Informa la priorizzazione corretta rispetto al rischio modellando un sottotipo di ictus altamente diffuso ma poco studiato, associato al rischio di demenza.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in chirurgia stereotassica e neuroanatomia murina per un corretto targeting della sostanza bianca.
- È dipendente da sistemi di iniezione a pressione calibrati e strumenti microchirurgici sterili per un'induzione costante delle lesioni.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per le procedure di colorazione istologica e di imaging, al fine di garantire riproducibilità in più sedi.
- Comporta la necessità di adattamenti quando si applica il modello su diversi background genetici murini o in presenza di condizioni comorbide.
- I limiti pratici includono le piccole dimensioni della zona bersaglio, che richiedono aggiustamenti delle coordinate specifici per ceppo, e cure postoperatorie meticolose per assicurare la sopravvivenza.
