Name: Un Free Cell Assay per studiare cromatina decondensazione alla fine del mitosi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 4 s
Description: Scopri un saggio cell-free per studiare la decondensazione della cromatina mitotica utilizzando estratti di uova di Xenopus laevis e cromatina di HeLa. Questo metodo consente di analizzare i meccanismi molecolari alla fine della mitosi.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione tedesca per la ricerca e l&#39;ERC (AN377 / 3-2 e 309.528 CHROMDECON a WA) e un PhD Fellowship della Boehringer Ingelheim Fonds a AKS Figura 1 e 2 sono ristampati da Developmental Cell 31 (3), Magalska , RuvB-come la funzione ATPasi nella cromatina decondensazione alla fine della mitosi, 305-318, 2014 et al., gentile concessione di Elsevier.

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<li>de la Barre, A. E., Robert-Nicoud, M., Dimitrov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+mitotic+chromosomes+in+Xenopus+egg+extract%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Assembly of mitotic chromosomes in Xenopus egg extract.</a> Methods Mol Biol. 119, 219-229 (1999).</li>
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<li>Galy, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+gp210+in+mitotic+nuclear-envelope+breakdown%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">A role for gp210 in mitotic nuclear-envelope breakdown.</a> J Cell Sci. 121, 317-328 (2008).</li>
<li>Chan, R. C., Forbes, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+study+of+nuclear+assembly+and+nuclear+import+using+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro study of nuclear assembly and nuclear import using Xenopus egg extracts.</a> Methods Mol Biol. 322, 289-300 (2006).</li>
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<li>Lavoie, B. D., Tuffo, K. M., Oh, S., Koshland, D., Holm, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+chromosome+condensation+requires+Brn1p%2C+the+yeast+homologue+of+Barren%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitotic chromosome condensation requires Brn1p, the yeast homologue of Barren.</a> Mol Biol Cell. 11, 1293-1304 (2000).</li>
<li>Philpott, A., Leno, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleoplasmin+remodels+sperm+chromatin+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Nucleoplasmin remodels sperm chromatin in Xenopus egg extracts.</a> Cell. 69, 759-767 (1992).</li>
<li>Philpott, A., Leno, G. H., Laskey, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+decondensation+in+Xenopus+egg+cytoplasm+is+mediated+by+nucleoplasmin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sperm decondensation in Xenopus egg cytoplasm is mediated by nucleoplasmin.</a> Cell. 65, 569-578 (1991).</li>
<li>Burglin, T. R., Mattaj, I. W., Newmeyer, D. D., Zeller, R., De Robertis, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+nucleoplasmin+from+Xenopus+laevis+oocytes+and+analysis+of+its+developmental+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Cloning of nucleoplasmin from Xenopus laevis oocytes and analysis of its developmental expression.</a> Genes Dev. 1, 97-107 (1987).</li>
<li>Whitaker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+at+fertilization+and+in+early+development%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+reviews%22%5BJournal%5D)">Calcium at fertilization and in early development.</a> Physiological reviews. 86, 25-88 (2006).</li>
<li>Gasser, S. M., Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+methods+for+the+isolation+of+individual+and+clustered+mitotic+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Improved methods for the isolation of individual and clustered mitotic chromosomes.</a> Exp Cell Res. 173, 85-98 (1987).</li>
<li>Eisenhardt, N., Schooley, A., Antonin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+in+vitro+assays+to+analyze+the+function+of+transmembrane+nucleoporins+and+targeting+of+inner+nuclear+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Xenopus in vitro assays to analyze the function of transmembrane nucleoporins and targeting of inner nuclear membrane proteins.</a> Methods Cell Biol. 122, 193-218 (2014).</li>
<li>Wignall, S. M., Deehan, R., Maresca, T. J., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+condensin+complex+is+required+for+proper+spindle+assembly+and+chromosome+segregation+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The condensin complex is required for proper spindle assembly and chromosome segregation in Xenopus egg extracts.</a> J Cell Biol. 161, 1041-1051 (2003).</li>
<li>Forbes, D. J., Kirschner, M. W., Newport, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+formation+of+nucleus-like+structures+around+bacteriophage+DNA+microinjected+into+Xenopus+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Spontaneous formation of nucleus-like structures around bacteriophage DNA microinjected into Xenopus eggs.</a> Cell. 34, 13-23 (1983).</li>
<li>Hartl, P., Olson, E., Dang, T., Forbes, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+assembly+with+lambda+DNA+in+fractionated+Xenopus+egg+extracts%3A+an+unexpected+role+for+glycogen+in+formation+of+a+higher+order+chromatin+intermediate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nuclear assembly with lambda DNA in fractionated Xenopus egg extracts: an unexpected role for glycogen in formation of a higher order chromatin intermediate.</a> J Cell Biol. 124, 235-248 (1994).</li>
<li>Sandaltzopoulos, R., Blank, T., Becker, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+repression+by+nucleosomes+but+not+H1+in+reconstituted+preblastoderm+Drosophila+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Transcriptional repression by nucleosomes but not H1 in reconstituted preblastoderm Drosophila chromatin.</a> EMBO J. 13, 373-379 (1994).</li>
<li>Ulbert, S., Platani, M., Boue, S., Mattaj, I. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+membrane+protein-DNA+interactions+required+early+in+nuclear+envelope+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct membrane protein-DNA interactions required early in nuclear envelope assembly.</a> J Cell Biol. 173, 469-476 (2006).</li>
<li>Zhang, C., Clarke, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin-independent+nuclear+envelope+assembly+induced+by+Ran+GTPase+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chromatin-independent nuclear envelope assembly induced by Ran GTPase in Xenopus egg extracts.</a> Science. 288, 1429-1432 (2000).</li>
<li>Paulson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+chromosome+clusters+from+metaphase-arrested+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Isolation of chromosome clusters from metaphase-arrested HeLa cells.</a> Chromosoma. 85, 571-581 (1982).</li>
<li>Ramadan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdc48%2Fp97+promotes+reformation+of+the+nucleus+by+extracting+the+kinase+Aurora+B+from+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cdc48/p97 promotes reformation of the nucleus by extracting the kinase Aurora B from chromatin.</a> Nature. 450, 1258-1262 (2007).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Xenopus laevis estratti a base di uova sono uno strumento molto utile per riprodurre fedelmente i processi cellulari in vitro, e questo sistema è stato utilizzato con successo nella caratterizzazione degli eventi del ciclo cellulare e la divisione cellulare 2, 3,5,6,17. A causa di grandi negozi di componenti nucleari sequestrati nell&#39;uovo durante oogenesi, estratti a base di uova sono una fonte eccellente di componenti cellulari. Rispetto ad altri approcci come RNAi su linee c...

Xenopus laevis estratto uovo è uno strumento potente e ampiamente applicato per studiare eventi cellulari complicati nella semplicità di un test cell-free. Fin dalla loro prima descrizione da Lohka &amp; Masui 1 che sono stati ampiamente utilizzati per studiare i processi mitotici quali la condensazione della cromatina 2, del fuso 3, rottura membrana nucleare 4, ma anche il trasporto nucleocytoplasmic 5 o 6 replicazione del DNA. Gli eventi che si svolgono al termine della mitosi, necessari per la riforma del nucleo interfasico quali riforma membrana nucleare e poro nucleare complesso rimontaggio sono molto meno inteso rispetto ai primi eventi mitotico ma possono essere studiati in modo simile utilizzando Xenopus estratto uovo 7. Abbiamo recentemente stabilito un saggio basato su estratto uovo Xenopus per studiare cromatina decondensazione alla fine della mitosi 8, un processo sotto-indagato che attende its caratterizzazione dettagliata. In metazoi, cromatina è altamente condensato all&#39;entrata mitotica per eseguire fedelmente la segregazione del materiale genetico. Per garantire che la cromatina è accessibile per l&#39;espressione genica e la replicazione del DNA durante interfase, deve essere de-compattato alla fine della mitosi. Nei vertebrati, cromatina è fino a cinquanta volte più compatta durante la mitosi rispetto interfase 9, in contrasto con lieviti dove la compattazione mitotico è generalmente molto inferiore, ad esempio, solo due volte nella S. cerevisiae 10. Vertebrato cromatina decondensazione è stata per lo più studiata nel contesto della riorganizzazione del DNA spermatico dopo la fecondazione delle uova. Un meccanismo molecolare, in cui nucleoplasmin, una proteina ovocita abbondante, scambia protamine specifici sperma di istoni H2A e H2B memorizzati nel uovo. Questo processo è stato anche chiarito utilizzando Xenopus estratto uovo 11, 12. Tuttavia, l&#39;espressionedi nucleoplasmin è limitata a ovociti 13 e cromatina mitotico non contiene queste protamine specifici sperma. Pertanto cromatina decondensazione alla fine della mitosi è nucleoplasmin indipendente 8. Per la reazione decondensazione in vitro impieghiamo estratto generato da attivi X. laevis uova e cluster cromatina isolate da cellule HeLa sincronizzate. Il trattamento di uova con un ionoforo del calcio imita il rilascio del calcio nel citoplasma dell&#39;ovocita generato da ingresso dello spermatozoo durante la fecondazione. L&#39;onda di calcio innesca la ripresa del ciclo cellulare e l&#39;uovo, arrestato nella seconda metafase della meiosi, progredisce alla prima interfase 14. Pertanto, gli estratti di uova preparati forma attivata uova rappresentano lo stato uscita / interfase mitosi e sono competenti per indurre eventi specifici per l&#39;uscita mitosi come cromatina decondensazione, membrana nucleare e poro riforma complessa. Per l&#39;isolamento di ch mitoticaromatin cluster abbiamo usato una versione leggermente modificata del protocollo pubblicato da Gasser &amp; Laemmli 15, dove i cluster cromosomiche sono rilasciate dai lisi da cellule HeLa sincronizzate in mitosi e isolati in poliammine contenenti buffer da centrifugazioni gradiente.

<table><tbody><tr><td>tetracloridrato di spermina</td><td>Fluka analitico</td><td>85610-25G</td><td></td></tr><tr><td>tricloridrato di spermidina</td><td>Sigma</td><td>S2501-5G</td><td></td></tr><tr><td>digitonina ad alta purezza</td><td>Millipore</td><td>300410-1GM</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td> tossico <td>Applichem</td><td>A0999,0100</td> timidina <td>tossica</td></tr><tr><td></td><td>Calbiochem</td><td>6060</td><td></td></tr><tr><td>nocodazolo</td><td>Calbiochem</td><td>487928</td><td>soluzione tossica</td></tr><tr><td>di formaldeide al 37%</td><td>Roth</td><td>7398-1</td> soluzione <td>tossica</td></tr><tr><td>di trypan blue (0,4% )</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td>tossico</td></tr><tr><td>1,4-ditiotreitolo (DTT)</td><td>Roth</td><td>6908.2</td><td></td></tr><tr><td>AEBSF cloridrato</td><td>Applichem</td><td>A1421,0001</td><td></td></tr><tr><td>pepstatina</td><td>Roth</td><td>2936.1/2/3</td><td></td></tr><tr><td>leupeptin</td><td>Roth</td><td>CN334</td><td></td></tr><tr><td>aprotinina</td><td>Roth</td><td>A162.3</td><td></td></tr><tr><td>Percoll (particelle di silice colloidale GE</td> <td>Healthcare</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>glutammina</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Flaconi per colture tissutali da 75 cm&sup2;</td><td>Greiner Bio-one</td><td>658175</td><td></td></tr><tr><td>siero fetale bovino inattivato termicamente (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10500-064</td><td></td></tr><tr><td>Omogeneizzatore (40 ml macinatore di tessuti)</td><td>Wheaton</td><td>357546</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer camera</td><td>Assistent</td><td>441/1</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Oak Ridge Provette per centrifuga, policarbonato (50 ml)</td><td>Nalgene</td><td>3118-0050</td><td></td></tr><tr><td>100 &micro; filtro per cellule m, nylon</td><td>BD Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>citocalasina B</td><td>Applichem</td><td>A7657,0010</td><td></td></tr><tr><td>cicloesimide tossica</td><td>Roth</td><td>8682.3</td><td></td></tr><tr><td>L-cisteina tossica</td><td>Merck</td><td>1,028,381,000</td><td></td></tr><tr><td>hCG disponibile come Ovogest</td><td>MSD</td><td>1431593</td><td></td></tr><tr><td>PMSG disponibile come Intergonan</td><td>MSD</td><td>1431015</td><td></td></tr><tr><td>A23187 (misto calcio-magnesio-sale)</td><td>Enzo</td><td>ALX-450-002-M010</td><td></td></tr><tr><td>aghi per siringhe tossiche (1,20 x 40 mm, 18 G x 1 1/2")</td><td>Braun</td><td>4665120</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Serva</td><td>10920.03</td><td></td></tr><tr><td>GTP, 2 Na x 3 H20</td><td>Roth</td><td>K056.1/2/3/4</td><td></td></tr><tr><td>creatina fosfato sale disodico</td><td>Calbiochem</td><td>2380</td><td></td></tr><tr><td>creatina fosfochinasi</td><td>Sigma</td><td>C3755-35KU</td><td></td></tr><tr><td>DMAP</td><td>Sigma</td><td>D2629-1G</td><td></td></tr><tr><td>DAPI&nbsp;</td><td>Roche</td><td>10236276001</td><td></td></tr><tr><td>Provette</td> per centrifugazione <td>tossiche</td><td>PFA Sigma</td><td>P-6148</td></tr><tr><td>per TLA 100 (7 x 10 mm, 5/16 x 13/16 pollici)</td><td>Beckman Coulter</td><td>343775</td><td></td></tr><tr><td>"Cell-Saver" (punte con ampia apertura, 1.000 &; l)</td><td>Biozym</td><td>729065</td><td></td></tr><tr><td>soluzione di glutaraldeide al 50%, grado I</td><td>Sigma alderich</td><td>G7651-10 ml</td> soluzione <td>tossica</td></tr><tr><td>di poli-L-lisina allo 0,1% (p/v)</td><td>Sigma</td><td>P8920-100 ml</td><td></td></tr><tr><td>provette a fondo piatto (6 ml, 16,0/55 mm)</td><td>Greiner Bio-one</td><td>145211</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield supporto di montaggio</td><td>Vector laboratories</td><td>H1000</td><td></td></tr><tr><td>tubi per TLA120 (11 x 34 mm, 7/16 x 1 3/8 pollici)</td><td>Beckman Coulter</td><td>343778</td><td></td></tr><tr><td>"Cell-Saver" (punte con ampia apertura, 200 &; micro; l)</td><td>Biozym</td><td>729055</td><td></td></tr><tr><td>vetrini coprioggetti da 12 mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>0784 #1</td><td></td></tr></tbody></table>

un free cell assay per studiare cromatina decondensazione alla fine del mitosi

A Cell Free Assay to Study Chromatin Decondensation at the End of Mitosis

Durante il ciclo cellulare dei vertebrati, la cromatina subisce ampi cambiamenti strutturali e funzionali. All'ingresso mitotico, si condensa massicciamente in cromosomi a forma di bastoncino che vengono mossi individualmente dall'apparato del fuso mitotico. La condensazione mitotica della cromatina produce cromosomi compattati cinquanta volte più densi come nell'interfase. Durante l'uscita dalla mitosi, i cromosomi devono ristabilire il loro stato di interfase funzionale, che è racchiuso da un involucro nucleare ed è competente per la replicazione e la trascrizione. Il processo di decondensazione è morfologicamente ben descritto, ma in termini molecolari poco compreso: ci manca la conoscenza degli eventi molecolari sottostanti e, in larga misura, dei fattori coinvolti e della loro regolazione. Descriviamo qui un sistema cell-free che ricapitola fedelmente la decondensazione della cromatina in vitro, basato su cluster mitotici di cromatina purificati da cellule HeLa sincronizzate e dall'estratto di uova di X. laevis. Il nostro sistema cell-free fornisce uno strumento importante per un'ulteriore caratterizzazione molecolare della decondensazione della cromatina e la sua coordinazione con i processi che si verificano simultaneamente durante l'uscita mitotica, come l'involucro nucleare e il riassemblaggio del complesso dei pori.

Ora la dipendenza della reazione decondensazione La figura 1 mostra un tipico andamento temporale del dosaggio decondensazione. Il cluster di cromosomi visibili all&#39;inizio della reazione decondenses e si fonde in un unico, rotondo e liscio nucleo. Quando l&#39;estratto uovo è sostituito dal saccarosio tampone cluster cromosoma rimane condensata, che suggeriscono che l&#39;attività decondensazione è presente nell&#39;estratto uovo. Decondensaz...

I meccanismi molecolari della decondensazione della cromatina mitotica altamente compattata sono mal definiti. Presentiamo un test cell-free basato su cluster di cromatina mitotica isolati da cellule HeLa ed estratto di uova di Xenopus laevis che ricostituisce fedelmente il processo di decondensazione in vitro.

Un Free Cell Assay per studiare cromatina decondensazione alla fine del mitosi

During the vertebrate cell cycle chromatin undergoes extensive structural and functional changes. Upon mitotic entry, it massively condenses into rod ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è ricostruire fedelmente la decondensazione della cromatina così come avviene alla fine della mitosi, nella semplicità di un saggio in assenza di cellule. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della ricerca sulla mitosi, poiché permette la caratterizzazione del meccanismo molecolare della cromatina, della decondensazione e l'identificazione dei fattori coinvolti nella regolazione. Il principale vantaggio di questa tecnica è che può essere facilmente manipolata dal punto di vista biochimico e consente lo studio della cromatina.La decolonizzazione può essere studiata in isolamento, separata da altri eventi del ciclo cellulare. Per iniziare, isolare i cluster di cromatina mitotica da cellule helo e preparare i tamponi per la preparazione dell'estratto di uovo di xenopus lavis IIC come descritto nel protocollo testuale allegato. Una volta preparato, utilizzare una siringa da cinque millilitri dotata di un ago da 27 gauge per iniettare 500 unità internazionali di gonadotropina corionica umana in rane in cui è stata indotta l'ovulazione.Iniettare le rane sotto la pelle del sacco linfatico dorsale la sera precedente l'esperimento per indurre il rilascio delle uova. Una volta indotte, mantenere le rane a 18 gradi Celsius per 13-17 ore in vaschette individuali contenenti 1,2 litri di soluzione tampone di Ringer modificata di Mark. Dopo che le rane hanno deposto le uova, rimuovere le uova già attivate insieme a quelle di aspetto scadente. Raccoglierle versando il contenuto delle vaschette in becher di vetro da 600 a 1000 millilitri in modo corretto.La selezione delle uova è fondamentale poiché la qualità complessiva dipende da questo passaggio. Rimuovere le uova attivate, filamentose o comunque di aspetto scadente. Continuare a rimuovere le uova difettose anche nei passaggi successivi.Decantare il soprannatante S una volta che le uova si sono depositate, quindi riempire nuovamente il becher con tampone fresco. Ripetere questo processo quattro volte per lavare le uova dopo l'ultimo lavaggio. Rimuovere il soprannatante un'ultima volta, quindi riempire il becher con una soluzione di cisteina al 2% per delineare le uova.Dopo due o quattro minuti, passare a un nuovo buffer contenente L-cisteina. Si considera completata la del gelificazione quando il volume delle uova diminuisce drasticamente e le uova diventano più compatte dopo circa cinque o sette minuti. Successivamente, lavare con attenzione le uova nel buffer di Ringer modificato di Mark, decantando e ricaricando il buffer inclinando il becher in modo che il liquido scorra lungo la parete invece di versarlo direttamente sulle uova.Quindi attivare le uova in 100 millilitri di soluzione fisiologica di Ringer modificata di Marx contenente otto microlitri di due milligrammi per millilitro di ioni calcio. Fermare l'attivazione quando la contrazione del cappuccio animale diventa visibile.O dopo 10 minuti dal momento dell'attivazione, lavare attentamente le uova in soluzione salina fisiologica di Ringer modificata di Mark, rimuovendo il buffer per decantazione e ricaricando il buffer in posizione supina dopo l'ultimo lavaggio. Incubare le uova a temperatura ambiente per 20 minuti in soluzione salina fisiologica di Ringer modificata di Mark. Successivamente, preparare delle provette da centrifuga da cinque millilitri con 50 microlitri di buffer di saccarosio e 50 microlitri di inibitore di proteasi 100 volte concentrato.Mescolare cinque microlitri di DTT uno molare, 12,5 microlitri di ciclo eide e 2,5 microlitri di cito. B. Lavare le uova due volte con tampone di saccarosio freddo, quindi trasferirle nei tubi da centrifuga. Utilizzando una pipetta Pasteur di plastica con apertura larga, compattare le uova centrifugando i tubi per un minuto a 130 G. Dopo la centrifugazione, rimuovere il tampone in eccesso con una pipetta Pasteur di plastica e riempire lo spazio aggiuntivo con ulteriori uova.Quindi centrifugare i tubi riempiti con uova in un rotore a cestello da sei per cinque millilitri per 20 minuti a quattro gradi Celsius e 21.000 ×g. Con la soluzione ora separata in tre strati, inserire una siringa da cinque millilitri con ago da 16 gauge lateralmente nel tubo fino allo strato intermedio, compreso tra il tuorlo giallo superiore e appena al di sopra dei detriti scuri di uovo rotto sul fondo. Trasferire l'estratto bifasico a bassa velocità in un tubo fresco posto sul ghiaccio, quindi aggiungere 10 microlitri di un inibitore delle proteasi diluito 100 volte.Mescolare un microlitro di DTT uno molare, 2,5 microlitri di cicloeide a 20 milligrammi per millilitro e 0,5 microlitri di citocalasina B. Aggiungere 10 milligrammi per millilitro per ogni millilitro dell'estratto a bassa velocità. Centrifugare l'estratto fasico a bassa velocità per 12 minuti a 355.000 ×g in un rotore da 10 × 2 millilitri. Rimuovere quindi delicatamente lo strato lipidico superficiale e trasferire il soprannatante contenente l'estratto ad alta velocità in un tubo fresco.Questo passaggio è fondamentale per ottenere un campione di alta qualità. Prestare attenzione affinché il liquido rimosso non contenga contaminazioni dallo strato lipidico superiore o dal fastidioso strato inferiore. Pipettare 18 microlitri dell'estratto ad alta velocità in un tubo da reazione da 1,5 millilitri, quindi aggiungere 0,5 microlitri di glicogeno e 0,5 microlitri della miscela energetica.Punto tre, microlitri di sei dimetil purina e 0,7 microlitri degli aggregati mitotici. Utilizzare punte con apertura larga per mescolare la reazione non appena il cromatina viene aggiunto, al fine di prevenire la rottura del cromatina in fase di decompensazione. Dopo il mescolamento, incubare la miscela di reazione fino a due ore a 20 gradi Celsius.Quindi fissare il campione aggiungendo 0,5 millilitri di fissativo freddo contenente 4% di paraformaldeide, 0,5% di glutaraldeide e 0,1 milligrammo per millilitro di DPI. Utilizzando punte con un'apertura larga, incubare il campione sul ghiaccio per 20-30 minuti. Successivamente, ricoprire coprioggetti rotondi da 12 millimetri con una soluzione di poli-L-lisina allo 0,1% peso su volume e incubare i coprioggetti per cinque minuti per aumentarne l'affinità.Per il cromatina, asciugare le lamelle su carta da filtro successivamente. Una volta asciutte, aggiungere le lamelle rivestite alla base di provette da centrifugazione a fondo piatto da sei millilitri in modo che il lato rivestito sia rivolto verso l'alto. Quindi aggiungere 800 microlitri del cuscinetto di saccarosio al 30% e stratificare l'intero campione fissato sulla parte superiore.Centrifugare il campione per 15 minuti a quattro gradi Celsius e a 2.500 ×g. Quindi asportare il soprannatante S e rimuovere i vetrini coprioggetto dai tubi pungendo delicatamente il fondo del tubo da centrifuga con un ago da 16 gauge. Quando il vetrino coprioggetto viene sollevato da un lato dall'ago, utilizzare pinzette per rimuoverlo, lavarlo rapidamente immergendolo in acqua deionizzata e quindi asciugarlo delicatamente toccandone il lato con carta da filtro. Successivamente, posizionare una goccia di mezzo di montaggio su un vetrino da microscopia e abbassare il lato del campione del vetrino coprioggetto.Posizionare il vetrino sul mezzo di montaggio. Asciugare delicatamente il coprioggetto con un fazzoletto di carta e sigillare i bordi del coprioggetto con smalto per unghie; conservare il vetrino al buio fino al momento dell'acquisizione delle immagini. Di seguito è riportato il corso temporale tipico del saggio di decompensazione.L'ammasso di cromosomi visibile all'inizio della reazione, decon, si condensa e si fonde in un singolo nucleo rotondo e liscio. Quando l'estratto uovo viene sostituito con un buffer di saccarosio, l'ammasso di cromosomi rimane condensato, il che suggerisce che l'attività di decompensazione è presente nell'estratto uovo. Nell'esperimento qui mostrato, analoghi di A TP o GTP non idrolizzati sono stati aggiunti alla reazione.Entrambi questi additivi inibiscono la decondensazione, dimostrando che questo processo attivo dipende dall'idrolisi di ATP e GTP. Una volta acquisita padronanza, questa tecnica può essere eseguita in circa due ore per la preparazione dell'estratto di uova a livello di Singapore e in tre ore per il saggio di promozione della decolonizzazione. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che il successo dipende criticamente dalla qualità dell'estratto.Soprattutto per le immunodeplezioni, si raccomanda di utilizzare un estratto appena preparato seguendo questa procedura. Altri metodi, come le immunodeplezioni e l'aggiunta di proteine ricombinanti, possono essere eseguiti per rispondere ad ulteriori domande, ad esempio su quali fattori siano coinvolti. Questa tecnica aprirà la strada ai ricercatori nei settori della mitosi o della struttura e funzione nucleare per esplorare la decondensazione della cromatina così come avviene alla fine della mitosi nelle cellule animali.Dopo aver guardato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare estratti di uova di fegato di Xenopus e di come applicare il metodo per ricostruire la decolonizzazione della cromatina. Non dimenticare che lavorare con Paraformaldeide, Formaldeide e DARPA può essere pericoloso, e si devono prendere precauzioni, come indossare guanti.

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