Name: Porphyromonas gingivalis come organismo modello per la Valutazione Interazione di batteri anaerobici con cellule ospiti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 16 s
Description: Scopri i protocolli per valutare l'interazione di batteri anaerobici con cellule ospiti utilizzando Porphyromonas gingivalis. Questi metodi permettono di misurare l'invasione batterica e la sopravvivenza intracellulare in condizioni che riflettono l'ambiente in vivo.

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Vorremmo ringraziare il Dr. Hiroshi Miyazaki, il Dr. Scott Henderson, il Dr. Todd Kitten, il Dr. Justin Hutcherson, la Dr. Catherine Jauregui e Collin R. Berry. Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni NIH NIDCR R01DE016124, R01DE018039 e R01DE023304 a J.P. Lewis.
La microscopia è stata eseguita presso il Dipartimento di Anatomia e Microscopia di Neurobiologia della VCU, supportata, in parte, con finanziamenti dal NIH-NINDS Center core grant (5P30NS047463).

I seguenti protocolli descrivono i metodi per la coltura e lo studio l&#39;invasione da parte della specie anaerobiche, P. gingivalis; Tuttavia, possono essere utilizzati tali protocolli per un certo numero di agenti patogeni anaerobici. Anche se vengono utilizzati HUVECs, questo protocollo può essere utilizzato per altre cellule eucariotiche sia immunitarie e non immuni. 1. anaerobica Camera uso e manutenzione Nota: P. gingivalis è un anaerobio sensibile ai normali livelli di ossigeno riscontrati nell&#39;aria ambiente. Un ambiente anaerobico controllato è di vitale importanza per la coltivazione del P. gingivalis. <ol><li> Qui, mantenere un&#39;atmosfera artificiale designato come gas anaerobico misto (80% N 2, 10% H 2, 10% CO 2) in una camera di vinile anaerobica (Figura 1A). Utilizzare una camera di compensazione (Figura 1B) per trasferire oggetti dall&#39;ambiente di laboratorio alla camera anaerobica. La camera di compensazione opera manualmente, twspurgo ghiaccio con N 2 gas prima di introdurre il gas misto anaerobico. </li><li> Utilizzare una colonna di rimozione dell&#39;idrogeno solforato (Figura 1C) per la rimozione del solfuro di idrogeno indesiderabile senza manutenzione. Collocare un deumidificatore entro la camera per rimuovere H 2 O creato dal catalizzatore e per evitare aerosol che facilitano la diffusione della contaminazione. Nota: L&#39;idrogeno solforato è un sottoprodotto metabolico naturale di molti batteri anaerobici e l&#39;accumulo è tossica per i batteri e può provocare danni all&#39;elettronica e diminuire la durata di un catalizzatore. </li><li> Utilizzare una scatola ventilatore per far circolare l&#39;atmosfera della camera attraverso un catalizzatore di palladio, che rimuove l&#39;ossigeno in presenza di idrogeno (Figura 1D). Nota: Un atmosferico (HEPA) ricircolo rimuove i contaminanti presenti nell&#39;aria con una dimensione di 0,22 micron o più grandi. </li><li> Batteri anaerobici cultura a 37 ° C incubatore che si trova all&#39;interno del anaerobicacamera. Utilizzare tecniche asettiche standard, quando si lavora all&#39;interno della camera anaerobica. </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53408/53408fig1.jpg" /> Figura 1. camera anaerobica vinile e dei suoi componenti. (A) Una camera anaerobica vinile sigillato completamente dall&#39;ossigeno atmosferico fornisce spazio di lavoro per due persone alla volta (32 in x 78 in). Contiene un incubatore a 37 ° C (posteriore centrale). (B) una camera di compensazione è utilizzato per il trasferimento di articoli dalla ambiente di laboratorio alla camera anaerobica. Nell&#39;immagine è una camera di compensazione automatica gestito tramite un controller che può essere programmato per eseguire automaticamente le procedure di vuoto e spurgo necessarie per creare un ambiente anaerobico. (C) Un acido solfidrico Colonna rimozione fornisce rimozione elevata capacità esente da manutenzione di indesiderabile idrogeno solforato. (D) Due contenitori di fan catalizzatore sonoposto in tutta la camera anaerobica per favorire la circolazione dell&#39;atmosfera della camera attraverso il palladio catalizzatore, che, in presenza di idrogeno, rimuove l&#39;ossigeno. La camera di anaerobico è impostato secondo le istruzioni del produttore. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53408/53408fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> 2. Preparazione di batteri anaerobici Nota: P. gingivalis è aerotolleranti e può essere conservato in condizioni aerobiche, ma non crescerà in presenza di ossigeno a livelli superiori a 6% 17,18. Una camera anaerobica è necessario per il corretto coltivazione di P. gingivalis e altre specie anaerobiche (Figura 1). È necessaria una formazione adeguata e di educazione sull&#39;uso camera anaerobica prima di lavorare con microanaerobes 19. <ol><li> Equilibrare tutti i liquidi e le piastre a condiz anaerobicaioni per almeno 12 ore prima della sperimentazione per rimuovere l&#39;ossigeno residuo. </li><li> Trasferimento P. gingivalis da -80 ° C freezer alla camera anaerobica, lasciate disgelo. </li><li> Streak P. gingivalis su piastre di agar sangue soia Trypticase (TSA II con il 5% di sangue di montone). Wrap piastre in parafilm e conservare a 37 ° C in un incubatore anaerobico per 4-7 giorni. </li><li> Seminare P. gingivalis in 3 ml di Brain Heart Infusion (BHI) brodo integrate con emina e menadione, un arricchiti terreni liquidi non selettivi per l&#39;isolamento e la coltura di anaerobi e microrganismi esigenti, usando i loop sterili. Nota: Per la conservazione a lungo termine, mescolare colture batteriche preparate in BHI con glicerolo o DMSO (concentrazione finale 10-20%) e posto in una -80 ° C freezer. </li><li> Preparare una coltura starter di P. gingivalis facendo una diluizione 1:10 e permettendo ai batteri di crescere fino a metà fase di log. </li></ol> Nota: La densità ottica del bacsospensione riale è determinato e la concentrazione di batteri per ogni ceppo da esaminare viene regolata. Per P. gingivalis una sospensione a OD 660 di 0,7 corrisponde alla fase di mid-log e ~ 7 x 10 8 cellule / ml. Condizioni di crescita descritte nel protocollo di cui sopra sono specifici per P. gingivalis e potrebbero dover essere adattato per altri ceppi batterici. 3. Endothelial Cell Culture Nota: Acquisto pool HUVECs primarie e cultura a medio basale contenenti fattori di crescita endoteliale vascolare (VEGF) a 37 ° C in 5% di CO 2 in base alle istruzioni del produttore. <ol><li> HUVECs Seed in T-75 palloni a 2.5 x 10 5 cellule / fiasco in 15 ml mezzi VEGF. Nota: Controllare la redditività attraverso una diluizione 1: 1 con il 4,0% trypan blu. Le cellule con una membrana compromessa manterrà trypan blu, le cellule sane con membrana è ancora intatta appariranno bianco se visti al microscopio ottico binoculare. Count 100 cellule, in modo che oltre l&#39;80% delle cellule sono vitali 20. </li><li> Sostituire i media ogni 2 giorni con pre-riscaldato supporti VEGF fresco fino a cellule raggiungono ~ 80% di confluenza. </li><li> Lavare le cellule una volta con PBS preriscaldata. Liberate cellule dal matraccio T75 incubando con 2 ml di tripsina-EDTA (0,25%) per 5 min seguita da soluzione neutralizzante 2 ml di tripsina. </li><li> Raccogliere HUVECs sospesi in un tubo da 50 ml. Lavare le cellule in più dal T-75 palloni con PBS e trasferire 50 ml provette coniche. </li><li> Cellule centrifugare a 200 xg per 10 min. </li><li> Rimuovere il surnatante, sospendere pellet cellulare in 10 ml di media VEGF pre-riscaldato. </li><li> Determinare la concentrazione cellulare mediante un emocitometro o un dispositivo simile conteggio delle cellule. </li><li> Calcola quantità di sospensione cellulare per aggiungere a uno 6-pozzetti (400.000 / pozzetto) o 12-pozzetti con coprioggetto (50.000 / pozzetto). HUVECs sarà pronto per la sperimentazione del giorno successivo. </li></ol> 4. La sopravvivenza Assay Invasion / Interazione(Placcatura) Nota: Quando si esegue questo test, preparare due 6 pozzetti delle cellule endoteliali seminate a 400.000 cellule / pozzetto. Una piastra sarà utilizzato per valutare batteri attaccati da e interiorizzati da cellule ospiti. L&#39;altra piastra rappresenterà per i batteri intracellulari. La piastra da 6 pozzetti consente triplicato di due campioni da eseguire in un esperimento. Per una descrizione di questo protocollo fare riferimento al diagramma di flusso del test di sopravvivenza (Figura 2). <ol><li> Preparare batteri anaerobici come sopra descritto (vedi capitolo 1) fino a raggiungere una crescita mid-log (OD 660 0,5-0,7). </li><li> Batteri centrifugare a 5.000 g per 10 min. Nota: se centrifuga è al di fuori della camera anaerobica, trasportare i campioni batterici in un tubo ben chiuso da 15 ml, avvolgere il tappo con parafilm per evitare perdite di ossigeno. </li><li> Posizionare pellettato P. gingivalis indietro nella camera, scartare il surnatante. Lavare con PBS, batteri pellet di nuovo prima di risospendere in VEGF media. Preparare sospensioni per tutti i ceppi batterici da testare a OD 660 di 0,7 che corrisponde alla fase di mid-log (~ 7 x 10 8 cellule / ml). I batteri sono ora pronti per l&#39;infezione. </li><li> Trasferimento 6-pozzetti contenenti HUVECs dal tessuto cultura incubatore nella camera anaerobico. Rimuovere i supporti e lavare tre volte con PBS anaerobica. Aggiungere 2 ml di media VEGF anaerobica in ciascun pozzetto e posizionare le piastre a 37 ° C in incubatore anaerobico per 20 min per equilibrare la temperatura per l&#39;infezione. Nota: i batteri piastra su piastre di agar sangue per garantire quelli utilizzati per le infezioni sono omogenei e non contaminati dopo l&#39;infezione. </li><li> Infect cellule ospiti con batteri ad una molteplicità di infezione (MOI batteri: host) di 100: 1. Nota: numero di cellule HUVEC è determinato eseguendo un test di esclusione del trypan una singola ben prima dell&#39;infezione. Numero di cellule batteriche viene determinata mediante densità ottica (ad esempio, 0,5 OD = 5 x 10 8 cellule / ml). Bconcentrazione acterial viene regolato alla corretta MOI basato sulla concentrazione HUVECs 21. </li><li> Mettere 6 pozzetti con HUVECs infetti in incubatrice anaerobica e permettono ai batteri di interagire con le cellule ospiti per 30 min. </li><li> Preparare saponina in BHI (1,0% w / v) all&#39;interno della camera anaerobica e filtrata attraverso un filtro da 0,2 micron. </li><li> La sopravvivenza di entrambi i batteri attaccati e interiorizzato. <ol><li> Rimuovere le piastre dal termostato, i media aspirare, lavare tre volte con anaerobica PBS e aggiungere 2 ml di filtrati 1,0% saponina (preparato come descritto al punto 4.8). Incubare per 15 minuti per consentire la lisi della cellula ospite. </li><li> Raschiare fondo di ogni pozzetto con raschietto cellulare. Raccogliere la miscela di cellule da ciascun pozzetto e fare una diluizione 1: 1 in BHI. </li><li> Procedere per fare diluizioni seriali del campione. A seconda delle specie batteriche e concentrazione, regolare diluizioni seriali. Iniziare con 1: 100 o 1: 1.000 diluizioni. </li><li> Piatto 200 ml di diluizione desiderata su piastre di agar sangue. Wrap tegli piastre in parafilm e posto in incubatrice anaerobica a 37 ° C. </li><li> A seguito di sette giorni di incubazione a 37 ° C, rimuovere le piastre e contare unità formanti colonie (CFU) utilizzando una scatola luminosa di contare manualmente colonie. Nota: CFU vengono enumerati. Per grandi quantità di CFU, le immagini possono essere prese e software possono essere utilizzati per facilitare l&#39;enumerazione di CFU. </li></ol></li><li> La sopravvivenza dei batteri interiorizzato. <ol><li> Rimuovere le piastre dal termostato. Lavare tre volte con PBS e anaerobica aggiungere media 2 ml di VEGF con integrate antibiotici (300 mg / ml di gentamicina e 400 ug / ml di metronidazolo). </li><li> Incubare per 1 ora. Assicurati di testare gli antibiotici in modo che siano al 100% efficace nell&#39;uccidere il ceppo batterico desiderato e fare in modo che essi non penetrano le cellule ospiti 22,23. </li><li> Aspirare il terreno, aggiungere 2 ml di filtrato 1,0% saponina. Incubare per 15 minuti per consentire la lisi della cellula ospite. </li><li> Raschiare inferiore di ogni well con raschietto cellulare. Raccogliere la miscela di cellule da ciascun pozzetto e rendere diluizione 1: 1 in BHI. </li><li> Preparare diluizioni seriali del campione (1: 100, 1: 1000). </li><li> Piatto 200 ml di diluizione desiderata su piastre di agar sangue. Avvolgere piastre in parafilm e posto in incubatrice anaerobica. </li><li> Dopo sette giorni di incubazione a 37 ° C togliere piastre e contare CFU. </li></ol></li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53408/53408fig2.jpg" /> Figura 2. Rappresentazione schematica di un protocollo utilizzato per la sopravvivenza dei batteri anaerobici con cellule eucariotiche. Entrambi i test per una sopravvivenza batterica totale e la sopravvivenza di batteri internalizzati possono essere eseguite contemporaneamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53408/53408fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> 5. internalizzazione di batteri in Ce HostLLS (Fluorescent Microscopy) Nota: P. gingivalis è etichettato con 2 &#39;, 7&#39;-Bis- (2-carbossietil) -5- (e-6) -Carboxyfluorescein, acetossimetil Ester (BCECF-AM). BCECF-AM è un colorante membrana permeabile non fluorescente; la sua conversione a BCECF fluoresceina tramite l&#39;azione di esterasi intracellulari può indicare la vitalità cellulare. P. gingivalis è etichettato con il BCECF-AM colorante e poi utilizzato per infettare le cellule eucariotiche. A seguito di infezione, le cellule vengono fissate ed etichettati con DAPI e TRITC-falloidina. La macchia DAPI utilizzato per colorare il nucleo della cellula eucariotica anche etichettare nucleo della cellula batterica, che fornisce una contromisura per identificare i batteri non vitali che non possono metabolicamente fendere BCECF-AM. Cellule ospiti sono evidenziati con TRITC-falloidina, un actina colorante rosso. <ol><li> Coprioggetti Autoclave. Aggiungere asetticamente coprioggetti a piastre da 12 pozzetti prima della semina cellule endoteliali a 5 x 10 4 cellule / pozzetto. (Giorno preparati prima dell&#39;esperimento) </li><li&gt; hanno cellule endoteliali preparati su 18 mm (# 1.5) spessore coprioggetto circolari in piastre da 12 pozzetti come descritto sopra. </li><li> Preparare batteri anaerobici cresciuti a metà fase di log (OD 660 = 0,5-0,7), come descritto nella sezione 1. </li><li> Batteri Lavare 2x con PBS anaerobica per centrifugazione a 5.000 xg e sospende pellet in PBS a 5-7 x 10 8 cellule / ml. </li><li> Aggiungere 20 ml di 0,2 mM BCECF-AM a 2 ml di sospensione batterica (5-7 x 10 8 cellule / ml) ad una concentrazione finale di BCECF-AM di 2 mM. </li><li> Incubare a 37 ° C per 30 minuti al buio. </li><li> Piastre di trasferimento con le cellule endoteliali seminate su 18 mm (# 1.5 spessore) lamelle circolari dal coltura tissutale incubatore nella camera anaerobico. Lavare con PBS e scambio con i media VEGF anaerobica. Nota: Verificare che HUVECs sono sani al microscopio ottico. HUVECs dovrebbe essere ~ 80% confluenti, morfologia dovrebbe essere paragonabile ai produttori. </li><li> Centrifuga etichettato batteri a5.000 xg per 10 min per rimuovere residui di colorante BCECF-AM. Sospendere in 2 ml di mezzi VEGF anaerobica. </li><li> Infettare le cellule ospiti con batteri etichettati a MOI di 100: 1 (batteri: host). </li><li> Incubare in ambiente anaerobico a 37 ° C per 30 min. </li><li> Dopo che le cellule lavare infezione con PBS per tre volte e fissare in preparati al momento 4,0% paraformaldeide per 10 min. Nota: Dopo aver fissato le cellule, esperimento può essere condotto all&#39;esterno della camera anaerobica. </li><li> Lavare coprioggetto con PBS per tre volte. </li><li> Aggiungere 1 ml di 0,2% Triton X-100 per 10 min. </li><li> Lavare coprioggetto con PBS per tre volte. </li><li> Aggiungere 50 ml di TRITC falloidina (50 mg / ml) per vetrini per 45 min. </li><li> Lavare coprioggetto tre volte, togliere dal 12-pozzetti e posto su un vetrino con mezzo di montaggio morbido-set contenente DAPI. Sigillare i lati con smalto. Nota: vetrini possono essere conservati per un paio di mesi al buio. Evitare l&#39;esposizione alla luce per evitare che foto-sbiancamento. </li><li> Vista diapositiveutilizzando un microscopio confocale. <ol><li> Qui, utilizzare un sistema di 34 canali spettrali (rivelatore a serie di 32 canali e due rivelatori PMT lato, oltre a un rilevatore di luce trasmessa) configurato attorno ad un AxioObserver (invertito) stare con uno stadio XY motorizzato. Il sistema dispone di cinque laser: diodo blu (405 nm), multi-linea Argon (458, 488, 514 nm), LED verde (561 nm), rosso HeNe (633 nm) e un laser pulsato 440 nm. Dotare di un sistema di imaging a vita a fluorescenza con 2 rilevatori GaAsP ibridi (per FRET-FLIM). </li><li> Rileva la fluorescenza da DAPI e TRITC in un canale usando un filtro dual-band con lunghezze d&#39;onda di eccitazione di 340-380 nm e 540-560 nm, ed un filtro per le emissioni di 435-485 nm e 570-590 nm, rispettivamente. Rileva la fluorescenza da BCECF-AM utilizzando un filtro di eccitazione con lunghezza d&#39;onda di 440-500 nm e un filtro di emissione di 510-590 nm. Nota: Controlli per BCECF-AM dovrebbe essere fatto su ogni ceppo batterico in fase di studio per garantire la corretta etichettatura dei batteri vitali. In primo luogo verificare che nonviabbatteri LE sono DAPI-positivi e BCECF-negativi. In secondo luogo, in modo che batteri vivi possono metabolizzare BCECF-AM in fluoresceina BCECF. Concentrazioni variabili dei batteri o BCECF-AM dye possono avere bisogno di essere testati per l&#39;etichettatura ottimale. </li></ol></li></ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Tutti i metodi di cui sopra possono essere utilizzati per progettare saggi specifici per valutare l&#39;interazione di batteri anaerobici con cellule eucariotiche. Tuttavia, ci sono diverse considerazioni per eseguire con successo gli esperimenti. Innanzitutto sono i ceppi microbici essere utilizzati in uno studio. E &#39;fondamentale nel confronto di due ceppi sia con il saggio di sopravvivenza come anche per microscopia che sono in fase di crescita simili e raggiungono concentrazioni cellu...

Batteri anaerobici colonizzano quasi tutte le superfici del corpo umano. Sebbene predominante nella flora dei tratti intestinali e genito-urinario in cui le concentrazioni di ossigeno sono bassi, esistono anche ad alti livelli sulla pelle, bocca, naso e gola 1. I batteri anaerobici sono una causa comune di infezioni endogene e sono spesso isolati da siti malati. Tuttavia, a causa della loro natura esigente, anaerobi possono essere difficili da isolare e cultura. Gli studi che coinvolgono batteri anaerobi devono essere effettuate in condizioni ristrette. Tecniche anaerobico-cultura moderna permettono ai ricercatori di imitare le impostazioni anaerobici necessarie per studiare molti ceppi di laboratorio anaerobica o addirittura isolati clinici 2,3. Batteri anaerobi patogeni hanno sviluppato un rapporto dinamico e co-evoluzione con le cellule ospiti in cui risiedono. La maggior parte degli anaerobi sono suscettibili di aver ucciso dalla risposta immunitaria dell&#39;ospite prima di raggiungere infectii livelli di unità organizzative. Tuttavia, alcuni batteri patogeni hanno sviluppato meccanismi per sfuggire o sovvertire la risposta immunitaria dell&#39;ospite. Compiono questo obiettivo attraverso meccanismi quali l&#39;evasione del riconoscimento immunitario, la neutralizzazione dei mediatori immunitari, alterazione di immunità cellulo-mediata, l&#39;invasione delle cellule ospiti e l&#39;alterazione delle immunitario segnalazione 4. Porphyromonas gingivalis, un anaerobio gram-negativi implicati sia orale e malattie extraorali, è un esempio di un batterio patogeno altamente adattato in grado di provocare cambiamenti patogeni nell&#39;ospite 5-7. Sacche di biofilm placca accantonati in profonde fessure formatesi tra i denti e tessuto mucoso gengivale può ospitare batteri anaerobici che sono protetti dall&#39;ossigeno atmosferico 8. Queste tasche parodontali servono come una nicchia per vari patogeni anaerobici, come P. gingivalis 9. P. gingivalis è un patogeno chiave di volta che è in grado di rimodellareing comunità microbica orale in modo da promuovere lo sviluppo e la progressione delle malattie parodontali 10. Produce un gran numero di fattori di virulenza che sono attivi contro un ampio spettro di proteine ​​dell&#39;ospite e fornisce meccanismi per evasione di difese dell&#39;ospite 11. È anche in grado di invadere epiteliali, endoteliali, fibroblasti e cellule del legamento parodontale in vitro e in vivo 12-14 15. Con efficacemente invadere cellule ospiti, P. gingivalis può sfuggire immunità dell&#39;ospite. Invasione efficace delle cellule ospiti non solo permette al batterio di sfuggire difese dell&#39;ospite ma serve anche da serbatoio per il futuro reinfezione e altera la cellula ospite. Sono necessari studi sui meccanismi molecolari coinvolti nella adesione e internalizzazione del batterio da cellule ospiti. La ricerca in diversi laboratori è focalizzata sulla comprensione degli eventi molecolari associati con l&#39;internalizzazione di P. gingivalis da parte delle cellule ospitinonché i meccanismi utilizzati per sopprimere e dirottare la risposta immunitaria e sopravvivere i meccanismi di difesa dell&#39;ospite ostili. Ci sono molti saggi in grado di identificare e caratterizzare agenti patogeni che sono in grado di invadere cellule ospiti. Tuttavia, studi in vitro con patogeni anaerobici presentano molti problemi sperimentali per il ricercatore principalmente perché è difficile da eseguire studi che si basano su strumenti ingombranti in assenza di ossigeno. La situazione è aggravata dal fatto che le cellule eucariotiche hanno bisogno di ossigeno per crescere e quindi devono essere preparati separatamente in incubatori di coltura dei tessuti. Un modo per evitare tali ostacoli sarebbe quella di effettuare gli studi sotto ossigeno atmosferico, ma che avrebbe fatto la crescita di batteri anaerobi impossibile. Un altro metodo sarebbe quello di utilizzare i batteri ucciso al calore di infettare e studiare le interazioni ospite-cellulari. Tuttavia, esistono delle differenze tra batteri ucciso al calore e vitali che diminuiscono la pertinenza della dello s ospite-patogenosu 16. E &#39;centrale per studiare batteri vitali con l&#39;espressione inalterata l&#39;interazione con le cellule ospiti; quindi, i metodi per la coltura di P. gingivalis in un ambiente anaerobico sono dati. Inoltre, sono dimostrati due protocolli convenienti semplici per valutare la capacità di P. gingivalis da interiorizzato da vena cellule umane endoteliali (ombelicali HUVECs). Il primo protocollo si basa sul popolare protection assay antibiotico. Anche se il test è semplice, le considerazioni quando si utilizza microrganismi anaerobi sono dati. Il secondo protocollo richiede l&#39;uso di un microscopio a scansione a fluorescenza per visualizzare interagire e internalizzata P. gingivalis. Ogni test ha i suoi limiti e vantaggi che verranno discusse a rilasciare al ricercatore uno schema per studiare l&#39;invasività dei batteri anaerobici. Anche se il manoscritto corrente studia P. gingivalis e HUVEC, questi protocolli possono essere usati per molti altri batteri anaerobici ecome per altri tipi di cellule ospiti.

<table><tbody><tr><td>Camera anaerobica in vinile-Tipo B</td><td>Prodotti da laboratorio</td><td></td> timidi <td>Modello 2000 incubatore&nbsp;</td></tr><tr><td>TSA II Trypticase Ay Agar con il 5% di sangue di pecora</td><td>BBL</td><td>221261</td><td></td></tr><tr><td>Cellule endoteliali della vena ombelicale umana Pool</td><td>LifeLine Technology</td><td>FC-0044</td><td></td></tr><tr><td>VascuLife VEGF Medium Kit completo</td><td>LifeLine Technology</td><td>LL-0003</td><td></td></tr><tr><td>TrypKit</td><td>LifeLine</td><td>LL-0013</td><td></td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Riedel-de Haen</td><td>16109</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina solfato sale</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-1264</td><td></td></tr><tr><td>Metronidazolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-3761</td><td></td></tr><tr><td>BCECF-AM</td><td>LifeTechnologies</td><td>B1150</td><td></td></tr><tr><td>TRITC falloidina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1951</td><td></td></tr><tr><td>18 mm Vetrini coprioggetti circolari Microscopia</td><td>elettronica Sciences</td><td>72222-01</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo di montaggio VectaShield con DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr></tbody></table>

porphyromonas gingivalis come organismo modello per la valutazione interazione di batteri anaerobici con cellule ospiti

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

I batteri anaerobici lontano superano aerobi in molte nicchie umani, come l&#39;intestino, bocca e vagina. Inoltre, infezioni anaerobiche sono comuni e spesso di origine indigena. La capacità di alcuni agenti patogeni anaerobici di invadere le cellule umane dà loro misure di adattamento per sfuggire immunità innata nonché per modulare il comportamento della cellula ospite. Tuttavia, garantire che i batteri anaerobici sono vivo durante un&#39;indagine sperimentale degli eventi che può porre problemi. Porphyromonas gingivalis, un anaerobio Gram-negativi, è in grado di invadere una varietà di cellule non fagocitiche eucariotiche. In questo articolo viene descritto come con successo la cultura e valutare la capacità di P. gingivalis di invadere le cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC). Sono stati sviluppati due protocolli: uno per misurare batteri che possono con successo invadere e sopravvivere all&#39;interno dell&#39;ospite, e l&#39;altro per visualizzare i batteri interagiscono con le cellule ospiti. Queste tecniche richiedono l&#39;uso di un anaeRobic camera per la fornitura di P. gingivalis con un ambiente anaerobico per la crescita ottimale. Il primo protocollo si basa sulla misurazione di protezione antibiotico, che è ampiamente utilizzato per studiare l&#39;invasione delle cellule ospiti da batteri. Tuttavia, il saggio di protezione antibiotico è limitata; solo i batteri intracellulari che sono coltivabili a seguito di trattamento antibiotico e lisi della cellula ospite sono misurati. Per valutare tutti i batteri interagiscono con le cellule ospiti, sia vivi e morti, abbiamo sviluppato un protocollo che utilizza il microscopio a fluorescenza per esaminare l&#39;interazione ospite-patogeno. I batteri sono fluorescente con 2 &#39;, 7&#39;-Bis- (2-carbossietil) -5- (e-6) -carboxyfluorescein acetossimetil estere (BCECF-AM) e utilizzato per infettare cellule eucariotiche in condizioni anaerobiche. Dopo fissazione con paraformaldeide e permeabilizzazione con 0,2% Triton X-100, cellule ospiti sono etichettati con TRITC falloidina e DAPI etichettare citoscheletro cellulare e nucleo, rispettivamente. Molteplici images prelevati in differenti punti focali (Z-stack) sono ottenuti per la visualizzazione spazio-temporale dei batteri. I metodi utilizzati in questo studio possono essere applicati a qualsiasi anaerobio coltivabili e qualsiasi tipo di cellula eucariotica.

Protocolli di cui sopra sono stati utilizzati nello studio interazione ospite-patogeno tra P. gingivalis e cellule endoteliali. P. gingivalis W83 e un P. gingivalis V3150 portando una delezione di PG0228 stati utilizzati nello studio. Il PG0228 è previsto per codificare una proteina che può alterare i livelli di RNA e proteine, che possono incidere in definitiva interazione di P. gingivalis con cellule ospiti. Per studiare l&#39;effetto di PG0228 su P. capacità di interagire ...

Questo articolo presenta due protocolli: uno per misurare i batteri anaerobi che possono invadere e sopravvivere con successo all'interno dell'ospite, e l'altro per visualizzare i batteri anaerobici che interagiscono con le cellule ospiti. Questo studio può essere applicato a qualsiasi anaerobo coltivabile e a qualsiasi tipo di cellula eucariotica.

Porphyromonas gingivalis come organismo modello per la Valutazione Interazione di batteri anaerobici con cellule ospiti

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

L'obiettivo generale di questo video è dimostrare protocolli per valutare l'interazione tra batteri anaerobi e cellule dell'ospite. Le condizioni utilizzate per coltivare le cellule ospiti sono tossiche per i batteri anaerobi e viceversa. Ciò rappresenta una sfida nello studio delle loro interazioni, ed è necessario raggiungere condizioni ottimali per entrambi affinché rimangano metabolicamente attivi durante il periodo di studio.Queste condizioni rifletteranno in modo più accurato lo scenario dell'interazione tra ospite e patogeno riscontrato in vivo. Il metodo qui presentato contribuirà a rispondere a domande riguardanti i meccanismi coinvolti nella sopravvivenza microbica, nonché nel legame e nell'internalizzazione di cellule batteriche anaerobie durante l'infezione. In generale, le persone alle prime esperienze con questo metodo potrebbero incontrare difficoltà, poiché il lavoro con batteri anaerobi richiede conoscenze relative all'uso della camera anaerobica e buone tecniche asettiche.La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché i passaggi che prevedono l'utilizzo di una camera anaerobica sono difficili da apprendere. Inoltre, è necessario prestare attenzione quando si effettuano esperimenti con camere anaerobiche per la coltura e lo studio di *Porphyromonas gingivalis*. Una camera anaerobica in vinile viene mantenuta con un'atmosfera artificiale contenente 80% di azoto, 10% di idrogeno e 10% di anidride carbonica. Collocare all'interno della camera anaerobica 30 piastre di agar sangue, 500 millilitri di PBS e 30 millilitri di mezzo di fattore di crescita dell'endotelio vascolare o VEGF.24 ore in anticipo per equilibrare i reagenti, seminare quattro volte 10 alla cinque cellule endoteliali venose umbelicali umane o VE per pozzetto in piastre a sei pozzetti con mezzo VEGF e lasciarle nell'incubatrice per colture cellulari tutta la notte per consentire l'adesione. Preparare colture di Porphyromonas gingivalis in mezzo brain heart infusion, o BHI, come descritto nel testo allegato, e lasciare che le colture raggiungano la fase logaritmica, quando la densità ottica della coltura a 660 nanometri varia tra 0,5 e 0,7. Trasferire i batteri in un tubo da 15 millilitri e avvolgere un pezzo di parafilm intorno al coperchio per prevenire la chiusura aerobica.Quindi centrifugare i batteri a 5.000 ×g per 10 minuti all'interno della camera anaerobica. Lavare i batteri sedimentati con PBS anaerobico e centrifugare nuovamente a 5.000 ×g per 10 minuti. Reese ha i batteri nel mezzo VEGF per infettare l'HU X con trasferimento poro-ominoso.Prelevare le piastre a sei pozzetti dall'incubatrice e trasferirle nella camera anaerobica, aspirare il mezzo dai pozzetti di prova e lavare tre volte con PBS anaerobico. Determinare il numero di cellule da un pozzetto rappresentativo mediante saggio di esclusione del blu di trian. Quindi aggiungere due millilitri per pozzetto di mezzo VEGF anaerobico e posizionare le piastre a 37 gradi Celsius all'interno dell'incubatrice anaerobica per 20 minuti per l'equilibrazione. Determinare la densità ottica dei batteri e risospendere.Sospendere le cellule in un volume adeguato di mezzo VEGF per infettare le cellule a una multiplicità di infezione di 100 batteri per cellula. Aggiungere la sospensione batterica alle cellule e incubare per 30 minuti a 37 gradi Celsius per l'infezione e la lisi cellulare all'interno della camera anaerobica. Preparare una soluzione di saponina all'1% peso/volume nel mezzo BHI e filtrare attraverso un filtro da 0,2 micron per studiare le interazioni batteriche con le cellule ospiti.Rimuovere la piastra a sei pozzetti dall'incubatore ed aspirare il mezzo di infezione. Lavare tre volte con PBS anaerobico. Quindi aggiungere due millilitri di soluzione di saponina in ciascun pozzetto e incubare per 15 minuti per consentire la lisi cellulare.Successivamente, raschiare le cellule dal fondo della pozzetta e diluire il lisato cellulare in rapporto uno a uno con terreno BHI. Procedere quindi con diluizioni seriali partendo da un rapporto uno a 100, piastrando 200 microlitri di una diluizione appropriata su piastre di agar sangue. Avvolgere le piastre con perfil e incubarle in un'incubatrice anaerobica a 37 gradi Celsius per sette giorni per consentire la formazione di colonie.Quindi, utilizzando una teca luminosa, contare le unità formanti colonie o UFC su ciascuna piastra dopo l'infezione delle cellule HU E. Lavare le cellule tre volte con PBS anaerobico. Successivamente, aggiungere due millilitri di mezzo VEGF integrato con concentrazioni pre-ottimizzate di antibiotici alle cellule HU E.Incubare le cellule per un'ora, aspirare il mezzo e aggiungere due millilitri di soluzione di saponina al 1% in BHI in ogni pozzetto, quindi incubare per 15 minuti. Successivamente, raschiare le cellule lisate e raccogliere il lisato in un tubo da centrifuga. Diluire il lisato uno a uno con mezzo BHI, quindi preparare diluizioni seriali a partire da uno a 100.Piastrare 200 microlitri delle concentrazioni adeguate su terreno solido al sangue. Lasciare crescere i batteri per sette giorni in una camera anaerobica e quindi contare le colonie.Il metodo di semina descritto tiene conto solo dei batteri vivi che interagiscono con le cellule. Per superare questo inconveniente, utilizziamo la microscopia, in cui sia i batteri vivi che quelli morti associati alla cellula possono essere visualizzati al fine di osservare i batteri internalizzati. Per prima cosa trasferire in modo asettico l'autoclave.Le lamelle di vetro all'interno di ogni pozzetto di una piastra a 12 pozzetti, cinque volte 10 alla quattro hve per pozzetto sulla lamella. Incubare per 24 ore per etichettare i batteri, centrifugare, fase media dei batteri, e risospendere il pellet con PBS anaerobico, quindi centrifugare nuovamente e ripetere il passaggio di lavaggio. Aggiungere 20 microlitri di B-C-E-C-F-A-M 0,2 millimolare a due millilitri di PBS anaerobico contenente da cinque a sette volte 10 alla ottava.Incubare i batteri per millilitro a 37 gradi Celsius per 30 minuti al buio. Il colorante fluorescente che utilizziamo può colorare la maggior parte dei batteri anaerobici, pertanto non sono necessari altri reagenti come un anticorpo specifico. Centrifugare la sospensione batterica a 5.000 ×g per 10 minuti per rimuovere il reagente di marcatura non legato e risospendere i batteri nel mezzo VEGF.Quindi infettare le cellule UIC in un rapporto di 100 batteri per cellula e incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Dopo l'incubazione, rimuovere il mezzo di infezione e lavare le cellule tre volte con PBS. Aggiungere quindi il 4% di paraformaldeide e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti.Per fissare le cellule nella camera anaerobica, rimuovere le cellule fissate dalla camera e quindi lavare le lamelle con PBS per 3 volte. Incubare le lamelle in un millilitro di Triton X-100 allo 0,2% per 10 minuti al fine di permeabilizzare le cellule. Successivamente, lavare nuovamente le lamelle con PBS per 3 volte. Aggiungere 50 microlitri di 50 microgrammi per millilitro di T-R-I-T-C foid su ciascuna lamella e incubare per 45 minuti a temperatura ambiente per colorare l'actina oligomerica cellulare.Dopo l'incubazione, lavare il vetrino con PBS per 3 volte. Capovolgere il vetrino su un vetrino portaoggetti con un mezzo di montaggio morbido contenente un microgrammo per millilitro di dappy per la colorazione nucleare. Quindi sigillare il bordo del vetrino con smalto per unghie e osservare al microscopio confocale l'interazione del batterio anaerobico.Gingidi porosi con uve sono mostrati in questi risultati. La diluizione seriale della sospensione cellulare, del lisato contenente batteri aderenti o internalizzati fino a 100 volte, ha prodotto un numero quantificabile di UFC su piastre di agar sangue. Sette giorni dopo l'incubazione, viene qui mostrato il confronto del rendimento di UFC su piastre di agar tra l'infezione con il ceppo selvatico Porus vallis W 83 e quella con il mutante di delezione V 315.La mutazione influenza la capacità del batterio di infettare. L'VE mostrato qui è una rappresentazione grafica delle colonie batteriche ottenute da cellule infette. Quando è stata valutata l'interazione, sono stati recuperati meno batteri mutanti rispetto al ceppo di tipo selvatico.I risultati ottenuti dopo l'uccisione dei batteri extracellulari mediante trattamento antibiotico sono mostrati nelle colonne a destra. Ancora una volta, il ceppo mutante si è rivelato inefficiente nell'invadere le cellule uve vive. I batteri vengono osservati dopo marcatura con BCE CFAM.La colorazione aggiuntiva dei filamenti di actina e del nucleo cellulare è visibile rispettivamente in fluorescenza rossa e blu. Una volta acquisite, ciascuna di queste tecniche può essere eseguita in sei ore se effettuata correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di mantenere i batteri in condizioni anaerobiche e di equilibrare tutti i mezzi e i materiali all'interno della camera anaerobica per un massimo di 24 ore prima dell'esperimento.Non dimenticare che lavorare con patogeni anaerobi può essere estremamente pericoloso e che è sempre necessario adottare precauzioni come indossare guanti, lavarsi le mani e utilizzare tecniche asettiche durante l'esecuzione di questa procedura. Pertanto, questo metodo può fornire informazioni sui patogeni preodontoi. Può inoltre essere applicato ad altri sistemi, come l'aspirazione, la polmonite, le infezioni intra-addominali, le infezioni ginecologiche e molte altre infezioni anaerobie riscontrabili in diverse sedi del corpo umano.Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla nostra terapia farmacologica per vari patogeni anaerobi, poiché misure inibitorie possono essere facilmente aggiunte al protocollo e l'internalizzazione può essere direttamente misurata dopo il trattamento. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come coltivare batteri anaerobi e valutare la loro capacità di interagire con le cellule dell'ospite.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

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Source: Alshehri, M. et. al., Organotypic Tissue Model Systems for Investigating Host-Pathogen Interactions In Vitro. J. Vis. Exp. (2025)This video demonstrates a co-culture model using multi-species oral biofilms and human oral epithelium. It highlights epithelial immune activation and enables the downstream analysis of host-pathogen interaction.

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