Ottimizzazione del test ferita Scratch per rilevare i cambiamenti in murini mesenchimali stromali migrazione cellulare dopo i danni da fumo di sigaretta estratto solubile

L'obiettivo generale di questo test è rilevare i cambiamenti nella capacità migratoria delle cellule stromali mesenchimali polmonari dopo il danno con l'estratto solubile di fumo di sigaretta. Questo metodo può essere utilizzato per rispondere a domande chiave nel campo della biologia rigenerativa polmonare, incluso il modo in cui la capacità migratoria delle cellule progenitrici polmonari può essere migliorata per aiutare nella riparazione polmonare. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è stata ottimizzata per fornire migliori misure quantitative per la migrazione cellulare, pur rimanendo economica da eseguire e facile da personalizzare.

In questa dimostrazione, il test scratch verrà utilizzato per quantificare la capacità migratoria delle cellule stromali mesenchimali del polmone murino, o MSC. Dopo l'esposizione all'estratto solubile di fumo di sigaretta, le MSC vengono coltivate in terreno completo su piastre da 60 millimetri e danneggiate come descritto nel testo del protocollo. Una confluenza appropriata è importante per il test del graffio perché garantisce che il software di imaging possa identificare correttamente i confini del graffio.

Questo esempio mostra le MSC al 95% di confluenza appropriate per il graffio in un ambiente sterile. Rimuovi il coperchio da un piatto di MSC danneggiati e stende un bordo dritto, come un righello di plastica sterilizzato, sul bordo superiore del piatto. Un bordo dritto riduce al minimo la quantità di regolazioni rotazionali necessarie per la lastra quando viene successivamente posizionata sul tavolino del microscopio per l'imaging.

Senza rimuovere il terreno, utilizzare un puntale per pipetta sterile da 200 microlitri guidato dal bordo dritto sterile per eseguire quattro graffi paralleli sulla piastra, a circa cinque millimetri di distanza l'uno dall'altro e lunghi 50 millimetri. La generazione di graffi multipli su una piastra di 60 millimetri non altera il microambiente in modo da influenzare la migrazione cellulare per le MSC, ma può essere una considerazione per altri tipi di cellule. Aspirare il terreno e lavare delicatamente la piastra con due millilitri di materiale completo di preriscaldamento.

Ciò impedisce alle cellule di aderire al centro del graffio e rimuove le cellule che sono state allentate dal graffio. Sostituire con quattro millilitri di terreno completo fresco utilizzando un'etichetta sterile e indelebile, ogni graffio da uno a quattro sul lato inferiore della lastra in posizioni che non interferiscono con l'imaging. Le immagini iniziali di ogni graffio devono essere scattate perché è importante che le immagini dello stesso graffio vengano confrontate prima e dopo la migrazione, poiché possono esserci variazioni nella larghezza del graffio.

Se il test di graffiatura viene eseguito su più lastre, si consiglia di acquisire le immagini iniziali di tutti i graffi su una singola lastra prima di eseguire graffi sulla lastra successiva. Utilizzare un microscopio a contrasto di fase invertito con una fotocamera per acquisire le immagini necessarie per l'analisi. Posizionare la piastra di coltura sul microscopio e utilizzare l'obiettivo a bassa potenza per individuare il graffio.

Numero uno. È imperativo che il graffio appaia completamente orizzontale sullo schermo, mantenendo il graffio completamente orizzontale e al centro del campo visivo, ottenere il maggior numero di immagini necessarie per comprendere il 90% della lunghezza del graffio. Ottieni immagini da parti distinte del graffio senza sovrapposizioni tra le immagini.

Non prendere immagini dal primo e dall'ultimo 5% della lunghezza del graffio perché la rifrazione della luce ai bordi del piatto di coltura sovraespone le immagini, rendendole impossibili da analizzare. Salva le immagini da zero, numero uno in una cartella. Ottieni le immagini per i graffi due, tre e quattro allo stesso modo e salva le immagini di ogni graffio in una cartella separata.

Rimettere le piastre nell'incubatrice subito dopo questa prima imaging. Lasciare migrare le cellule per quattro-sette ore prima di iniziare questo test. Scarica il software Image J e installa il plug-in dello strumento di guarigione delle ferite.

Apri il file immagine nell'immagine J, quindi fai clic su Elabora e trova i bordi per evidenziare le cellule che circondano il graffio per lo strumento di guarigione delle ferite. Per calcolare l'area di graffio, fare clic su regolazione immagine e soglia colore e, nel menu a discesa con l'etichetta colore soglia, modificare il valore in BNW all'interno del menu della soglia colore. Sposta il cursore inferiore completamente a destra per rendere l'immagine completamente nera, quindi regola il cursore superiore per generare il massimo contrasto tra il graffio e la parte anteriore della cella.

Regola lentamente il cursore della luminosità superiore da sinistra a destra finché l'immagine non mostra in modo pulito il contorno del graffio. Una volta identificati i bordi del graffio, fare clic su altri strumenti. Nella barra degli strumenti J dell'immagine, selezionare lo strumento di guarigione delle ferite MRI dal menu a discesa e premere il pulsante M per evidenziare l'area di graffio e produrre l'area calcolata.

In una finestra pop-out dei risultati, copia e incolla tutti i numeri dalla finestra dei risultati in un foglio di calcolo Excel. Assicurati di separare i dati dai singoli graffi. Dopo che le cellule sono migrate per quattro-sette ore, ripetere la procedura di acquisizione dell'immagine per i graffi che riprendono le lastre nello stesso ordine in cui sono state graffiate in modo che le cellule su ciascuna lastra abbiano avuto lo stesso tempo per migrare.

Le cellule possono essere visualizzate in più punti temporali a seconda della loro sensibilità alle variazioni di temperatura e pH. Le immagini di graffio finali vengono quindi analizzate utilizzando l'immagine J nello stesso modo dimostrato per le immagini di graffio iniziali. Le aree scratch possono anche essere calcolate per quantificare la migrazione, corretto.

La confluenza è fondamentale per il successo del test scratch. Qui viene mostrato un graffio riuscito di MSC polmonari murine alla confluenza del 95%. Al contrario, una confluenza del 70% è troppo bassa per un graffio riuscito e può produrre falsi confini.

Si tratta di immagini originali rappresentative pre-migrazione e post-migrazione con i corrispondenti confini dell'area di graffio definiti dal software di imaging. Questi grafici mostrano l'area media calcolata del graffio in pixel per ciascuno dei quattro graffi praticati su una lastra di MSC polmonari murine alla confluenza del 95% prima o dopo la migrazione con esposizione all'estratto di fumo di sigaretta allo 0% o al 4%. Un confronto della variazione media calcolata nell'area del graffio ha rivelato una minore migrazione di MSC polmonare murino dopo l'esposizione all'estratto di fumo di sigaretta al 4%.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di ottimizzare e monitorare attentamente la confluenza cellulare per il particolare tipo di cellula con cui stavamo lavorando ed esercitarsi a generare i graffi per garantire che siano il più uniformi possibile. Dopo questa procedura, altre tecniche come l'immunoistochimica possono essere eseguite per rispondere a ulteriori domande sulle alterazioni e sull'espressione proteica che possono influenzare la migrazione cellulare.