Ottimizzazione del test ferita Scratch per rilevare i cambiamenti in murini mesenchimali stromali migrazione cellulare dopo i danni da fumo di sigaretta estratto solubile

L'obiettivo generale di questo saggio è rilevare le variazioni nella capacità migratoria delle cellule staminali mesenchimali polmonari dopo un danno indotto da estratto solubile di fumo di sigaretta. Questo metodo può essere utilizzato per rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia rigenerativa del polmone, ad esempio in che modo la capacità migratoria delle cellule progenitrici polmonari possa essere migliorata per favorire la riparazione del tessuto polmonare. Il principale vantaggio di questa tecnica è che è stata ottimizzata per fornire misurazioni quantitative più accurate della migrazione cellulare, mantenendosi al contempo economica da eseguire e facile da personalizzare.

In questa dimostrazione, il saggio del graffio verrà utilizzato per quantificare la capacità migratoria delle cellule staminali mesenchimali polmonari di topo, o MSC. Dopo l'esposizione a estratto solubile di fumo di sigaretta, le MSC vengono coltivate in mezzo completo su piastre da 60 millimetri e danneggiate come descritto nel testo del protocollo. Una confluenza appropriata è importante per il saggio del graffio perché garantisce che il software di imaging possa identificare correttamente i margini del graffio.

In questo esempio vengono mostrate cellule staminali mesenchimali (MSC) al 95% di confluenza, adatte per essere graffiate in un ambiente sterile. Rimuovere il coperchio da una piastra contenente MSC danneggiate e posizionare un bordo dritto, come un righello di plastica sterilizzato, lungo il bordo superiore della piastra. Un bordo dritto riduce al minimo la quantità di regolazioni rotazionali necessarie per la piastra quando successivamente verrà posizionata sul palco del microscopio per l'acquisizione delle immagini.

Senza rimuovere il mezzo, utilizzare una punta sterile da 200 microlitri guidata dal bordo dritto sterile per eseguire quattro graffi paralleli sulla piastra, distanti circa cinque millimetri l'uno dall'altro e lunghi 50 millimetri. La creazione di più graffi su una piastra da 60 millimetri non modifica il microambiente in modo da influenzare la migrazione cellulare delle MSC, ma potrebbe essere una considerazione per altri tipi cellulari. Aspirare il mezzo e lavare delicatamente la piastra con due millilitri di mezzo completo preriscaldato.

Questo impedisce alle cellule di aderire al centro della riga e rimuove le cellule che sono state allentate dalla rigatura. Sostituire con quattro millilitri di mezzo completo fresco utilizzando un marcatore sterile permanente per etichettare ciascuna riga da uno a quattro sul fondo della piastra in punti che non interferiscano con l'acquisizione delle immagini. È necessario acquisire le immagini iniziali di ciascuna riga, poiché è importante confrontare immagini della stessa riga prima e dopo la migrazione, dato che può esserci variabilità nella larghezza delle righe.

Se il saggio del graffio viene eseguito su più piastre, si raccomanda di acquisire inizialmente le immagini di tutti i graffi su una singola piastra prima di effettuare i graffi sulla piastra successiva. Utilizzare un microscopio a contrasto di fase invertito dotato di fotocamera per acquisire le immagini necessarie per l'analisi. Posizionare la piastra di coltura sul microscopio e utilizzare l'obiettivo a basso ingrandimento per individuare il graffio.

Punto uno. È imperativo che il graffio appaia completamente orizzontale sullo schermo, mantenendolo completamente orizzontale e al centro del campo visivo; acquisire un numero sufficiente di immagini da coprire il 90% della lunghezza del graffio. Acquisire immagini da porzioni distinte del graffio senza sovrapposizioni tra le immagini.

Non acquisire immagini dal primo e dall'ultimo 5% della lunghezza del graffio, poiché la rifrazione della luce ai bordi della piastra di coltura sovraespone le immagini, rendendole impossibili da analizzare. Salvare le immagini del graffio numero uno in una cartella. Ottenere immagini per i graffi due, tre e quattro nello stesso modo e salvare le immagini di ciascun graffio in una cartella separata.

Rimettere subito le piastre nell'incubatrice dopo questa prima acquisizione. Lasciare che le cellule migrino per quattro o sette ore prima di iniziare questo saggio. Scaricare il software ImageJ e installare il plugin dello strumento per la guarigione delle ferite.

Aprire il file immagine in ImageJ, quindi fare clic su Processa e selezionare Trova bordi per evidenziare le cellule che circondano la ferita per lo strumento di guarigione della ferita. Per calcolare l'area della ferita, fare clic su Immagine, Regolazione e Soglia colore, quindi nel menu a discesa denominato Colore soglia, modificare il valore in BNW all'interno del menu Soglia colore. Spostare completamente a destra il cursore inferiore per rendere l'immagine completamente nera, quindi regolare il cursore superiore per generare il massimo contrasto tra la ferita e il fronte cellulare.

Regolare lentamente il cursore della luminosità superiore da sinistra a destra finché l'immagine mostra chiaramente il contorno del graffio. Una volta identificati i bordi del graffio, fare clic su ulteriori strumenti. Nella barra degli strumenti di Image J, selezionare lo strumento MRI wound healing dal menu a discesa e premere il tasto M per evidenziare l'area del graffio e ottenere l'area calcolata.

In una finestra pop-up dei risultati, copiare e incollare tutti i numeri dalla finestra dei risultati in un foglio di calcolo Excel. Assicurarsi di separare i dati provenienti da graffi individuali. Dopo che le cellule hanno migrato per quattro o sette ore, ripetere la procedura di acquisizione delle immagini per i graffi, immaginando le piastre nello stesso ordine in cui sono state graffiate, in modo che le cellule su ciascuna piastra abbiano avuto lo stesso tempo per migrare.

Le cellule possono essere analizzate in diversi punti temporali a seconda della loro sensibilità alle variazioni di temperatura e pH. Le immagini finali della ferita sono quindi analizzate utilizzando ImageJ nello stesso modo mostrato per le immagini iniziali della ferita. Le aree della ferita possono anche essere calcolate per quantificare la migrazione, corretto.

La confluenza è fondamentale per il successo del saggio di graffio. Qui viene mostrato un graffio riuscito su cellule staminali mesenchimali polmonari di topo a una confluenza del 95%. Al contrario, una confluenza del 70% è troppo bassa per un graffio efficace e può generare confini falsi.

Queste sono immagini originali rappresentative pre-migrazione e post-migrazione, con i relativi contorni dell'area del graffio definiti dal software di imaging. Questi grafici mostrano l'area media del graffio calcolata in pixel per ciascuno dei quattro graffi effettuati su una piastra di MSC polmonari murini al 95% di confluenza, prima o dopo la migrazione, in seguito all'esposizione a un estratto di fumo di sigaretta al 0% o al 4%. Il confronto della variazione media calcolata dell'area del graffio ha rivelato una minore migrazione degli MSC polmonari murini dopo l'esposizione all'estratto di fumo di sigaretta al 4%.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di ottimizzare e monitorare attentamente la confluenza cellulare per il particolare tipo cellulare con cui si sta lavorando e di esercitarsi nella creazione dei graffi per assicurare che siano il più uniformi possibile. Dopo questa procedura, possono essere eseguite altre tecniche come l'immunohistochimica per rispondere ad ulteriori domande riguardo alle alterazioni e all'espressione proteica che potrebbero influenzare la migrazione cellulare.