Estrazione sequenziale di solubile e insolubile sinucleina alfa da Brains parkinsoniani

L'obiettivo generale di questa metodologia è quello di estrarre l'alfa-sinucleina solubile e insolubile dal cervello parkinsoniano post-mortem. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nello studio del morbo di Parkinson. Il vantaggio principale di questa tecnica è che si tratta di una tecnica relativamente semplice che utilizza reagenti e strumenti di laboratorio comuni.

Dopo aver preparato le soluzioni e i tamponi necessari, iniziare posizionando un campione di 0,5 grammi di tessuto dei gangli della base congelato su una piccola capsula di Petri. Usa una lama di bisturi sterile per tritare rapidamente in frammenti quadrati di un millimetro. Raccogli il tessuto tritato in una provetta da 15 millilitri e aggiungi 10 volumi di ghiaccio freddo, 1X TBS alla provetta.

Omogeneizzare i campioni utilizzando un omogeneizzatore meccanico a 20.000 giri/min per 10 secondi. Quindi raffreddare con ghiaccio per due minuti. Ripetere l'omogeneizzazione tre volte, raffreddando ogni volta con ghiaccio.

Centrifugare l'omogeneizzato a 10.000 g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire il surnatante omogeneizzato grezzo in provette da centrifuga in policarbonato e centrifugare a 100.000 g per un'ora a quattro gradi Celsius. Trasferire il surnatante in provette raffreddate su ghiaccio e conservarlo come frazione solubile TBS.

Lavare in cinque volumi di tampone 1X TBS e centrifugare a 100.000 g per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Aspirare e scartare il surnatante. Quindi ripetere il lavaggio.

Il lavaggio accurato dei pellet tra le fasi di ultracentrifugazione è fondamentale per il successo di questa procedura. Dopo aver lasciato che i campioni raggiungessero una temperatura di 10 gradi Celsius per evitare la precipitazione SDS, aggiungere cinque volumi di 1X TBS-SDS e risospendere il pellet finale sonicando per 10 secondi a 20 kilohertz a temperatura ambiente. Ultracentrifugare a 100.000 g per 30 minuti a 25 gradi Celsius.

Dopo l'ultracentrifugazione, trasferire il surnatante in provette raffreddate su ghiaccio e conservare come frazione solubile SDS. Aggiungere cinque volumi di tampone 1X TBS-SDS a temperatura ambiente al pellet e centrifugare a 100.000 g per 15 minuti a 25 gradi Celsius. Eliminare il tampone di lavaggio e ripetere il lavaggio.

Dopo aver scartato il surnatante, aggiungere 50 microlitri di 1X TBS-SDS-Urea e solubilizzare utilizzando un sonicatore impostato a 20 kilohertz per 10 secondi. Etichettare questo campione come frazione solubile di urea. È essenziale assicurarsi che tutte le proteine insolubili vengano estratte durante la procedura.

Diluire i campioni TBS-SDS-Urea uno a uno con un tampone 1X TBS per consentire la compatibilità con i reagenti per il dosaggio delle proteine e analizzare ogni frazione per il contenuto proteico totale utilizzando un kit di dosaggio delle proteine commerciale secondo il protocollo del produttore. Aliquotare i campioni in aliquote da 20 microlitri con il 10% di glicerolo per ridurre i futuri cicli di congelamento-scongelamento e conservarli a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius. Caricare 10 microlitri di estratti TBS, TBS-SDS e TBS-SDS-Urea in un marcatore di peso molecolare su 10 pozzetti, dal quattro al 12% di gel di poliacrilammide Bis-Tris con MOPS come tampone di corsa utilizzando tecniche standard.

Far funzionare il gel a 200 volt per un'ora, o fino a quando il colorante blu del tampone di caricamento non ha raggiunto il fondo del gel. Bagnare una membrana di nylon in metanolo al 100%, quindi immergerla in un tampone di trasferimento contenente il 20% di metanolo. Tracciare un segno identificativo sul blot per determinare il lato proteico e l'orientamento dei marcatori delle dimensioni del peso molecolare.

Unire il gel con la membrana insieme alla carta da filtro bagnata. Eseguire il trasferimento per due ore a 40 volt. Bloccare la soluzione al 5% di BSA in 1X PBS-T per 30 minuti agitando a 70 giri/min per evitare il legame non specifico dell'anticorpo primario alla membrana.

Sondare il protein blot incubando con sei millilitri dell'anticorpo primario alfa-sinucleina Syn-1 diluito a 750 in PBS-T durante la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, lavare la membrana con 1X PBS-T tre volte per cinque minuti ogni volta. Quindi incubare il blot con l'anticorpo secondario coniugato HRP appropriato diluito da uno a 2.000 in PBS-T per 30 minuti.

Lavare la membrana come prima con 1X PBS-T. Immergere i blot in una soluzione di chemiluminescenza potenziata secondo le istruzioni del produttore in una stanza buia. Coprire le macchie con pellicola trasparente e catturare il segnale utilizzando l'autoradiografia.

Dopo l'imaging, incubare il western blot con sei millilitri di tampone di stripping del western blot per 10 minuti agitando costantemente per rimuovere il segnale dell'anticorpo dell'alfa-sinucleina. Ripetere la procedura di western blot per sondare la membrana con l'anticorpo primario beta-actina a una diluizione da uno a 8.000. Scansiona e converti l'immagine finale in un'immagine Tiff e misura le densità utilizzando NIH ImageJ a scopo di quantificazione.

Le immagini seguenti sono immunoblot rappresentativi dei livelli di alfa-sinucleina dal PD e controllano il tessuto dei gangli della base umano. Le frazioni solubili di TBS, SDS e urea sono state analizzate per la presenza di alfa-sinucleina utilizzando l'immunoblot occidentale. 10 milligrammi di proteine sono stati caricati in ogni corsia.

Nella frazione TBS, i monomeri dell'alfa-sinucleina sono presenti in tutti i casi. L'asterisco rappresenta probabilmente una forma troncata C-terminale di alfa-sinucleina. Nella frazione SDS, alcuni oligomeri di alfa-sinucleina sono osservati insieme a monomeri, indicati dalla solida punta di freccia nel tessuto PD.

Nella frazione ureica, i monomeri, gli oligomeri e l'alfa-sinucleina aggregata sono espressi in modo variabile nei casi di PD, riflettendo il rispettivo carico di corpi di Lewy. I campioni di controllo neurologicamente normali mostrano la presenza solo di piccole quantità di alfa-sinucleina monomerica. Una volta padroneggiata, questa tecnica di estrazione delle proteine può essere eseguita entro un giorno lavorativo, seguita da immunoblot occidentale il giorno successivo, se eseguita correttamente.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia dei corpi di Lewy per esplorare le specie di alfa-sinucleina insolubili e aggregate in tessuti umani patologici e in modelli animali in vivo. Non dimenticare che lavorare con tessuti umani non fissati richiede misure precauzionali e guanti e camici da laboratorio devono essere indossati per tutte le procedure di manipolazione.