Name: Estrazione sequenziale di solubile e insolubile sinucleina alfa da Brains parkinsoniani (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-05T14:00:01.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Impara ad estrarre sinucleina alfa solubile e insolubile da tessuto cerebrale post-mortem di pazienti con Parkinson. Questo metodo biochimico utilizza ultracentrifugazione e western blot per analizzare l'aggregazione proteica.

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Ringrazio il dottor Adamantios Mamais per aver estratto la α-sinucleina dai tessuti umani e per aver fatto scorrere le macchie. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da una sovvenzione MRC (MR/L010933/1) e in parte dal premio Wellcome Trust/MRC Joint Call in Neurodegeneration (WT089698) al Consorzio per la malattia di Parkinson del Regno Unito (UKPDC) i cui membri provengono dall'UCL Institute of Neurology, dall'Università di Sheffield e dall'Unità di fosforilazione delle proteine MRC dell'Università di Dundee. RB ha ricevuto finanziamenti dalla fondazione MJFox per questo lavoro ed è anche finanziato dal Reta Lila Weston Trust.

Tessuto cerebrale post-mortem è stato donato al Queen Square Cervello Banca dei disturbi neurologici, University College di Londra, Istituto di Neurologia utilizzando protocolli eticamente approvati e conservati per la ricerca con una licenza rilasciata dall&#39;autorità tessuto umano (HTA) Inglese (n. 12198). Vedere elenco dei casi usati per questo protocollo (Tabella 1). 1. Preparazione del buffer <ol><li> Preparare 1X TBS (soluzione fisiologica tamponata con Tris) buffer: <ol><li> Preparare 10X TBS come soluzione di riserva con NaCl 500 mm Tris-HCl pH 7.4 e 1.500. <ol><li> Pesare 60,5 g Tris-Cl pH 7,6 e 87,6 g di NaCl in 800 ml di acqua ad elevata purezza. Regolare il pH con 1 M HCl e fare il brodo volume finale per 1 L. </li></ol></li><li> Preparare la concentrazione finale di 1X TBS diluendo lo stock 10 volte in acqua distillata. </li><li> Aggiungi inibitori della proteasi (PI), (1 compressa al 50 ml di tampone) e Phos-stop inibitori fosfatasi compresse (1 compressa ogni 10 ml di tampone) aabolisce gli effetti della non-specifiche azioni enzimatiche di proteasi e fosfatasi. Nota: Qui abbiamo utilizzato l&#39;enzima inibitore di compresse da Roche, ma ugualmente altri inibitori disponibili in commercio possono essere utilizzati secondo le istruzioni del produttore. </li></ol></li><li> Preparare tampone TBS-SDS aggiungendo 5% w / v di sodio dodecil solfato (SDS) a 1X TBS (pH 7,4) buffer. Riscaldare la soluzione a 60 ° C con agitazione costante con un agitatore magnetico per solubilizzare SDS. </li><li> Preparare tampone TBS-SDS-Urea aggiungendo urea ad una concentrazione finale di 8 M w / v di tampone 1X TBS-SDS (pH 7,4). Riscaldare la soluzione a 60 ° C con agitazione costante su un agitatore magnetico a dissolversi urea. </li></ol> 2. omogeneizzazione del campione e ultracentrifugazione differenziale Nota: La seguente parte del lavoro comporta movimentazione del tessuto cerebrale umana secondo le regole di HTA UK. Procedure operative standard locali sono seguite affatto times. Campioni di cervello sono sezionati da blocchi cerebrali congelati e materiale tissutale omogeneizzati in un microcabinet mantenuto a pressione negativa. Camici monouso guanti, volto-maschera, oltre a ferro di proteggi schermi e occhiali di sicurezza sono indossati durante l&#39;intera procedura. Rifiuti tessuto umano viene scartata dopo autoclave a 121 ° C per 20 minuti per lo smaltimento sicuro. Sharps (lame di bisturi) sono disposti in un apposito contenitore adeguato per il contenimento e smaltimento sicuro. <ol><li> Prendete un pezzo di tessuto umano congelato (circa 0,5 g di peso dalla regione gangli basali) e rapidamente tritate in piccoli frammenti (circa 1 mm 2) sul ghiaccio con una piccola piastra di Petri e una lama di bisturi sterile. Utilizzare una piastra di Petri separato e bisturi per ogni campione. Raccogliere il tessuto tritato in una provetta da 15 ml e aggiungere 10 volumi di tampone 1XTBS ghiacciato al tubo. </li><li> Omogeneizzare i campioni utilizzando un omogeneizzatore meccanico a 20.000 rpm per 10 sec. Raffreddare in ghiaccio per 2 minuti. Ripetere questa operazione tre volteS. Nota: Questo è fatto in modo che i campioni non sono riscaldati durante omogeneizzazione. </li><li> Chiarire per centrifugazione a 1000 xg per 5 minuti a 4 ° C. Scartare pellet di materiale non omogeneizzato. </li><li> Prendere surnatante (omogenato greggio), aggiungere al policarbonato provette (dimensioni del tubo dipende dalle dimensioni del rotore) e bilanciare con attenzione. Centrifugare a 100.000 xg per 1 ora a 4 ° C. </li><li> Conservare surnatante come questa è la frazione TBS-solubile. </li><li> Lavare pellet due volte in cinque volumi di tampone 1X TBS e centrifugare ogni volta a 100.000 xg per 15 min a 4 ° C. Eliminare il surnatante. <ol><li> Risospendere il pellet finale sonicating pellet per 10 sec a 20 KHz in circa 5 volumi di 1X TBS-SDS a RT. Nota: Prima di aggiunta dei campioni contenenti tampone SDS dovrebbe essere portato a 10 ° C per evitare la precipitazione SDS. </li><li> Ultracentrifuga a 100.000 xg per 30 min a 25 ° C. </li></ol></li><li> Conservare il surnatante come questo è the SDS frazione solubile. <ol><li> Lavare pellet due volte in 5 volumi di tampone 1X TBS-SDS a RT. Centrifugare ogni volta a 100.000 xg per 15 min a 25 ° C. </li><li> Solubilizzare precipitato finale in 50 ml di 1X tampone TBS-SDS-UREA usando un sonicatore fissato a 20 KHz per 10 secondi per raggiungere la completa solubilizzazione; questo è chiamato la frazione solubile urea. </li></ol></li><li> Analizzare ogni frazione di contenuto proteico totale utilizzando un kit di analisi delle proteine ​​commerciale secondo il protocollo del produttore. Diluire i campioni TBS-SDS-Urea 1: 1 con tampone 1X TBS per consentire la compatibilità con i reagenti del test della proteina. Congelare i campioni in piccole aliquote (20 mL) a -80 ° C per ridurre i cicli di gelo e disgelo. Nota: l&#39;aggiunta del 10% glicerolo ai campioni è consigliato per lo stoccaggio a lungo termine a -80 ° C. </li></ol> 3. Immunoblotting di Campioni e risultati Analisi <ol><li> Campioni eseguito da TBS, TBS-SDS ed estratti TBS-SDS-urea su 10 ben 4-12% gel Bis-Tris poliacrilammidecon MOPS come tampone di corsa utilizzando tecniche standard. Vedere Gallagher e Chakravarti (2008) 29 per un protocollo Western Blot dettagliata. </li><li> Carico 10 ug di proteine ​​di ogni campione su ogni corsia con un marcatore di peso molecolare per TBS e SDS e frazioni urea. </li><li> Eseguire gel a 200 V per 1 ora o finché il colorante blu di tampone di caricamento ha raggiunto il fondo del gel. </li><li> Trasferimento proteine ​​da gel elettroforesi su membrane di nylon 28, pre-umidificato prima in metanolo 100% e poi in buffer di trasferimento contenente 20% di metanolo. Fornire un marchio di identificazione sul blot per determinare il lato proteine ​​e l&#39;orientamento dei marcatori di dimensioni peso molecolare. <ol><li> Sandwich il gel con la membrana a fianco carta da filtro bagnata. Corretto posizionamento membrana è cruciale con la membrana tra il gel e l&#39;anodo. Eseguire il trasferimento per 2 ore a 40 V. </li><li> Make up 1X PBS-Tween (1X PBS-T) buffer: Sciogliere 1 compressa di PBS in 200 mlacqua dando 0,01 M tampone fosfato, cloruro di potassio 0,0027 M e 0,137 M di cloruro di sodio, pH 7,4. </li><li> Bloccare la membrana in soluzione BSA 5% in PBS-T 1X per 30 minuti con agitazione a 70 rpm. Questo impedisce legame dell&#39;anticorpo primario alla membrana non specifico. </li></ol></li><li> La sonda blot proteina con 6 ml di α-syn anticorpo primario Syn-1 (BD Biosciences, anticorpo monoclonale di topo) a 1: 750 di diluizione (O / N a 4 ° C) seguita da una serie di lavaggi con PBS 1X-T ( 3 x 5 minuti ogni volta) 28. </li><li> Incubare la macchia con la HRP appropriata coniugato anticorpo secondario a 1: 2.000 diluizione per 30 min. Eseguire una serie di lavaggi (3 x 5 min ogni volta) con 1X PBS-T. <ol><li> Immergere macchie in soluzione chemiluminescence migliorato per 15 secondi in una stanza buia. Macchie Coprire con una pellicola trasparente e mettere film autoradiografia contro la macchia con lato di proteine ​​fino a una cassetta a tenuta di luce per catturare i segnali appropriati (bande di dimensioni adeguate). </li><li> Sviluppare film autoradiografia in uno sviluppatore automatico. Nota: Macchie può anche essere sviluppato manualmente utilizzando sviluppo e di fissaggio da una fonte commerciale in caso di una macchina automatica sviluppatore non è disponibile. </li></ol></li><li> Incubare il Western Blot con 6 ml di western blot di stripping buffer per 10 minuti con costante scuotendo per togliere la macchia di segnale di anticorpi α-syn. Seguire i passaggi da 3.43 fino alla 3.6.2 con la beta-actina anticorpo primario (monoclonale murino) a 1: 8.000 diluizione. </li><li> Scansione e convertire l&#39;immagine finale in un&#39;immagine e misurare Tiff densità utilizzando NIH ImageJ a fini di quantificazione (un software scaricabile gratuitamente). Nota: Il software permette la lettura di densità di superficie relativa di interesse (le bande di dimensioni appropriate) ei dati può essere espressa sia come rapporto di α-syn densità / β-actina (un gene house-keeping) come unità arbitrarie o su proprio quando un gene casa armonia non è valido (come nel caso di campioni solubili-urea). </li&gt; </ol>

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<li>Newman, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+quantitative+immunoblotting+of+endogenous+%CE%B1-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A new method for quantitative immunoblotting of endogenous α-synuclein.</a> PLoS ONE. 8 (11), e81314(2013).</li>
</ol>

L&#39;autore non ha nulla da rivelare.

Questo articolo descrive un protocollo di biochimica per l&#39;estrazione e l&#39;esame delle caratteristiche di solubilità differenziale di monomeri, oligomeri e aggregate α-syn da cervelli malati utilizzando denaturanti condizioni di gel di marcia. Questa è una tecnica consolidata per studiare α-syn 17, 18, ​​20, 21, una proteina che è normalmente solubili nella sua forma nativa ma ottenere proprietà di aggregazione amiloidogeniche o maggiori con progressione della malattia o con mutazioni genetiche aggregata. Ciò nonostante, alcuni gruppi hanno usato leggere variazioni delle concentrazioni SDS nei loro buffer (8% o il 10% invece del 5%) 21,22, 30. La SDS è un detergente anionico e solubilizza α-syn oligomeri che possono includere membrana legati forme di α-syn, mentre l&#39;urea, un reagente caotropico snatura le forme insolubili aggregati fibrillari e amiloidogeniche o di α-syn 20. A questo proposito uno studio sistematico da Paleologou et al 31 ha esaminato la stabilitàdi oligomeri e fibrille con concentrazioni variabili di urea alfa-syn (6.5 - 8 M) o SDS (0,25-2%) e ha riferito che oligomeri stabili in concentrazioni SDS ma non con elevate concentrazioni di urea. Il loro FILA-1 anticorpo, specifico per oligomeri e fibrille alfa-syn rilevato concentrazioni più elevate di fibrille a 6.5 M concentrazioni di urea in condizioni non denaturanti. Le concentrazioni tampone utilizzate in questo protocollo rispecchia fedelmente quanto descritto in Culvenor et al. (1999) 32. Le regioni cerebrali anatomiche per l&#39;estrazione biochimica di insolubile α-syn devono essere attentamente selezionati e questo dovrebbero riflettere LB e LN carico α-syn seconda progressione della malattia 33,34. I casi utilizzati qui sono campioni dei gangli della base dei sottotipi neocorticale e limbiche del PD che riflettono ultime fasi intermedie e di progressione PD secondo McKeith ctriteria 34. Al cervello Banca Queen Square, una metà del cervello èordinariamente fissato in formalina per analisi istochimica e l&#39;altra metà è accuratamente sezionato in diverse regioni anatomiche e flash congelato e conservato a -80 ° C congelatori per ulteriori studi biochimici e DNA / RNA analisi. In seguito la fissazione in formalina dei cervelli e la dissezione di neuropatologi, immunoistochimica viene eseguita utilizzando α-syn anticorpi e risultati archiviati. Anche come una procedura di routine, il pH del tessuto cerebrale viene misurata all&#39;arrivo come misura di stato agonal del tessuto cerebrale. Questo forma una base solida per la qualità di conservazione del tessuto per l&#39;analisi biochimica. I nostri dati dimostrano che qui ci sono più solubili in SDS monomero α-syn nei casi PD rispetto ai controlli; in particolare i casi di PD neocorticali ha elevato carico α-syn rispetto alla varietà PD limbico. I casi neocorticale rappresentano una maggiore progressione della PD α-syn patologia nelle regioni neocorticali come le cor frontali e parietalitiche 33,34. I casi PD limbiche hanno alti punteggi LB nelle zone basali prosencefalo / regioni limbiche, come l&#39;amigdala, transentorhinal e le regioni cingolato. Per i dati significativi e l&#39;analisi statistica, si deve eseguire almeno 4 casi di ogni coorte. Allo stesso modo non abbiamo tentato analisi statistica dei dati blot qui presentati. Si deve anche notare che gli anticorpi diversi possono riconoscere diverse forme / composizione di ordine superiore alfa-syn oligomeri e ciascuno può avere la propria sensibilità relativa e preferenza. Ciò è evidente dai risultati di Tong et al. 29 dove si mostrano che 4 differenti anticorpi alfa-syn (Syn-1, SS, Onco e LB509) danno risultati variabili almeno per alfa-syn oligomeri / aggregati. I monomeri α-syn stati riconosciuti in misura simili tutti 4 anticorpi anche se questi possono avere variazioni a seconda che l&#39;epitopo anticorpo α-syn si trova sia nel N-terminale o C-Terminal 29. Analogamente, anticorpi specifici per fosfo-alfa sinucleina determinare il peso molecolare elevato distinta α-sinucleina specie 20,21. Nel protocollo qui descritto, l&#39;anticorpo altamente caratterizzato Syn-1 è stato utilizzato 19-21. Tuttavia, è importante considerare convalidare qualsiasi nuovo anticorpo su western blot mediante esperimenti preassorbimento anticorpi e anche sovraespressione e arresto della proteina nelle cellule. È importante considerare altre varianti che sono state applicate dai ricercatori per determinare frammenti più piccoli di forme alfa-syn e tetramerici o instabili alfa-syn. Questo potrebbe includere lieve fissaggio di membrane con 0,4% PFA in PBS a conservare forme troncate di α-syn 35 o il trattamento di omogenati with linker croce per stabilizzare tetrameri 36. Valutazione accurata biochimica delle proteine ​​usando post mortem tiSSUE richiede la minimizzazione della degradazione enzimatica delle proteine ​​e la modifica. Si consiglia pertanto di utilizzare il tessuto con i più brevi ritardi post mortem e / o dei campioni appaiati nei casi coorti. Immunoistochimica utilizzando anticorpi standard per la α-syn immunoistochimica deve essere eseguita prima di avviare il protocollo di isolamento. L&#39;entità di α-syn patologia è molto variabile e può variare a seconda delle regioni selezionate. Si consiglia di selezionare le regioni con abbondante patologia come controllo positivo per la resa ottimale di ogni corsa. L&#39;uso di inibitori della proteasi e, se necessario, fosfatasi inibitori per prevenire la degradazione enzimatica indesiderata dopo il rilascio di proteasi intracellulari o fosfatasi che si verificano durante la lisi cellulare e mantenere i campioni a 4 ° C è cruciale. È importante che tutti i campioni all&#39;interno del lotto di esperimenti vengono gestiti in modo uniforme e costante per evitare variazioni intra-utente; fre multiplacicli di Eze-disgelo dovrebbero essere evitati in quanto ciò potrebbe potenzialmente rientrare modificazioni post-traduzionali come la fosforilazione. Un punto critico da tenere a mente quando si esamina un gran numero di campioni è che i dati di immunoblot dovrebbero essere normalizzato su un campione, che dovrebbe funzionare in parallelo a tutti gli altri campioni su gel, e tutti i dati di riferimento per quel campione. Questo viene fatto per garantire la normalizzazione dei dati immunoblot tra più macchine. Questo è il metodo adottato nel nostro recente studio 22. Va notato che, al fine di mantenere lo sfondo ECL basso, le macchie non devono essere lasciati essiccare in qualsiasi momento durante il protocollo Western Blot. Inoltre, molto lunghe esposizioni (&gt; 10 min) su film autoradiografia dovrebbe essere evitato come questo porterà alla saturazione del segnale ECL e porterà alla quantificazione imprecisa. Questo protocollo di cui sopra è una tecnica relativamente semplice utilizzando reagenti di laboratorio comuni e instruments e può essere un valido strumento per studiare la fisiopatologia della proteina α-syn nella ricerca PD. Questa metodologia non può essere prorogato solo con le opportune modifiche allo studio di α-syn biologia in animali transgenici alfa-syn ma anche ad altre malattie neurodegenerative che caratterizzano i depositi anomali di proteine ​​aggregate, quali AD, MSA, DLB, HD e frontotemporaldementias. Tuttavia i dati Western Blot qui descritte potrebbero anche essere convalidati utilizzando enzyme-linked immunosorbent test utilizzando anticorpi per forme specifiche di α-syn 31.

Una delle principali caratteristiche patologiche comuni tra varie malattie neurodegenerative è la formazione di aggregati proteici anormali che si verifica in una proteina / malattia maniera specifica 1. Quindi, ci sono i caratteristici extraneuronale placche di beta-amiloide e tau aggregati depositi iperfosforilata all&#39;interno dei neuroni nella malattia di Alzheimer (AD); i depositi alfa-syn aggregati in Lewy Bodies (LBS), che sono inclusioni intraneuronali, e anche all&#39;interno dei processi distrofici neuronale chiamato Lewy neurites (LNS) di PD, PD demenza e demenza con corpi di Lewy (DLBs) 2-4. Depositi alfa-syn anormali sono visti anche nelle lesioni segno distintivo di inclusioni citoplasmatiche gliali in MSA 5. Nella malattia di Huntington, ci sono i caratteristici depositi Poly-Q, e il DNA anormale Tar legame proteina-43 e fusi in proteine ​​sarcoma (FUS) sono depositati in demenze frontotemporali. È importante sottolineare che per PD, mutazioni del gene α-syn sono stati trovati a cause autosomica dominante PD 6-11. Inoltre, α-syn gene triplicazione 12 e duplicazione 13 causa anche PD familiare collegando così aumentata espressione α-syn ai meccanismi patogenetici del PD. In particolare, i casi PD sia sporadici e familiari ospitano depositi anormali di α-syn patologia 14. Gli attuali trattamenti disponibili per il PD sono solo palliativi e non hanno effetto sulla necessità di arrestare o ritardare la progressione della malattia inesorabile. α-syn è abbondantemente espresso nel cervello umano e che costituisce circa l&#39;1% del totale delle proteine ​​del cervello. E &#39;presente in particolare all&#39;interno dei neuroni, ma può esistere anche se in quantità inferiori all&#39;interno delle cellule gliali. Un punto controverso è la struttura nativa di α-syn che può esistere come monomero casuale 15 o come tetramero piegata 16. Durante la malattia, α-syn cambia la sua conformazione che consente di ottenere misfolded e questo processo è pensato per essere la causa della malattia pathogeNesis. Nonostante diversi anni di indagini gli aspetti fisiopatologici della α-syn e la malattia, le cause esatte dei meccanismi della malattia sono rimasti inafferrabile 14. Gli studi che utilizzano analisi post-mortem del cervello parkinsoniani hanno finora fornito indizi importanti per quanto riguarda la biologia normale e anormale di α-syn sia in sporadici PD e anche PD associata a mutazioni del gene LRRK2 17-22. Qui, un protocollo di estrazione biochimico (vedi schema presentato in Figura 1) per i depositi alfa-syn sempre insolubili dal post-mortem di tessuto cerebrale umano PD che ospitano aggregati α-syn varia misura è stata descritta. Questa tecnica può anche essere adattato con modifiche in composizioni tampone per studiare proteine ​​aggregate da altre malattie neurodegenerative 23,24 e anche da animali transgenici tessuto cerebrale 25-27. La considerazione principale per gli adeguamenti sono le differenze di solubilità e gli importi totali delle rispettive proteine ​​alcune delle quali sono principalmente nucleare e potrebbe essere necessario buffer alto contenuto di sale per l&#39;estrazione ottimale, come indicato per FUS 28.

<table><tbody><tr><td>Tris-HCL</td><td>Sigma</td><td>T5912</td><td></td></tr><tr><td>cloruro di sodio</td><td>VWR</td><td>27800.291</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Fluka</td><td>71727</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma</td><td>U5378</td><td></td></tr><tr><td>Compresse inibitore della proteasi&nbsp;</td><td>Roche</td><td>04 693 116001</td><td></td></tr><tr><td>Compresse di inibitori della fosfatasi&nbsp;</td><td>Roche&nbsp;</td><td>04 906 837001</td><td></td></tr><tr><td>Compresse saline tamponate con fosfato&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Interpolazione-20&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MOPS SDS tampone di corsa</td><td>Invitrogen</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE tampone di trasferimento</td><td>Invitrogen</td><td>NP0006-1</td><td></td></tr><tr><td>Membrana Hybond-P&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN303F</td><td></td></tr><tr><td>carta da filtro Whatman 3MM</td><td>Sigma</td><td>WHA30306185</td><td></td></tr><tr><td>Bis-tris gel 4-12%&nbsp;</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td></td><td></td>NP0322BOX</tr><tr><td>Supersignal West Pico Substrato chemiluminescente</td><td>Pierce</td><td>34080</td><td></td></tr><tr><td>Kit di analisi delle proteine Bio-RAD DC&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0112</td><td></td></tr><tr><td>Provette in policarbonato Beckman a parete spessa</td><td>Beckman</td><td>355630</td><td></td></tr><tr><td>Tampone di stripping Western blot</td><td>Thermo scientific</td><td>46430</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo primario Syn-1 (monoclonale di topo)</td><td>BD Biosciences</td><td>610786</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo primario beta-actina (monoclonale di topo&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A5441</td><td></td></tr><tr><td>HRP capra coniugata anticorpo secondario di topo</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2031</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Instrument</td><td>Company</td><td>Rotore / modello n.</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuga da banco Optima Max</td><td>Beckman</td><td>MLA-80</td><td></td></tr><tr><td>Sonicatore</td><td>Sistemi di calore</td><td>XL20-20</td><td></td></tr><tr><td>Omogeneizzatore</td><td>Jenke e Kunkel</td><td>TP18/10</td><td></td></tr></tbody></table>

estrazione sequenziale di solubile e insolubile sinucleina alfa da brains parkinsoniani

Sequential Extraction of Soluble and Insoluble Alpha-Synuclein from Parkinsonian Brains

Alpha-synuclein (α-syn) proteina è abbondantemente espresso prevalentemente all&#39;interno dei neuroni, ed esiste in diverse forme - monomeri, oligomeri, tetrameri e fibrille. Durante la malattia, α-syn subisce variazioni conformazionali per formare oligomeri e alti aggregati peso molecolare che tendono a rendere il più proteina insolubile. Anormalmente aggregati α-syn è una caratteristica neuropatologici della malattia di Parkinson (PD), la demenza con corpi di Lewy (DLB) e l&#39;atrofia multisistemica (MSA). Caratterizzazione e l&#39;analisi dei tamponi insolubili alfa-syn utilizzando con crescente forza detergente e ultracentrifugazione ad alta velocità biochimico fornisce un potente strumento per determinare lo sviluppo della patologia α-syn associata a progressione della malattia. Questo protocollo descrive l&#39;isolamento di sempre insolubile / aggregato α-syn dal tessuto post mortem cervello umano. Questa metodologia può essere adattata con modifiche a studi di α normale e anormalebiologia -syn in modelli animali transgenici ospitano diverse mutazioni alfa-syn così come in altre malattie neurodegenerative che caratterizzano i depositi fibrillari aberranti di proteine ​​legate alle rispettive patologie.

TBS, SDS e urea solubile proteine ​​estratte da gangli basali seguendo il protocollo illustrato nella Figura 1 sono stati analizzati su gel e immunoblotted con il Syn-1 monoclonale α-syn anticorpo primario. Le frazioni solubili TBS visualizzata la presenza di monomero α-syn (~ 14 specie KDa) nei casi di PD e controllo esaminati (Figura 2A). Le frazioni solubili SDS ha anche mostrato abbondante monomerico α-syn in tutti e tre i sottotipi di casi studiati come visualizzato nella bassa macchia di esposizione (Figura 2C). I casi PD hanno anche mostrato maggiori peso molecolare (MW) specie alfa-syn come si è visto in alto macchia di esposizione, che sono suscettibili di essere oligomeri (Figura 2C). Le frazioni solubili urea da casi di PD hanno mostrato elevate quantità di monomeri alfa-syn, oligomeri e specie aggregate rispetto per controllare casi. I casi neocorticale PD idiopatica dimostrano una maggiore quantità di AGGREG<html> specie ATED α-syn, mentre i casi limbiche mostrano livelli intermedi di insolubile α-syn. Entrambe le SDS e urea frazioni di casi di Parkinson idiopatica dimostrano livelli variabili di prodotti alfa-syn troncati a 12 kDa e 6 kDa come descritto 20. Al contrario, i casi di controllo non hanno mostrato alcun α-syn insolubili o aggregati (figura 2E). Misure semi-quantitative densità riflettono la quantità di carico LB come categoriesd con α-syn immunoistochimica dimostrare la natura insolubile di aggregati α-syn (Figura 2B, 2D, 2F) nei casi PD neocorticale e limbico. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53415/53415fig1.jpg" /> Figura 1. Schema di α insolubile procedura di estrazione -syn.rget = &quot;_ blank&quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53415/53415fig2.jpg" /> Figura 2. immunoblot rappresentativi dei livelli -syn alfa da PD e controllo tessuti umani. TBS, SDS e frazioni solubili urea da gangli basali (una regione che ospita α-syn patologia nei casi PD) dei casi di Parkinson idiopatica e neurologicamente normali (controllo) cervelli sono stati analizzati per la presenza di α-syn utilizzando Western immunoblot. 10 ug di proteina stato caricato su ogni corsia. In TBS frazioni (A), principalmente monomeri α-syn sono presenti in tutti i casi. In SDS frazioni (C), alcuni oligomeri di α-syn sono visti con monomeri principalmente nel tessuto PD. In frazioni di urea (C), monomeri, oligomeri e aggregata α-syn sono variamente espresse nel caso PD reflecting loro rispettivo carico LB. I campioni di controllo neurologicamente normali mostrano la presenza di piccole quantità di monomero α-syn. Si prega di notare eventuali prodotti di degradazione di α-syn sono visti in alcuni dei casi con elevato carico LB. La freccia testa continua rappresenta la forma monomerica di α-syn. Il * forse rappresenta una forma C-terminale troncata di α-syn come descritto in precedenza 20,26. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53415/53415fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Caso </td><td> Sesso </td><td> all&#39;età di anni </td><td> ritardo di post-mortem (ore) </td><td> pH del tessuto </td></tr><tr><td> Neocorticale 1 </td><td> M </td><td> 82 </td><td> 40 </td><td> 6.3 </td></tr><tr><td> Neocorticale 2 </td><td> F</td><td> 75 </td><td> 35.3 </td><td> 6.4 </td></tr><tr><td> Limbico 1 </td><td> M </td><td> 81 </td><td> 28.5 </td><td> 6.2 </td></tr><tr><td> Limbico 2 </td><td> F </td><td> 79 </td><td> 36.5 </td><td> 6.2 </td></tr><tr><td> Controllo 1 </td><td> M </td><td> 80 </td><td> 38 </td><td> 6.1 </td></tr><tr><td> Controllo 2 </td><td> F </td><td> 83 </td><td> 32.5 </td><td> 6.3 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. demografia limitati dei casi utilizzati

Qui, presentiamo un protocollo per l'isolamento di alfa-sinucleina (α-syn) sempre più insolubile/aggregata da tessuto cerebrale umano post-mortem. Attraverso l'utilizzo di tamponi con forza detergente crescente e tecniche di ultracentrifugazione ad alta velocità, è possibile esaminare le proprietà variabili dell'aggregazione α-syn in tessuti malati e non malati.

Estrazione sequenziale di solubile e insolubile sinucleina alfa da Brains parkinsoniani

Alpha-synuclein (&#945;-syn) protein is abundantly expressed mainly within neurons, and exists in a number of different forms - monomers, tetramers, ...

L'obiettivo generale di questa metodologia è estrarre l'alfa-sinucleina solubile e insolubile da cervelli post-mortem di pazienti affetti da Parkinson. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nello studio della malattia di Parkinson. Il principale vantaggio di questa tecnica è che si tratta di un approccio relativamente semplice che utilizza reagenti e strumenti di laboratorio comuni.Dopo aver preparato le soluzioni e i tamponi necessari, iniziare ponendo un campione di 0,5 grammi di tessuto dei gangli della base congelato in una piccola capsula di Petri. Utilizzare una lama di bisturi sterile per tritare rapidamente il tessuto in frammenti quadrati di un millimetro. Raccogliere il tessuto tritato in un tubo da 15 millilitri e aggiungere 10 volumi di TBS 1X freddo di ghiaccio al tubo.Omogeneizzare i campioni utilizzando un omogeneizzatore meccanico a 20.000 giri al minuto per 10 secondi. Successivamente, raffreddare in ghiaccio per due minuti. Ripetere l'omogeneizzazione per tre volte, raffreddando in ghiaccio ogni volta.Centrifugare l'omogenato a 10.000 gs per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire il sopranatante grezzo dell'omogenato in provette per centrifuga in policarbonato e centrifugare a 100.000 gs per un'ora a quattro gradi Celsius. Trasferire il sopranatante in provette raffreddate su ghiaccio e conservare questa frazione come frazione solubile in TBS.Lavare con cinque volumi di tampone TBS 1X e centrifugare a 100.000 gs per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Aspirare e scartare il soprannatante. Ripetere quindi il lavaggio.Il lavaggio accurato dei pellet tra i passaggi di ultracentrifugazione è fondamentale per il successo di questa procedura. Dopo aver lasciato raggiungere ai campioni una temperatura di 10 gradi Celsius per evitare la precipitazione dell'SDS, aggiungere cinque volumi di TBS-SDS 1X e risospendere il pellet finale sonificando per 10 secondi a 20 kilohertz a temperatura ambiente. Ultracentrifugare a 100.000 ×g per 30 minuti a 25 gradi Celsius.Dopo l'ultracentrifugazione, trasferire il surnatante in provette fredde su ghiaccio e conservarlo come frazione solubile in SDS. Aggiungere cinque volumi di buffer 1X TBS-SDS a temperatura ambiente al pellet e centrifugare a 100.000 ×g per 15 minuti a 25 °C. Scartare il buffer di lavaggio e ripetere l'operazione di lavaggio.Dopo aver eliminato il soprannatante, aggiungere 50 microlitri di 1X TBS-SDS-Urea e solubilizzare utilizzando un sonicator impostato a 20 kilohertz per 10 secondi. Etichettare questo campione come frazione solubile in urea. È essenziale assicurarsi accuratamente che tutte le proteine insolubili siano estratte durante la procedura.Diluire i campioni TBS-SDS-Urea uno a uno con tampone TBS 1X per renderli compatibili con i reagenti del saggio proteico, e determinare il contenuto totale di proteine in ciascuna frazione utilizzando un kit commerciale per il dosaggio delle proteine secondo il protocollo del produttore. Aliquotare i campioni in aliquote da 20 microlitri contenenti il 10% di glicerolo per ridurre i cicli futuri di congelamento-scongelamento, e conservare a meno 80 gradi Celsius. Caricare 10 microlitri degli estratti TBS, TBS-SDS e TBS-SDS-Urea insieme a un marcatore di peso molecolare su gel di poliacrilamide Bis-Tris al quattro-dodici percento con dieci pozzetti, utilizzando MOPS come tampone di corsa e tecniche standard.Eseguire l'elettroforesi a 200 volt per un'ora, oppure fino a quando il colorante blu del buffer di caricamento ha raggiunto il fondo del gel. Inumidire una membrana in nylon in metanolo al 100%, quindi immergerla in buffer di trasferimento contenente metanolo al 20%. Effettuare un segno identificativo sulla membrana per determinare il lato delle proteine e l'orientamento dei marcatori di peso molecolare.Posizionare il gel tra la membrana e carta filtrante bagnata. Eseguire il trasferimento per due ore a 40 volt. Bloccare in soluzione di BSA al 5% in PBS-T 1X per 30 minuti con agitazione a 70 rpm per prevenire il legame non specifico dell'anticorpo primario alla membrana.Rilevare la proteina sul blot mediante incubazione con sei millilitri dell'anticorpo primario anti-alfa-sinucleina Syn-1, diluito 1:750 in PBS-T, durante la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, lavare la membrana con PBS-T 1X per tre volte, cinque minuti ogni volta. Quindi incubare il blot con l'anticorpo secondario coniugato con HRP, diluito 1:2.000 in PBS-T, per 30 minuti.Lavare la membrana come in precedenza con PBS-T 1X. Immergere le membrane nella soluzione di chemiluminescenza avanzata seguendo le istruzioni del produttore in una stanza buia. Coprire le membrane con pellicola trasparente e rilevare il segnale mediante autoradiografia.Dopo l'acquisizione delle immagini, incubare la macchia western con sei millilitri di soluzione di rimozione per macchie western per 10 minuti con agitazione costante per rimuovere il segnale dell'anticorpo anti-alfa-sinucleina. Ripetere la procedura per la macchia western per rivelare la membrana con l'anticorpo primario anti-beta-actina a un'uscita di uno a 8.000. Acquisire l'immagine finale e convertirla in un'immagine Tiff, quindi misurare le densità utilizzando NIH ImageJ ai fini della quantificazione.Le seguenti immagini mostrano immunoblot rappresentativi dei livelli di alfa-sinucleina provenienti da tessuto del ganglio basale umano di pazienti con malattia di Parkinson (PD) e da tessuto di controllo. Le frazioni solubili in TBS, SDS e urea sono state analizzate per la presenza di alfa-sinucleina mediante immunoblotting western. In ogni corsia è stato caricato 10 milligrammi di proteina.Nella frazione TBS, i monomeri dell'alfa-sinucleina sono presenti in tutti i casi. L'asterisco potrebbe rappresentare una forma troncata a livello della coda C-terminale dell'alfa-sinucleina. Nella frazione SDS, alcuni oligomeri dell'alfa-sinucleina sono visibili insieme ai monomeri, indicati dalla freccia piena nel tessuto del PD.Nella frazione dell'urea, monomeri, oligomeri e forme aggregate di alfa-sinucleina sono espressi in modo variabile nei casi di DP, riflettendo il rispettivo carico di corpi di Lewy. I campioni di controllo neurologicamente normali mostrano la presenza di soltanto piccole quantità di alfa-sinucleina monomerica. Una volta appresa, questa tecnica di estrazione proteica può essere completata entro una giornata lavorativa, seguita dal saggio immunoblotting western il giorno successivo, se eseguita correttamente.Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia dei corpi di Lewy per esplorare specie di alfa-sinucleina insolubili e aggregate nei tessuti umani patologici e nei modelli animali in vivo. Non dimenticare che lavorare con tessuto umano non fissato richiede misure precauzionali, e guanti e camici da laboratorio devono essere indossati durante tutte le procedure di manipolazione.

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Questo video mostra un test di immunofluorescenza per rilevare aggregati di alfa-sinucleina specifici per malattie neurodegenerative su sezioni di biopsia cutanea. L'immunocolorazione libera è impiegata per marcare in modo fluorescente l'idrolasi carbossil-terminale e gli aggregati di alfa-sinucleina nei neuroni dermici. Al microscopio confocale, le cellule con fluorescenza da entrambi gli anticorpi indicano la presenza di aggregati di alfa-sinucleina nei neuroni dermici.

Un test di immunofluorescenza per rilevare gli aggregati di alfa-sinucleina in una sezione di biopsia cutanea

Questo video dimostra il processo di quantificazione dell'accumulo di alfa-sinucleina nei neuroni dopaminergici embrionali di topo pre-trattati con fibrille preformate di alfa-sinucleina. Descrive i passaggi per fissare, colorare e quantificare i neuroni dopaminergici contenenti aggregati di alfa-sinucleina utilizzando l'immunofluorescenza.

Studio dell'accumulo di alfa-sinucleina nei neuroni della dopamina embrionale primaria di topo

Fonte: Bétemps, D., et al.,  Rilevamento della α-sinucleina associata alla malattia mediante ELISA potenziato nel cervello di topi transgenici che sovraesprimono la α-sinucleina umana mutata A53T. J. Vis. Exp. (2015). Questo video mostra la procedura per rilevare la proteina α-sinucleina associata alla malattia neurodegenerativa nel tessuto cerebrale di topi transgenici utilizzando ELISA. Le fasi includono l'omogeneizzazione dei tessuti, la centrifugazione e il rilevamento ELISA della proteina...

Rilevamento della proteina associata alla malattia neurodegenerativa α-sinucleina mediante ELISA

Utilizzando la microscopia a forza atomica in combinazione con la tecnologia di biopanning abbiamo creato un sistema di biopanning negativo e positivo per acquisire anticorpi contro varianti proteiche specifiche per la malattia presenti in qualsiasi materiale biologico, anche a basse concentrazioni.  Siamo riusciti a ottenere anticorpi contro le varianti della proteina TDP-43 coinvolte nella sclerosi laterale amiotrofica.

Novel microscopia a forza atomica Based biopanning per isolamento di Morfologia reagenti specifici contro TDP-43 varianti di Sclerosi Laterale Amiotrofica

Viene descritta un'ELISA che offre un approccio quantitativo innovativo. Rileva specificamente l'α-sinucleina associata alla malattia (αSD) in un modello di topo transgenico (M83) di sinucleinopatia utilizzando diversi anticorpi contro la forma αS fosforilata nella Ser129 o la parte C-terminale della proteina.

Il rilevamento della malattia associata α-sinucleina da avanzato ELISA nel cervello di topi transgenici A53T umano Mutato α-sinucleina

L'obiettivo del presente protocollo è quello di fornire un sistema basato su cellule che replica la formazione dell'alfa-synuclein aggrega in vivo. Le inclusioni intracellulari dell'alfa-synuclein sono seminate in neuroni primari di interiorizzazione e propagazione di esogeno somministrato del microsomi nativo con alfa-synuclein aggregati isolati da topi transgenici malato dell'alfa-synuclein.

Somministrazione esogena di microsomi-collegato dell'alfa-synuclein aggregati di neuroni primari come un modello potente delle cellule di formazione di fibrille

Qui, presentiamo un protocollo per un test di immunofluorescenza indiretta a fluttuazione libera sulle sezioni di biopsia cutanea che consente l'identificazione di varianti di conformazione specifiche della malattia di sinucleina alfa coinvolte nella malattia di Parkinson e proteine multiple del sistema nervoso periferico.

Targeting Alpha Synuclein Aggregati in cutaneous periferici nervose fibre nervose da Pro(Enunciante autofluorescenza libera)

L'obiettivo di questo articolo è quello di delineare i passi necessari per la generazione di fibrille da alfa-sinucleina monomerica, successivo controllo di qualità, e l'uso dei fibrili preformati in vivo.

Generazione di fibrille preformate alfa-sinucleina da monomeri e uso in vivo

Qui, vi presentiamo un protocollo dettagliato per studiare l'accumulo neuronale di sinucleina nei neuroni primari della dopamina del topo. Gli aggregati di sibbonucleina fosfolati nei neuroni sono indotti con fibrille pre-formate e sinucleina. L'imaging automatizzato di cellule etichettate immunofluorescentmente e l'analisi imparziale dell'immagine rendono questo protocollo robusto adatto per lo screening della produttività medio-alta di farmaci che inibiscono l'accumulo di sinucleina.

Studio pre-formato Fibril indotta accumulazione di z-sinucleina in primario embrionale Midbrain Dopamine Neuroni

Questo lavoro analizza la dose vettoriale e il tempo di esposizione necessari per indurre neuroinfiammazione, neurodegenerazione e compromissione motoria in questo modello preclinico di malattia di Parkinson. Questi vettori che codificano la α-sinucleina umana vengono consegnati nella substantia nigra per ricapitolare la patologia sinucleina associata al morbo di Parkinson.

Analisi del modello murino della malattia di Parkinson indotto da vettori virali adeno-associati che codificano la α-sinucleina umana

Il presente protocollo descrive un metodo per la somministrazione intranasale di aggregati di α-sinucleina. Questo metodo fornisce informazioni sulla propagazione della α-sinucleina dalla mucosa olfattiva al bulbo olfattivo nella malattia di Parkinson.

Tecnica per la somministrazione intranasale di aggregati di α-sinucleina

Impara ad estrarre sinucleina alfa solubile e insolubile da tessuto cerebrale post-mortem di pazienti con Parkinson. Questo metodo biochimico utilizza ultracentrifugazione e western blot per analizzare l'aggregazione proteica.

Estrazione sequenziale di solubile e insolubile sinucleina alfa da Brains parkinsoniani

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