Name: Ex Cultura Vivo del Chick cerebellare fette e spazialmente mirata elettroporazione di granuli precursori delle cellule (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: Impara l'elettroporazione mirata dello strato granulare esterno del cervelletto di pollo ex vivo. Questo metodo consente di studiare morfologia e comportamento delle cellule granulose durante lo sviluppo cerebellare.

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Il metodo presentato in questo articolo è nata dal lavoro finanziato dalla BBSRC BB / I021507 / 1 (TB, RJTW) e un dottorato studentship MRC (MH).

Nota: Tutti gli esperimenti sono stati effettuati con conformità a King College di Londra, Regno Unito e le linee guida per la cura degli animali nel Regno Unito Home Office. 1. La dissezione di e14 cervelletto <ol><li> Incubare le uova marroni embrionate di gallina a 38 ° C e 14 ° giorno embrionale. </li><li> Utilizzando le forbici uovo decapitano embrione di pollo in ovo e rimuovere la testa di una capsula di Petri contenente ghiaccio PBS freddo (Figura 1A). </li><li> Utilizzando pinze standard, fare incisioni dietro ogni occhio tutto il percorso attraverso il tessuto, rimuovere gli occhi e mascella superiore. Effettuare una seconda incisione tutto il percorso attraverso la faringe rimuovere la mascella inferiore (Figura 1B). </li><li> Utilizzando pinze standard, rimuovere tutta la pelle dalla superficie del cranio con il peeling via (Figura 1C) e rimuovere le ossa frontali e parietali, rivelando cervello. </li><li> Dal punto di vista ventrale, rimuovere faringeo cartilagine e mesenchima ausiliario. </li><li> Da un lato dorsale, attentoly rimuovere mesenchima dorsale per romboencefalo facendo attenzione a non danneggiare pia, e tutto il cervello separato (Figura 1D). </li><li> Effettuare un&#39;incisione tutto il percorso attraverso il tessuto tra mesencefalo e rombencefalo rombencefalo e separato tra cervelletto (Figura 1E). </li><li> Facendo incisioni tutto il percorso attraverso il tessuto ad entrambe le giunzioni laterali del cervelletto e piatto alare del hindbrain, rimuovere tutta cervelletto, avendo cura di mantenere l&#39;integrità del pia tutta dissezione (Figura 1F). Rimuovere la formazione plesso coroideo (Figura 1G). </li><li> Spostare il cervelletto sezionato in freddo ghiaccio HBSS. </li></ol> 2. Fetta Cultura della E14 cervelletto <ol><li> Trasferire la cervelletto alla piattaforma sterile di un Tissue Chopper utilizzando una spatola o un 3 ml pipetta Pasteur con la punta asportate per allargare l&#39;apertura. Rimuovere il liquido in eccesso con una pipetta. </li><li> Tagliare tutto intero cervelletto in tha richiesto orientamento a 300 micron di spessore utilizzando il chopper tessuto impostare una velocità di taglio al 50% del massimo. L&#39;integrità dei tessuti è più facilmente conservato in sezione sagittale; tuttavia, l&#39;orientamento è anche un fattore importante per l&#39;analisi delle cellule (cellule di Purkinje dendriti sono sagittalmente allineati, mentre assoni delle cellule granuli corrono trasversalmente, perpendicolare al piano di dendriti di cellule di Purkinje). </li><li> Usando una pipetta Pasteur 3 ml, coprire il cervelletto tagliato a freddo ghiaccio HBSS. </li><li> Trasferire le fettine in HBSS a una capsula di Petri 60 millimetri contenente ghiaccio fresco HBSS freddo con un 3 ml pipetta Pasteur con la punta tagliata. </li><li> Sotto un microscopio da dissezione illuminato con una sorgente di luce a fibre ottiche, garantire la separazione delle singole porzioni utilizzando pinze orologeria. Identificare le fette da elettroporate, basato sulla loro integrità dei tessuti e la posizione medio-laterale. Nota: Ogni dissezione dall&#39;embrione attraverso tagliare incubazione in terreno di coltura dura circa 10-20 minuti a seconda upoesperienza n. Eseguire dissezioni una alla volta a garantire che cervelletti spendere quantità minima di tempo tra decapitazione ed ex vivo della cultura. </li></ol> 3. elettroporazione di fette <ol><li> Costruire una camera di elettroporazione fissando l&#39;anodo di un elettroporatore alla base di una capsula di Petri 60 mm con nastro isolante. Aggiungere circa 1 ml di HBSS per coprire l&#39;elettrodo. </li><li> Collocare un inserto 0,4 micron cultura sopra dell&#39;elettrodo rivestito in HBSS. Lasciare l&#39;inserto cultura per riposare sull&#39;elettrodo assicurandosi che c&#39;è sempre il contatto tra l&#39;inserto e l&#39;elettrodo. Nota: In questa configurazione, l&#39;inserto di coltura con le fette poggerà sulla superficie della soluzione, mantenendo il circuito ma permettendo il targeting spaziale del catodo. </li><li> Fette identificati di trasferimento (fino a cinque per inserto cultura) sui inserto cultura con 3 ml pipetta Pasteur con la punta tagliata. Separati e lasciare riposare su inserto cultura in un sagittAl orientamento. </li><li> Usando una pipetta, rimuovere l&#39;eccesso di HBSS in modo che le fette siano più immersi in soluzione. </li><li> Usando una pipetta punta P10, pipetta DNA (ad una concentrazione di 1 mg / mL) diluito con il 20% veloce verde sulla superficie della regione di destinazione di una fetta. 20% verde veloce assicura soluzione di DNA viscosa e impedisce proibitivamente ampia dispersione del DNA. Aggiungere circa 5 DNA microlitri / veloce soluzione verde per ogni sezione (Figura 2B). </li><li> Posizionare il catodo, nel tessuto mirato desiderato e l&#39;elettroporazione con 3 x 10 V, 10 impulsi di durata msec. Evitare il contatto diretto del catodo con il tessuto. Invece, usate tensione superficiale del liquido per mantenere conduttanza (posizionare il catodo più vicino al tessuto come possibile senza toccare il tessuto). </li><li> Ripetere la consegna del DNA ed elettroporazione di più regioni di EGL su ogni singola porzione del cervelletto, se lo desideri. </li><li> Al termine di elettroporazione, cultura trasferimento Insert a 30 mm piastra di Petri. </li><li> Per ogni cultura, aggiungere 1 ml di terreno di coltura pre-riscaldato (basale medio Aquila, 0,5% (w / v) D - (+) - glucosio, 1% supplemento B27, 2 mM di L-glutammina, 100 U / ml di penicillina, 100 ug / ml di streptomicina) sotto l&#39;inserto cultura tale che l&#39;inserto cultura è in contatto con il mezzo, ma fette non sono immersi in esso. </li><li> Incubare culture a 37 ° C / 6% CO 2 fino a 3 giorni. Sostituire tutto il terreno di coltura ogni 24 ore con terreno fresco pre-riscaldato. </li><li> Dopo coltura, fissare fette su inserti coltura per 1 ora a 4% paraformaldeide (o O / N a 4 ° C) in un piatto fresco 30 mm senza mezzi di coltura. </li></ol> 4. Imaging di cerebellari Fette <ol><li> Dopo fissazione, lavare fette 3 volte per 5 minuti in PBS. </li><li> Utilizzando una lama di rasoio, sezionare ogni fetta cerebellare elettroporate e colta dall&#39;inserto cultura tagliando intorno la fetta e la rimozione della fetta e la regione di inserto viene rispettato. FareNon tentare di rimuovere fetta dalla superficie dell&#39;inserto cultura. </li><li> Montare fette in circa 1 ml di mezzo di montaggio contenente DAPI (se lo si desidera) sotto un vetrino facendo attenzione a non introdurre bolle, e immagine utilizzando scansione laser microscopia confocale. Nota: parametri di imaging possono essere variati secondo le costrutti elettroporate, ea discrezione del singolo utente. </li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il protocollo qui riportato descrive un metodo per dissezione, electroporating e coltura fette di embrionale Giorno 14 cervelletto dal pulcino. Questo protocollo permette di targeting di elettroporazione per piccole regioni focali della EGL, compreso isolato di mira singoli lobi cerebellari. Consente analisi genetica e di imaging ad alta risoluzione e convenienza, e ad un basso costo rispetto alle tecniche consolidate nei roditori 43-47. Tale analisi non è attualmente possibile in vivo a causa del lu...

Il cervelletto si trova all&#39;estremità anteriore del romboencefalo ed è responsabile per l&#39;integrazione di elaborazione sensoriale e motore nel cervello maturo e regolazione dei processi cognitivi elevati 1. Nei mammiferi e uccelli, possiede una morfologia complessa ed è fortemente lamellare, un prodotto di ampio amplificazione transito dei progenitori durante lo sviluppo che produce oltre la metà dei neuroni nel cervello adulto. Il cervelletto è stato oggetto di studio per neurobiologi da secoli e in epoca molecolare ha anche ricevuto notevole attenzione. Ciò si riferisce non solo alla sua intrinsecamente interessante biologia, ma anche per il fatto che essa è fortemente implicata nella malattia umana, compresa malattie genetiche dello sviluppo come disturbi dello spettro autistico 2 e più visibile il tumore cerebellare, il medulloblastoma 3, che è il cervello pediatrico più diffuso tumore. È importante sottolineare che si tratta di un ottimo sistema modello entro which per studiare l&#39;allocazione destino e neurogenesi durante lo sviluppo cerebrale 4. Negli ultimi anni, è stato anche affermato come sistema modello per lo studio comparato di sviluppo del cervello, a causa della grande diversità di forme cerebellari visto attraverso la filogenesi dei vertebrati 5-10. Il cervelletto si sviluppa dalla metà dorsale del rhombomere 1 in romboencefalo 11 ed evolutivamente comprende due popolazioni progenitrici primari, il labbro rombico e zona ventricolare. Il labbro romboidale si estende intorno alla regione dorsale del neuroepitelio del romboencefalo al confine con la lamiera del tetto. E &#39;il luogo di nascita dei neuroni eccitatori glutamatergici del cervelletto 12-14. La zona ventricolare suscita le inibitorie GABAergiche neuroni del cervelletto, il più prominente dei grandi neuroni Purkinje 14,15. Più tardi, in fase di sviluppo (da circa 13,5 giorno embrionali nel topo; e6 in pulcino 16), glutamatergico Progenmodifiche ai contenuti migrano tangenzialmente dal labbro romboidale e formano uno strato pial di progenitori: una zona progenitore secondaria chiamato lo strato esterno dei granuli (EGL). È questo livello che subisce l&#39;ampia amplificazione di transito che conduce l&#39;enorme numero di neuroni granulari presenti nel cervello maturo. Proliferazione nel EGL è stata a lungo legata alla posizione sub-pial che deriva dalla migrazione tangenziale dalla rombico labbro 17, con l&#39;interruttore di uscita del ciclo cellulare e la differenziazione neuronale di progenitori essendo associato con la loro uscita dallo strato esterno EGL in mezzo EGL 18. Extensive migrazione tangenziale di cellule granulari post-mitotici in asse mediale-laterale si verifica nel mezzo ed interno EGL 19, prima finale migrazione radiale nello strato granuli interno della corteccia cerebellare maturo. La migrazione delle cellule dal labbro rombico sulla superficie cerebellare dipende segnalazione CXCL12 dalla pia 20-22 </sup&gt; E cellule granulari esprimono il recettore CXCR4 CXCL12. La loro migrazione tangenziale è quindi ricorda quello di tangenzialmente neocorticale popolazioni migranti interneuroni inibitori 23-25. Curiosamente, elettroni studi microscopici 17 hanno suggerito che le cellule EGL con una morfologia proliferativa mantenere il contatto piale, che collega il comportamento delle cellule con capacità proliferativa in un modo che ricorda i progenitori basali della corteccia dei mammiferi 26. Ciò si riflette nel summenzionato stratificazione della EGL in tre sottolivelli che sono definiti da distinti ambienti extracellulari e dove precursori dei granuli hanno genica distinto firme 18. Proliferazione di progenitori nel oEGL avviene con una normale distribuzione delle dimensioni clone tale che quando progenitori sono singolarmente geneticamente etichettati al termine dello sviluppo embrionale nel topo, danno luogo ad una media di 250-500 mediana postmitotici gneuroni ranule 27,28. Proliferazione dipende segnalazione SHH mitogenic dal sottostante Purkinje neuroni 29-32. La capacità di rispondere a SHH ha dimostrato di essere interamente dipendente cella autonoma espressione del fattore di trascrizione Atoh1, sia in vitro che in vivo 33 34,35. Allo stesso modo, l&#39;uscita del ciclo cellulare e la differenziazione ha dimostrato di essere dipendente dalla espressione del fattore di trascrizione a valle NeuroD1 36, che è probabilmente un repressore diretta di Atoh1 37. Nonostante questi progressi, e un notevole avanzamento nel decifrare la cellula base biologica di uscita ciclo cellulare 38-42, i meccanismi molecolari fondamentali (s) che sono alla base della decisione di uscire dal ciclo cellulare e la transizione da un progenitore di un neurone di differenziazione, e la associato postmitotici migrazione tangenziale nel EGL interno così come l&#39;interruttore dopoalla migrazione radiale, rimanere completamente sconosciuto. Questo è in gran parte a causa della intrattabilità sperimentale della EGL: si sta sviluppando tardi, e difficili da indirizzare geneticamente poiché molte delle stesse molecole neurogenici sono anche fondamentale precedenza nella vita dei precursori dei granuli al labbro romboidale. Per superare questo problema, numerosi autori hanno sviluppato in vivo e ex vivo elettroporazione come metodo per indirizzare il cervelletto postnatale nei roditori 43-48. Qui, la strada nell&#39;uso di ex vivo elettroporazione in pulcino per studiare la EGL, che rappresenta notevoli vantaggi in termini di costi e convenienza. Il nostro metodo di elettroporazione e ex vivo della cultura fetta di tessuto cerebellare pulcino utilizza tessuto sezionato dal giorno embrionale 14 pulcini al culmine di EGL proliferazione. Questo metodo permette di targeting genetico della EGL indipendentemente dal labbro romboidale e porranno le basi per la dissezione genetica della transizione da granuliprogenitore di postmitotici neurone granello nel cervelletto.

<table><tbody><tr><td>Tritatutto per tessuti McIlwain</td><td>Mickle Laboratory Engineering Ltd</td><td></td><td>Taglio a 300 &mu; m per ottenere i migliori risultati.</td></tr><tr><td>Aquila media basale (Gibco)</td><td>Life Technologies</td><td>41010-026</td><td></td></tr><tr><td>L-glutammina</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>penicillina/streptomicina</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>0,4 &mu; inserto per coltura</td><td>m Millipore</td><td>PICM0RG50</td><td></td></tr><tr><td>TSS20 Ovodyne electroporator&nbsp;</td><td>Intracel</td><td>01-916-02</td><td>Utilizzare 3 impulsi da 10 V, 10 msec per l'elettroporazione.</td></tr></tbody></table>

ex cultura vivo del chick cerebellare fette e spazialmente mirata elettroporazione di granuli precursori delle cellule

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

Lo strato cerebellare granuli esterno (EGL) è il sito del più grande ampliamento di transito nel cervello in via di sviluppo, e un ottimo modello per studiare la proliferazione e la differenziazione neuronale. Inoltre, le modifiche evolutive della sua capacità proliferativa sono stati responsabili per la drammatica espansione delle dimensioni del cervelletto nei amnioti, rendendo il cervelletto un ottimo modello per gli studi evo-devo del cervello dei vertebrati. Le cellule che costituiscono il EGL, progenitori dei granuli cerebellari, rappresentano anche una cella significativo di origine per medulloblastoma, il più comune tumore pediatrico neuronale. A seguito di transito amplificazione, precursori dei granuli migrano radialmente nello strato granulare interno del cervelletto, dove essi rappresentano la più grande popolazione neuronale nel cervello dei mammiferi maturo. In pulcino, il picco di EGL proliferazione avviene verso la fine della seconda settimana di gestazione. Al fine di indirizzare la modificazione genetica di questo strato ail picco della proliferazione, abbiamo sviluppato un metodo per la manipolazione genetica ex vivo attraverso elettroporazione di fette cervelletto da embrionali Giorno 14 embrioni di pollo. Questo metodo riassume alcuni aspetti importanti di in vivo granuli sviluppo dei neuroni e sarà utile per generare una conoscenza approfondita delle cerebellare proliferazione delle cellule dei granuli e la differenziazione, e quindi dello sviluppo del cervelletto, l&#39;evoluzione e la malattia.

Questa sezione illustra esempi di risultati che si possono ottenere con la fetta elettroporazione e la cultura del cervelletto da embrionale Giorno 14 pulcino. La dissezione del cervelletto è illustrato nella figura 1 e la camera di elettroporazione impostato è mostrato in Figura 2. Si dimostra che è possibile per l&#39;elettroporazione e con successo cultura fette cerebellare, che mantengono la loro struttura e morfologie cellulari ...

Lo strato granulare esterno cerebellare è il sito della più grande amplificazione transito nel cervello sviluppo. Qui, vi presentiamo un protocollo di indirizzare la modificazione genetica di questo strato al culmine della proliferazione usando ex vivo elettroporazione e la cultura di fette cerebellare da embrionali Giorno 14 embrioni di pollo.

Ex Cultura Vivo del Chick cerebellare fette e spazialmente mirata elettroporazione di granuli precursori delle cellule

The cerebellar external granule layer (EGL) is the site of the largest transit amplification in the developing brain, and an excellent model for studying ...

L'obiettivo generale di questa procedura è indirizzare una modificazione genetica allo strato germinale esterno del cervelletto del pollo per osservare, esaminare e modificare la morfologia e il comportamento delle cellule granulari in un contesto ex vivo. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della neurobiologia dello sviluppo, come ad esempio il modo in cui i progenitori neurali migrano, proliferano e si differenziano. Il principale vantaggio di questa tecnica è che offre notevoli benefici in termini di costo e praticità associati agli studi.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sullo sviluppo dei granuli nei polli, può essere applicato anche ad altri organismi modello come rettili e mammiferi. Per iniziare, posizionare uova di pollo marroni fecondate in un incubatore per uova a 38 gradi Celsius fino al raggiungimento del giorno embrionale 14. Al giorno embrionale 14, praticare un'apertura nell'uovo per esporre l'embrione e decapitare l'embrione di pollo in ovo.Posizionare la testa in una piastra di Petri contenente PBS freddo di ghiaccio sotto un microscopio stereoscopico. Utilizzare pinzette standard per praticare un'incisione dietro ciascun occhio fino in fondo al tessuto, rimuovendo gli occhi e la mascella superiore. Successivamente, praticare una seconda incisione attraverso la faringe per rimuovere la mascella inferiore.Successivamente, utilizzare pinzette standard per rimuovere la pelle dalla superficie del cranio staccandola. Quindi rimuovere le ossa frontale e parietale, esponendo il cervello da un aspetto ventrale. Rimuovere la cartilagine faringea e il mesenchima accessorio.Quindi posizionare il cervello con il lato dorsale rivolto verso l'alto e rimuovere con attenzione il mesenchima situato dorsalmente al cervelletto, avendo cura di non danneggiare il p. Successivamente, praticare un'incisione completamente attraverso il tessuto tra il mesencefalo e il romboencefalo per staccare il romboencefalo, inclusivo del cervelletto. Eseguire incisioni complete attraverso il tessuto in corrispondenza di entrambe le giunzioni laterali tra il cervelletto e la lamina alare del romboencefalo.Rimuovere l'intero cervelletto avendo cura di mantenere l'integrità della pie meningea durante tutta la dissezione. Infine, rimuovere il plesso coroideo in formazione e trasferire il cervelletto dissezionato in HBSS freddo su ghiaccio. Trasferire l'intero cervelletto sulla piattaforma sterile di un taglia tessuti utilizzando una spatola o una pipetta Pasteur da tre millilitri con la punta tagliata.Per allargare l'apertura, rimuovere qualsiasi liquido in eccesso utilizzando una pipetta. Impostare la velocità di taglio del tritacerebrale al 50% del suo valore massimo. Quindi tagliare il cervelletto nell'orientamento richiesto con uno spessore di 300 micrometri utilizzando una pipetta Pasteur da tre millilitri.Coprire il cervelletto affettato con HBSS freddo. Successivamente, trasferire l'HBSS e le fette in una capsula di Petri da 60 millimetri contenente 20 millilitri di HBSS ghiacciato utilizzando una pipetta di Pasteur da tre litri con la punta tagliata, quindi posizionare la capsula di Petri sotto un microscopio stereoscopico illuminato con una sorgente luminosa a fibra ottica. Utilizzare quindi una pinzetta da orologiaio per separare le singole fette di tessuto cerebrale e identificare le fette da elettroporare in base all'integrità del tessuto e alla posizione mediale-laterale.Costruire una camera di elettroporazione fissando l'anodo di un elettrodo alla base di una piastra di Petri da 60 millimetri. Aggiungere circa un millilitro di HBSS per coprire l'elettrodo utilizzando del nastro isolante. Successivamente, posizionare una cultura da 0,4 micrometri.Inserire sulla parte superiore dell'elettrodo ricoperto di HBSS. Utilizzare una pipetta di Pasteur da tre millilitri con la punta tagliata per trasferire le fette identificate, fino a cinque per inserto, sull'inserto di coltura. Successivamente, separare le fette e lasciarle depositare sulla coltura.Inserire in orientamento sagittale. Utilizzando una pipetta, rimuovere il mezzo in eccesso dalle fette cerebrali. Lasciare l'inserto appoggiato sull'elettrodo in modo che vi sia contatto tra l'inserto e l'elettrodo.In questa configurazione, l'inserzione per coltura con le sezioni sarà appoggiata sulla superficie del mezzo, mantenendo il circuito ma consentendo un indirizzamento spaziale della catodo. Utilizzando la punta di una pipetta P10, pipettare cinque microlitri di DNA diluito con il 20% di fast green sulla superficie di una regione mirata di ciascuna sezione.L'aggiunta di verde brillante assicura che la soluzione di DNA sia sufficientemente viscosa da impedire una larga dispersione del DNA. Posizionare quindi la catodo nel tessuto bersaglio desiderato e applicare l'elettrolisi ai campioni. Evitare il contatto diretto tra la catodo e il tessuto posizionando la catodo il più vicino possibile al tessuto senza toccarlo effettivamente.Ripetere l'elettroporazione in più regioni dello strato granulare esterno su ciascuna singola fetta cerebellare, secondo necessità. Al termine, trasferire l'inserto per coltura in una piastra di Petri da 30 millimetri. Aggiungere un millilitro di mezzo di coltura preriscaldato al di sotto dell'inserto per coltura.Assicurarsi che l'inserzione non galleggi sul mezzo. L'inserzione per coltura deve essere a contatto con il mezzo, ma le sezioni non devono essere immerse in esso. Incubare le colture fino a tre giorni, sostituendo tutto il mezzo di coltura.Sostituire il mezzo ogni 24 ore con mezzo fresco preriscaldato dopo la coltura. Trasferire le fette sugli inserti di coltura in una piastra da 30 millimetri contenente paraformaldeide al 4% per un'ora. Assicurarsi di aggiungere la paraformaldeide sopra la coltura.Inserire una volta fissato. Lavare le sezioni tre volte in PBS per cinque minuti ciascuna. Quindi utilizzare forbici oftalmiche per dissezionare ciascuna delle sezioni cerebellari elettroporate e coltivate dalla coltura.Inserire tagliando attorno a ciascuna sezione e rimuovendola insieme alla regione corrispondente dell'inserito. Non tentare di rimuovere la sezione dalla superficie dell'inserito. Montare le sezioni in circa un millilitro di un mezzo di montaggio a scelta sotto un coprioggetti, avendo cura di non introdurre bolle d'aria.Una volta che i vetrini sono asciutti, raccoglierli e acquisirne le immagini mediante scansione laser. Microscopia confocale per calbindina. Qui è mostrata la colorazione del tessuto cerebellare di E 14 in rosso dopo elettroporazione con un plasmide GFP di controllo a uno, due e tre giorni in coltura.La colorazione costante della calbindina mostra che l'integrità del tessuto viene mantenuta in coltura per almeno tre giorni in vitro. Qui sono mostrate immagini a basso ingrandimento di plasmidi che codificano per RFP e GFP, inseriti con successo mediante elettroporazione nello strato granulare esterno in diverse posizioni. Il plasmide GFP è stato indirizzato a una singola fessura, come indicato dall'asterisco.Viene mostrato un esempio in cui un costrutto che codifica per GFP, controllato da un enhancer 8 0 1, è stato elettroporato nel livello granulare esterno. L'espressione di 8 0 1 definisce i precursori delle cellule granulari all'interno del livello granulare esterno. Diverse morfologie cellulari sono chiaramente visibili a tre giorni in vitro e il comportamento cellulare può essere monitorato.Dopo aver visionato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come elettrificare singole sezioni cerebellari utilizzando una varietà di strumenti genetici per osservare e manipolare lo sviluppo delle cellule granulari. Dopo aver eseguito questa procedura, altri metodi come l'immunohistochimica possono essere effettuati per rispondere ad ulteriori domande riguardo l'integrità strutturale del tessuto e le posizioni relative di diversi tipi cellulari, come le cellule di Purkinje o le cellule gliali di Bergmann. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa due ore per una dozzina di embrioni di pollo, se eseguita correttamente.

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Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Qui vi presentiamo un metodo per isolare e cultura dei granuli cerebellari cellule progenitrici dei neuroni e neuroni granuli cerebellari da mouse postnatale.

Isolamento e la coltura di cellule post-Natal Neuron cerebellare granuli mouse progenitore e Neuroni

In questo video, eseguiamo l'elettroporazione di fette di cervelletto di embrioni di pollo con plasmidi genetici reporter. La tecnica facilita la visualizzazione dello sviluppo e della migrazione dei precursori delle cellule granulari per formare uno strato granulare.

Elettroporazione ex vivo di fette cerebellari di embrioni di pollo: un metodo per introdurre il DNA plasmidico che codifica la proteina fluorescente verde per visualizzare lo sviluppo delle cellule granulari

Il video mostra la preparazione delle fette del cervelletto. Mostra una procedura dettagliata per isolare il cervelletto da un embrione di pollo. Le fette vengono quindi preparate dal cervelletto sezionato utilizzando un tritatessuti per ulteriori analisi sperimentali.

Ottenere fette di cervelletto da un cervello di pulcino embrionale

Fonte: Chan, U., et al., Utilizzo dell'elettroporazione postnatale in vivo per studiare la morfologia dei neuroni dei granuli cerebellari e lo sviluppo delle sinapsi. J. Vis. Exp. (2021).Questo video dimostra l'analisi dello sviluppo dei neuroni dei granuli cerebellari mediante l'imaging di fette di tessuto cerebrale prefissate da topi etichettati con una proteina fluorescente, Acquisizione di immagini Z-stack ad alta risoluzione con un microscopio confocale e misurazione di parametri...

Visualizzazione della sinaptogenesi dei neuroni dei granuli cerebellari in diversi stadi di sviluppo

Fonte: Bénard, M., et al. Imaging ex vivo della migrazione postnatale delle cellule dei granuli cerebellari mediante macroscopia confocale. J. Vis. Exp. (2015)Questo video mostra un metodo macroscopico confocale per tracciare la migrazione ex vivo di cellule granulari in fette cerebellari da cervelli di ratto postnatale.

Imaging ex vivo della migrazione postnatale delle cellule dei granuli cerebellari mediante macroscopia confocale

Morfogenesi neuronale e la migrazione sono eventi cruciali alla base un corretto sviluppo del cervello. Qui, descriviamo i metodi per manipolare geneticamente colture di neuroni granulari del cervelletto e del cervelletto in via di sviluppo per la valutazione della morfologia e delle caratteristiche migratorie dei neuroni.

Manipolazione genetica delle cerebellare granuli neuroni<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em&gt; Per studiare neuronale Morfologia e migrazione

Durante lo sviluppo postnatale del cervelletto, le cellule granulari immature originate dalla zona germinale mostrano modalità distinte di migrazione per raggiungere la loro destinazione finale e per stabilire reti neuronali. Questo protocollo descrive la preparazione di fette cerebellari e l'approccio macroscopico confocale utilizzato per studiare i fattori che regolano la migrazione neuronale.

Ex Vivo Imaging di postnatale cerebellare granuli migrazione cellulare Utilizzando confocale macroscopia

Questo protocollo descrive un metodo semplice per isolare e neuroni di granulo cerebrale primario del mouse (CGNs) da cuccioli di 6-7 giorno vecchio, trasduzione efficiente di CGNs per la perdita e guadagno di funzione studia, la coltura e la modellazione eccitotossicità neuronale indotta da NMDA, basso-potassio-indotta delle cellule morte, danni al DNA e stress ossidativo utilizzando lo stesso modello di cultura.

Modellazione di morte neuronale e degenerazione in neuroni cerebellari del granello primario del Mouse

Studi convenzionali di perdita di funzione di geni mediante animali knockout sono stati spesso lunghe e costose. Basato su elettroporazione mutagenesi somatica CRISPR-mediata è un potente strumento per capire il gene funziona in vivo. Qui, segnaliamo un metodo per analizzare i fenotipi di knockout in cellule di proliferazione del cervelletto.

CRISPR-mediata di perdita di funzione di analisi in granuli cerebellari cellule utilizzando nell'Utero basati su elettroporazione trasferimento del Gene

Qui descriviamo un metodo per visualizzare la sinaptogenesi dei neuroni granuli nel cervelletto del topo nel corso dello sviluppo postnatale del cervello quando queste cellule perfezionano le loro strutture sinaptiche e formano sinapsi per integrarsi nel circuito cerebrale generale.

Utilizzo dell'elettroporazione postnatale in vivo per studiare la morfologia dei granuli cerebellari e lo sviluppo delle sinapsi

Qui, presentiamo un protocollo di elettroporazione riproducibile in vitro per la manipolazione genetica dei precursori delle cellule del granulo cerebellare primario (GCP) che è economico, efficiente e praticabile. Inoltre, questo protocollo dimostra anche un metodo semplice per lo studio molecolare delle vie di segnalazione primarie del riccio cilio-dipendenti nelle cellule GCP primarie.

Metodo di elettroporazione efficiente ed economico per studiare le vie di segnalazione cilium-dipendenti primarie nel precursore della cella del granulo

Impara l'elettroporazione mirata dello strato granulare esterno del cervelletto di pollo ex vivo. Questo metodo consente di studiare morfologia e comportamento delle cellule granulose durante lo sviluppo cerebellare.

Ex Cultura Vivo del Chick cerebellare fette e spazialmente mirata elettroporazione di granuli precursori delle cellule

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