Immunoprecipitazione della cromatina Saggio per la identificazione di Arabidopsis interazioni proteina-DNA In Vivo

Cromatina immunoprecipitazione è una tecnica potente per l'identificazione di DNA siti di Arabidopsis proteine ​​in vivo vincolante. Questa procedura include cromatina reticolazione e frammentazione, immunoprecipitazione con anticorpi selettivi contro la proteina di interesse, e l'analisi qPCR di DNA legato. Descriviamo un semplice saggio di ChIP ottimizzato per piante di Arabidopsis.

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di svelare le interazioni tra proteine e DNA nella cromatina delle cellule di arabidopsis. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia vegetale, come ad esempio quali geni sono regolati da un determinato fattore di trascrizione o quali modifiche del sistema sono associate a uno stato trascrizionale dei geni. Il vantaggio principale di questa tecnica è che attraverso la fase di reticolazione, è possibile fissare e catturare i cambiamenti nell'organizzazione della cromatina che si verificano durante lo sviluppo della pianta.

Sebbene questo metodo possa fornire una visione dell'interazione proteica nell'arabidopsis thaliana, può anche essere applicato a diversi ordini di piante e adattato ad altre specie vegetali. A dimostrare questa procedura saranno Dorota Komar e Alfonso Mouriz, due dottorandi nel nostro laboratorio. Dopo aver coltivato l'arabidopsis secondo il protocollo di testo, raccogliere 1,5 grammi di materiale vegetale in tubi da 50 millilitri e tenerli sul ghiaccio durante la reticolazione.

Quindi, utilizzare un ago riscaldato da un bruciatore da laboratorio per praticare piccoli fori nei coperchi delle provette. Aggiungere 40 millilitri di 1x pbs e 1,08 millilitri di formaldeide ai tubi. Avvitare i coperchi delle provette e posizionare le provette in un essiccatore.

Infiltrarsi con l'aspirapolvere per 10 minuti, quindi rilasciare con cautela l'aspirapolvere per evitare che la soluzione si formuli. Dopo aver miscelato il campione, ripetere le fasi di vuoto e miscelazione. Dopo l'infiltrazione, osservare il materiale vegetale e confermare che diventi leggermente traslucido e affondi sul fondo del tubo.

Aggiungere 2,5 millilitri di glicina a due molari a una concentrazione finale di 0,125 molari e applicare il vuoto per cinque minuti. Dopo aver rilasciato il vuoto, scartare la soluzione capovolgendo i tubi e lasciandola gocciolare attraverso i fori dei coperchi. Usa pbs per sciacquare le piantine due volte e risciacqua con acqua una volta.

Quindi asciugare le piantine su un tovagliolo di carta prima di utilizzare l'azoto liquido per congelare. Per ogni immunoprecipitazione, preparare 15 microlitri di microsfere magnetiche in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Aggiungere un millilitro di immunoprecipitazione della cromatina, o tampone di diluizione del chip, alle microsfere, mescolare ruotando e posizionare la provetta per microcentrifuga da 1,5 millilitri in una rastrelliera magnetica.

Dopo aver lasciato che le perline si attaccassero al magnete per circa un minuto, utilizzare un pipettman per rimuovere il surnatante prima di ripetere il lavaggio. Risospendere le perle in 200 microlitri di tampone di diluizione dei trucioli. Per l'immunoprecipitazione, aggiungere la quantità necessaria dell'anticorpo specifico a una delle due provette preparate per ogni pianta cieca.

Un fattore chiave per il successo dell'esperimento del chip è l'anticorpo scelto per l'immunoprecipitazione della proteina di interesse. Gli anticorpi sollevati contro il fattore di trascrizione delle piante possono essere utili per gli esperimenti con i chip, ma il siero deve essere accuratamente testato. Ad esempio, gli anticorpi controllati solo nell'analisi Western blot non sono necessariamente validi per il chip.

Come controllo negativo, aggiungere la stessa quantità di IGG aspecifico alla seconda provetta. Incubare le provette a quattro gradi Celsius durante la notte su una ruota rotante per consentire all'anticorpo di attaccarsi alle perline. Usando un mortaio e un pestello, macinare accuratamente il materiale vegetale congelato in azoto liquido fino a quando la polvere diventa omogenea e verde chiaro.

Trasferire la polvere in un nuovo tubo da 50 millilitri. Sotto una cappa aspirante, aggiungere 30 millilitri di tampone di estrazione e mescolare bene per immergere la polvere di tessuto. Da questo punto in poi, mantieni i campioni sempre a quattro gradi Celsius e assicurati che il tessuto sia completamente scongelato prima di andare avanti.

Eliminare il liquame facendolo passare attraverso un tessuto filtrante con una dimensione dei pori da 22 a 25 micrometri in un nuovo tubo da 50 millilitri. Quindi centrifugare a 1.000 volte g e quattro gradi Celsius per 20 minuti. Decantare delicatamente il surnatante dal pellet, che dovrebbe avere un volume di circa due millilitri.

Con cinque millilitri di tampone di estrazione due, risospendere il pellet. Quindi centrifugare a 1.000 volte g e quattro gradi Celsius per 10 minuti. Dopo aver travasato il surnatante, risospendere il pellet in 300 microlitri di tampone di estrazione tre.

In un tubo separato, aggiungere 600 microlitri di tampone di estrazione tre e quindi stratificare accuratamente il pellet risospeso sopra il tampone pulito. Centrifugare la provetta per un'ora a 16.000 volte g a quattro gradi Celsius, seguita dall'aspirazione del surnatante con una pipetta. Successivamente, utilizzare 300 microlitri di tampone di sonicazione per risospendere lentamente il pellet nucleare, evitando la formazione di bolle, che possono influire sull'efficienza della sonicazione.

Trasferire con cura la sospensione in un tubo pulito da 1,5 millilitri. Sonicare la sospensione per lisare i nuclei e condividere casualmente la cromatina in 200-600 frammenti di coppie di basi. Verificare le dimensioni del frammento di DNA su un gel di agarosio, quindi far girare la soluzione a 12.000 volte g e quattro gradi Celsius per 10 minuti.

Trasferire il surnatante in un tubo fresco da 1,5 millilitri e scartare il pellet. Aliquotare un decimo del surnatante in un nuovo tubo ed etichettarlo come input prima di congelarlo a meno 20 gradi Celsius. Infine, effettuare una diluizione di dieci volte della cromatina nel tampone di diluizione del chip per ottenere una concentrazione finale di SDS dello 0,1%.

I campioni possono quindi essere congelati e conservati a meno 20 gradi Celsius per diverse settimane. Dopo aver incubato le perle con gli anticorpi per una notte, utilizzare un millilitro di tampone di diluizione per chip per lavare le perle tre volte, quindi risospendere le perle in un millilitro di cromatina diluita e incubare la provetta per una notte su una ruota rotante a quattro gradi Celsius. Il giorno seguente, posizionare le perline sulla griglia magnetica a quattro gradi Celsius e, dopo aver rimosso la soluzione, utilizzare un millilitro di tampone di lavaggio a basso contenuto di sale per lavare le perle due volte, quindi utilizzare un tampone di lavaggio ad alto contenuto di sale per lavare le perle una volta.

Dopo aver utilizzato un millilitro di tampone di lavaggio al cloruro di litio per lavare le perle una volta, utilizzare un millilitro di tampone TE per lavare le perle due volte. Aspirare per rimuovere completamente il tampone di lavaggio TE. Una volta scongelati i campioni in ingresso, trasferire cinque microlitri di ciascuno in nuove provette da 1,5 millilitri e, andando avanti, trattare in modo simile ai campioni di chip.

Invertire la reticolazione aggiungendo 200 microlitri di resina a scambio ionico chelante al cinque percento e incubare a 95 gradi Celsius per 10 minuti, agitando ogni due o tre minuti. Centrifugare a 16.000 volte g per 30 secondi e trasferire con cura il surnatante in nuovi tubi per microfuge. Aggiungere due microlitri di 10 milligrammi per millilitro di protonasi K e incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti per digerire le proteine e rilasciare il DNA.

Per fermare la reazione, incubare a 95 gradi Celsius per 10 minuti, centrifugare rapidamente a 16.000 volte g per 30 secondi e trasferire il surnatante in una nuova provetta. Dopo aver pulito il DNA secondo il protocollo di testo, diluire da uno a dieci con acqua e utilizzare cinque microlitri per reazione per misurare l'abbondanza dei siti di legame mediante qPCR. Analizza i dati secondo il protocollo di testo.

Le foglie di Aribidopsis sono ricoperte da strati di cera e i tricomi favoriscono la formazione di bolle d'aria, che rendono difficile la penetrazione dei reagenti reticolanti nel tessuto vegetale. Qui sono mostrati campioni di piantine reticolate che sono state reticolate sottovuoto per aumentare l'efficienza di fissazione. Questa cifra dimostra che un aumento del numero di cicli di sonicazione riduce progressivamente la dimensione media del DNA nei campioni di chip, raggiungendo l'arricchimento ottimale nell'intervallo da 200 a 600 coppie di basi dopo 20-30 cicli, come dimostrato qui.

Come si vede in questa figura, per l'analisi sono state scelte quattro regioni importanti per la regolazione trascrizionale del locus FT, un gene principale della fioritura. I risultati del chip dimostrano che la proteina EBS combina una delle quattro regioni testate, una sequenza regolatoria vicina al sito di inizio trascrizionale di FT. Infine, i saggi su chip eseguiti utilizzando un anticorpo diretto contro l'istone h3 acetilato nelle lisine nove e 14, che è correlato con la cromatina trascrizionalmente attiva, hanno rivelato una maggiore abbondanza di H3K9/14ac nella DBS mutante rispetto alle piante wild type in tutti e quattro i frammenti genomici di FT testati, coerentemente con l'up-regolazione osservata di questo gene principale della fioritura in questo mutante. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due giorni se eseguita correttamente.

Seguire questa procedura, insieme ad altre misure come l'analisi dell'espressione genica, può contribuire a rispondere ad altre domande, come: Qual è il ruolo biologico del legame della proteina al DNA? È l'attivazione trascrizionale o la repressione? E quali modifiche istoniche sono associate?

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'epigenetica delle piante per esplorare gli stati della cromatina nelle nostre cellule riduttive. E questo può essere esteso ad altre specie vegetali. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come analizzare il legame della tua proteina aribidopsi di interesse al DNA in vivo.

Non dimenticare che lavorare con 2-metossietanolo, formaldeide o reagenti sonicatori, agenti patogeni e mutazioni staminali può essere estremamente pericoloso e precauzioni come indumenti protettivi, guanti o protezioni per l'udito devono essere sempre prese durante l'utilizzo di questa procedura.