Name: Immunoprecipitazione della cromatina Saggio per la identificazione di Arabidopsis interazioni proteina-DNA In Vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-14T16:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 36 s
Description: Scopri l'assay ChIP per identificare interazioni proteina-DNA in Arabidopsis in vivo. Questo metodo consente di studiare la regolazione genica e l'organizzazione della cromatina nelle piante.

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Gli autori ringraziano The Plant Cell per aver permesso l'uso di alcuni dati pubblicati in questa rivista per elaborare i risultati rappresentativi qui descritti nella Figura 4. Questo lavoro è stato sostenuto dal 7FP Marie Curie-Initial Training Network EpiTRAITS (Grant Agreement 316965) e dal Ministerio de Economìa y Competitividad spagnolo (sovvenzioni BIO2010-15589 e BIO2013-43098-R).

1. La reticolazione del materiale vegetale (1 ora) <ol><li> Crescere le linee di Arabidopsis usati nell&#39;esperimento (wild type - WT - contro i mutanti, e / o le linee che esprimono la versione tag del proteina di interesse contro linee che esprimono il tag non fuse a qualsiasi proteina) per 12-18 giorni in grandi piastre di Petri (150 mm) con terreno MS-agar (1 L: 1x Murashige e Skoog sali, 10 g di saccarosio, 0,5 g MES, pH 5,7 (KOH), 1% agar). In alternativa, le piante crescono su vasi contenenti 3: 1 miscela di suolo e vermiculite. ATTENZIONE! Formaldeide è tossico per inalazione, contatto con la pelle e per ingestione, e deve essere maneggiato in una cappa chimica di indossare dispositivi di protezione individuale idonei. I passaggi 1,2-1,6 deve essere effettuata sotto la cappa. </li><li> Effettuare piccoli fori del coperchio dei 50 ml tubi con un ago bruciatore riscaldata laboratorio. Aggiungere 40 ml di PBS 1x tampone e 1,08 ml di formaldeide ad una concentrazione finale di 1% (magazzino 37% solution). Raccogliere 1,5 g di materiale vegetale in queste provette da 50 ml. Tenere le provette su ghiaccio durante reticolazione. </li><li> Chiudere le provette da 50 ml con il coperchio. Porre i tubi in un essiccatore e applicare il vuoto. Vacuum infiltrare il tessuto per 10 min, quindi rilasciare attentamente il vuoto, per evitare smuovono la soluzione. Mescolare il campione. Ripetere due volte. Dopo infiltrazione, osservare il materiale vegetale e confermare che diventa leggermente traslucido e tendono a depositarsi sul fondo della provetta (figura 2). </li><li> Aggiungere 2,5 ml di 2 M glicina per ottenere una concentrazione finale di 0,125 M. Applicare il vuoto per 5 min. Glycine agisce come un inibitore competitivo di formaldeide reticolazione. </li><li> Eliminare la soluzione di formaldeide-glicina PBS invertendo la provetta chiusa 50 ml con fori del coperchio. </li><li> Sciacquare le piantine due volte con PBS 1x e una volta con acqua scartando la soluzione di lavaggio come descritto al punto 1.5. Li asciugare su un tovagliolo di carta e congelare in nitroge liquidon. NOTA: tessuto congelato può essere conservato a -80 ° C per settimane. </li></ol> 2. Preparazione degli anticorpi (1 giorno) NOTA: Per immunoprecipitazione, si consiglia l&#39;uso di biglie magnetiche coniugate con anticorpi tramite una proteina G o proteina A linker con alta affinità per il dominio costante della catena pesante dell&#39;anticorpo. I complessi DNA-proteina possono collegare aspecifico alla superficie dei coniugati perline-anticorpo. Per questo motivo, è necessario effettuare controlli senza anticorpi specifici per quantificare il legame di fondo non specifico. <ol><li> Per ogni immunoprecipitazione, preparare 15 ml di sfere magnetiche in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. La quantità di perle dipende dalla quantità di cromatina utilizzato per immunoprecipitazione e anche sulle anticorpi. </li><li> Per lavare, aggiungere 1 ml di immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) tampone di diluizione ai talloni, mescolare a rotazione e posizionare il microcentrifuga 1,5 ml tuessere in un rack magnetica. Attendere circa 1 minuto per lasciare le perline attribuiscono al magnete. Con i tubi da 1,5 ml microcentrifuga ancora nel rack, rimuovere il surnatante pipettando. Ripetere due volte. NOTA: Per ogni linea impianto sono necessari due set immunoprecipitazione: uno con le perline e anticorpi (Ab) e un secondo no anticorpo di controllo (n-Ab) con solo sfere magnetiche. </li><li> Risospendere le sfere in 200 ml di tampone di diluizione chip. Aggiungere la quantità richiesta della specifica Ab ad una delle due provette preparate per ciascuna linea di piante (diluizione esatto differisce per ciascuna Ab e deve essere ottimizzato sperimentalmente o, in caso di anticorpi commerciali, seguire le istruzioni del produttore). Utilizzare questo esempio per immunoprecipitazione. Aggiungere la stessa quantità di IgG non specifica per l&#39;altro tubo, che sarà utilizzato come controllo negativo. </li><li> Incubare O / N su una ruota girevole a 4 ° C per consentire l&#39;anticorpo allegare ai talloni. </li></ol> 3. cromatina Estrazione (4 ore) </p&gt; <ol><li> Macinare a fondo il materiale vegetale congelato in azoto liquido con mortaio e pestello finché la polvere diventa verde omogeneo e leggero. Trasferire la polvere in un tubo da 50 ml. </li><li> Per la procedura 3.2 - 3.6, il lavoro sotto la cappa aspirante. Aggiungere 30 ml di tampone di estrazione 1 (1) EXB, e mescolare bene per assorbire la polvere dei tessuti. Da questo punto in poi, tenere i campioni a 4 ° C in ogni momento. Tessuti congelati e avanzi di azoto liquido farà sì che il buffer di congelamento. Assicurati di scongelare completamente il tessuto congelato invertendo i tubi 4-5 volte ogni 2 min. </li><li> Cancellare l&#39;impasto facendola passare attraverso un tessuto filtrante con pori di dimensioni di 22-25 micron in un nuovo tubo da 50 ml e centrifugare a 1000 xg per 20 min a 4 ° C. NOTA: In questa fase, i nuclei e di tutti gli organi saranno pellet. ExB 1 contiene abbastanza saccarosio per fornire alta densità e impedire l&#39;interruzione della struttura organello. </li><li> Rimuovere delicatamente il surnatante tramite decantazione. In questo stage, osservare una pallina verde di circa 2 ml. </li><li> Risospendere il pellet in 5 ml di ExB 2. risospensione del pellet sarà difficile a questo punto. Centrifugare a 1000 xg per 10 min a 4 ° C. NOTA: ExB 2 contiene 1% Triton X-100 per aiutare scoppiare cloroplasti aperto e togliere clorofilla. </li><li> Risospendere il pellet in 300 ml di tampone di estrazione 3 (ExB 3). </li><li> In una provetta per microcentrifuga pulita, aggiungere 600 ml di ExB 3. Prendere il pellet risospeso dal punto 3.6 e con attenzione strato sulla parte superiore del pulito ExB 3. </li><li> Spin per 1 ora a 16.000 xg a 4 ° C. NOTA: Questo passaggio consente di rimuovere il detersivo dal campione. </li><li> Rimuovere il surnatante aspirando con una pipetta. Risospendere il pellet nucleare in 300 ml di tampone sonicazione lentamente pipettando su e giù per evitare la formazione di bolle, che possono influenzare l&#39;efficienza sonicazione. Pipetta con attenzione tutta la sospensione fuori e trasferirlo ad un pulito 1,5 ml provetta. NOTA: Questobuffer contiene SDS, per lisare i nuclei e rilasciare la cromatina. </li><li> Sonicare la sospensione per lisare i nuclei e casuale tosare cromatina in piccoli frammenti. Condizioni di utilizzo sonicazione che rendono cromatina arricchita di frammenti tra 200-800 bp (20-30 cicli con le impostazioni 30 sec ON / OFF 30 sec a 4 ° C per il dispositivo disponibile sonicazione descritto nella tabella di materiali / reagenti). Controllare l&#39;efficienza di sonicazione per separazione elettroforetica dei frammenti di DNA ottenuti su un gel di agarosio 13, caricando 2 ml di cromatina sonicato (Figura 3). ATTENZIONE! Assicuratevi di indossare dispositivi di protezione dell&#39;udito durante la fase di sonicazione nel caso in cui il dispositivo ad ultrasuoni non è contenuto in un armadio insonorizzato. Passo fondamentale! La frammentazione della cromatina dipende in gran parte delle apparecchiature ultrasuoni. Le condizioni sonicazione devono essere regolati per ottenere l&#39;arricchimento nelle dimensioni DNA appropriate. VedereFigura 3 per un esempio di come ottimizzare cromatina frammentazione. </li><li> Spin la soluzione volta a 12,000 xg per 10 min a 4 ° C. Trasferire il surnatante pipettando per un ambiente pulito 1,5 ml provetta. Eliminare il pellet. Prendere 1/10 del surnatante in una nuova provetta 1,5 ml, segnalo come ingresso e congelare a -20 ° C. </li><li> Diluire la cromatina 10x con tampone di diluizione per diluire ChIP SDS alla concentrazione finale di 0,1%. Nota: I campioni possono essere congelati e conservati a -20 ° C per diverse settimane. </li></ol> 4. immunoprecipitazione della proteina di interesse e salvataggio del DNA (1 giorno, 3 ore) <ol><li> Lavare le perle rivestite con Ab dal punto 2.4 a tre volte con 1 ml di tampone di diluizione chip per rimuovere l&#39;eccesso di anticorpi come descritto al punto 2.2. Risospendere in 200 ml di tampone di diluizione chip. Aggiungere 50 ml di isolato cromatina. Incubare O / N su una ruota girevole a 4 ° C. NOTA: Controllare i Concentratisulla della cromatina in microvolumi UV-Vis spettrofotometro. 50 ml di isolato cromatina dovrebbero contenere più di 10 mg di DNA. </li><li> Per la procedura di lavoro 4,2-4,5 a 4 ° C. Lavare le perle due volte in 1 ml di sale basso tampone di lavaggio come descritto al punto 2.2. </li><li> Lavare le perline una volta in 1 ml di High Salt tampone di lavaggio. </li><li> Lavare le perline una volta in 1 ml di LiCl tampone di lavaggio. </li><li> Lavare le perle due volte in 1 ml di tampone TE. Dopo l&#39;ultimo lavaggio, assicurarsi di rimuovere completamente il buffer TE sinistra nel tubo per aspirazione con una pipetta. </li><li> Togliere i campioni di ingresso (passo 3,9). Transfer 5 ml di INPUT in una nuova provetta da microcentrifuga da 1,5 ml e proseguire con i campioni di chip. Reverse reticolazione aggiungendo 200 ml di 5% resina a scambio ionico chelante, e incubare per 10 min a 95 ° C agitando ogni 2-3 min. Spin down a 16.000 xg per 30 secondi e trasferire con attenzione il surnatante in una nuova provetta pipettando. NOTA: Durante TRAMetodo dizionale per reticolazione inversione comporta un / N incubazione O con NaCl, l&#39;incubazione con una resina chelante ione a 95 ° C consente decrosslinking e eluizione del DNA in 10 min efficiente, rendendo il protocollo uno giorno più corto. </li><li> Aggiungere 2 ml di proteinasi K (10 mg / ml) e incubare a 37 ° C per 30 minuti per digerire le proteine ​​e rilasciare DNA. </li><li> Arrestare la reazione mediante incubazione a 95 ° C per 10 min. </li><li> Girare subito a 16.000 xg per 30 secondi e trasferire il surnatante in una nuova provetta pipettando. </li><li> Pulire il DNA isolato utilizzando un kit di purificazione frammenti di DNA standard. NOTA: Procedere in base alle istruzioni del produttore. </li><li> Trasferire la colonna di legame al DNA dal kit in una nuova provetta per microcentrifuga da 1,5 ml. Eluire il DNA purificato aggiungendo 20 ml di acqua priva di DNasi al centro della colonna e centrifugazione a 16.000 xg per 60 sec. Punto di arresto: I campioni possono essere conservati a -80 ° C per diverse settimane. </li></ol&gt; 5. Abbondanza di siti di legame nel DNA immunoprecipitato di qPCR di misura (4 ore) NOTA: DNA isolato da cromatina precipitato deve essere analizzato per determinare quale DNA frammenti sono stati ChIP-ed dalla cromatina totale, grazie al suo legame con la proteina di interesse. <ol><li> Primers progettazione per le regioni genomiche di interesse con una temperatura di fusione (Tm) di 60 ° C e un contenuto di GC del 30% -80%. Come cromatina è frammentata mediante sonicazione, la lunghezza della sequenza amplificata non deve essere superiore a 150-200 nucleotidi (Tabella 1). NOTA: uno strumento utile per la progettazione primer è Primer 3 Programma (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/). Ulteriori linee guida per la progettazione di fondo sono disponibili in precedenti relazioni 8, 14,15. </li><li> Utilizzare un programma BLAST per assicurarsi che i primer sono specifici (in particolare i promotori possono condividere sequenze vincolante TF simile) e testare l&#39;efficienza usin fondog 1:10 diluizioni in acqua del DNA di ingresso (passo 4.9). Alcune regioni del genoma saranno purificate meglio di altri. È quindi importante progettare primer PCR e controllare il DNA di ingresso diluito. </li><li> Diluire il DNA purificato 1:10 con acqua e pipettare 5 ml di DNA diluito in un tubo di PCR per ciascuna reazione. NOTA: diluire solo la quantità necessaria, come il DNA può attaccare alle pareti delle provette da microcentrifuga 1,5 ml. Molteplici cicli-disgelo congelamento aumentare il numero di molecole di DNA allegate. Per ogni coppia di primer, l&#39;amplificazione in ingresso, Ab-chip e No-Ab chip ha da analizzare. </li><li> Per completare la miscela PCR, aggiungere SYBR Green PCR master mix ad una concentrazione finale di 1x, e 0,5 mM di ciascun primer. Riempire fino a 20 ml con acqua priva di DNasi. </li><li> Eseguire la reazione qPCR seguendo le istruzioni del produttore master mix Sybr Verde PCR. </li></ol> Analisi 6. Dati NOTA: Tra gli existing modi di analizzare ChIP-dati, due sono più comunemente utilizzati. Il primo di questi è metodo di arricchimento piega, anche chiamata come &#39;arricchimento relativa&#39;, &#39;segnale su sfondo&#39; o &#39;rispetto al controllo non-anticorpo&#39;. Il secondo metodo è chiamato come &quot;% di input&quot;. <ol><li> Analisi dei dati con il metodo di arricchimento volte. <ol><li> Creare un foglio di calcolo con campioni nomi ei valori Ct grezzi che sono stati ottenuti dopo la reazione qPCR. </li><li> Per ogni campione, sottrarre dal suo valore Ct grezzo il valore grezzo Ct ottenuto per il relativo controllo della No-Ab. NOTA: Dopo questa operazione matematica, valore Ct per il campione No-Ab sarà uguale a 0. </li><li> Calcolare arricchimento piega dall&#39;operazione elevamento con base 2 e esponente (potenza) corrisponde al periodo residuo negativo ottenuto nel passaggio 6.1.2 (Tabella 2). piegare arricchimento = 2 - (Ct (campione) - Ct (No-Ab)) NOTA: In questo metod l&#39;abbondanza di un frammento di DNA specifico del campione ChIP-ed è confrontato con l&#39;abbondanza di questo frammento in controllo No-Ab. L&#39;assunzione di questo metodo è che il livello di segnale di fondo è riproducibile tra diversi set di primer, esempi e replicare esperimenti. Tuttavia, questo&#39;noise&#39; livelli di segnale variano tra i set di primer, campioni, ed esperimenti. </li></ol></li><li> L&#39;analisi dei dati da% di metodo di input. <ol><li> Creare un foglio di calcolo con campioni nomi e valori grezzi Ct che sono stati ottenuti per loro, dopo la reazione qPCR. </li><li> Regolare valori grezzi Ct per campioni di ingresso sottraendo un valore di logaritmo in base 2 dalla frazione di estratto totale cromatina che è stata presa come input. NOTA: In questo protocollo il valore sottratto uguale a 3,32, come il 10% della cromatina totale è stato preso come un ingresso in questo protocollo. Log 2 (10) è uguale a 3.32. </li><li> Calcola% dell&#39;input moltiplicando per 100 il valore di funzionamento elevamento con base 2 e esponente (potenza) pari al restante valori di ingresso impostati sottratti valori grezzi Ct del campione (Tabella 3). % Di input = 100 * 2 (ingresso regolato - Ct (campione)) NOTA: Con questa procedura, la relazione tra la specifica abbondanza di DNA del campione ChIP-ed al isolata cromatina (campione di ingresso) totale viene calcolato. Ulteriori dettagli sulla analisi dei dati chip può essere trovato in Haring et al. 8. </li></ol></li></ol>

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<li>Kaufmann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+genes+of+the+MADS+transcription+factor+SEPALLATA3%3A+integration+of+developmental+and+hormonal+pathways+in+the+Arabidopsis+flower%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Target genes of the MADS transcription factor SEPALLATA3: integration of developmental and hormonal pathways in the Arabidopsis flower.</a> PLoS Biol. 7 (4), e1000090(2009).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Il protocollo ChIP qui descritto è una tecnica riproducibile e potente per analizzare le interazioni tra proteine ​​e specifiche sequenze di DNA in vivo in piante di Arabidopsis. Una individuazione di siti di legame per le proteine ​​di interesse richiede un&#39;adeguata selezione di organi vegetali o stadi di sviluppo in cui le interazioni rilevanti sono effettivamente avvenendo. Inoltre, è fondamentale per ottenere un fissaggio adeguato del materiale vegetale e un taglio ottimale della cromatina mediante soni...

Negli ultimi anni una vasta gamma di strumenti genetici, molecolari e genomici sono stati sviluppati nella specie modello Arabidopsis thaliana. Questa tecnologia ha facilitato enormemente il progresso nella comprensione di come lo sviluppo della pianta è regolamentata. Tra i processi di sviluppo studiati utilizzando Arabidopsis come modello, il controllo genetico del tempo di fioritura è stata ampiamente analizzata. Questi studi hanno dimostrato che le piante modulano estrema precisione il tempo di fioritura in risposta a stimoli endogeni come ormoni e l&#39;età della pianta, e anche a segnali ambientali come fotoperiodo e temperatura che sincronizzano tempo di fioritura con il ciclo naturale delle stagioni 1, 2. L&#39;isolamento e la caratterizzazione di mutanti di Arabidopsis con alterazioni nel tempo della fioritura è stato determinante nello svelare una complessa rete di geni che regolano il tempo di fioritura in risposta a fattori endogeni ed ambientali. Questi circuiti sono geneticheintegrato a livello di alcuni geni master che agiscono come interruttori di fioritura, e l&#39;esatta tempistica di apertura floreale dipende dall&#39;equilibrio della fioritura e promuovere attività che lavorano a monte dei geni integratore floreali 1,3 reprimere. La caratterizzazione funzionale dei geni identificati per il loro ruolo nel controllo di iniziazione fioritura, complice il recente uso di approcci genomici, hanno rivelato il ruolo centrale della regolazione trascrizionale nella modulazione del tempo di fioritura. In effetti, molti dei geni maestri codificano fattori di trascrizione fioritura 4. Inoltre, un certo numero di cromatina complessi proteici rimodellamento influenzano l&#39;espressione dei geni maestri di fioritura. Un certo numero di mutanti di Arabidopsis isolati per il loro tempo di fioritura alterato rivelato trasportare mutazioni nei geni che codificano per una varietà di modificatori della cromatina. Diversi rimodellatori cromatina che introducono modificazioni post-a Histone code, riposizionare nucleosomi relativi al DNA o scambiano istoni canoniche da varianti istoni sono necessarie per la corretta regolazione della fioritura in Arabidopsis 5,6. Alcune di queste attività di rimodellamento della cromatina catalizzano la deposizione o la rimozione di modifiche covalenti quali acetilazione o metilazione in specifici residui istoni. Questi segni istoni sono specificamente riconosciuti da effettori specializzate che reclutano altri complessi di rimodellamento della cromatina, fattori di trascrizione o componenti del macchinario trascrizionale per regolare l&#39;attività trascrizionale di geni fioritura. Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) permette di individuare in vivo DNA-binding siti per le proteine ​​di interesse (Figura 1). Questa procedura sfrutta la capacità di alcune sostanze chimiche per reticolare le proteine ​​al DNA. I risultanti complessi DNA-proteina possono essere poi immunoprecipitati utilizzando anticorpi specifici agafattori di trascrizione, proteine ​​inst-cromatina legame, o particolari modifiche e epitopi eterologhe (comunemente indicato come &quot;tag&quot;) attaccati alla proteina di scelta. Il DNA purificato da queste immunoprecipitati può essere utilizzato come modello in PCR (qPCR) reazioni quantitativa per valutare per l&#39;arricchimento di particolari sequenze di interesse. In questo modo, i siti di legame di fattori di trascrizione o la distribuzione dei voti istone in particolari geni possono essere stabiliti 7,8. Inoltre, in combinazione con Next Generation Sequencing (NGS), che permette il sequenziamento massivo parallelo, tecnologia dei chip ha reso possibile l&#39;identificazione a livello di genoma dei siti di legame di fattori di trascrizione e svelando i paesaggi epigenomiche di modificazioni degli istoni. Inoltre, l&#39;analisi simultanea dell&#39;espressione genica consente il monitoraggio come il legame di regolatori trascrizionali o deposizione di particolari segni istone correlare con trascrizionale activity di geni 9. L&#39;utilizzo di protocolli chip Arabidopsis ha permesso di valutare l&#39;impatto che una varietà di regolatori trascrizionali hanno sull&#39;organizzazione della cromatina di geni master di fioritura e di come questi cambiamenti strutturali influenzano l&#39;espressione genica 5,6. Risultati precedenti hanno mostrato che la Arabidopsis locus VITE IN ANTICIPO IN GIORNI SHORT (EBS) agisce come repressore della fioritura e mutanti in questo gene mostrano un&#39;accelerazione della fioritura e aumenta del gene maestro di FT fioritura. Inoltre, la perdita di funzione mutazioni in FT sopprimere completamente il fenotipo fioritura precoce delle piante EBS mutanti, indicando che FT è necessaria per la fioritura precoce di mutanti EBS e che EBS è necessaria per la rimozione di questo maestro gene della fioritura 10 , 11. EBS codifica per una proteina che contiene PHD che possono specificatamente legare dell&#39;istone H3 di- e Trimethylated in the lisina 4 residuo (H3K4me2 / 3), suggerendo un ruolo per EBS nella repressione cromatina mediata di FT 12. L&#39;uso del metodo ChIP dimostrato che l&#39;Arabidopsis-PHD contenenti proteine ​​EBS 10,11 lega regioni regolatorie del gene floreale integratore FT per reprimere la sua espressione 12. Ulteriori dati ottenuti tramite l&#39;uso della tecnologia ChIP hanno dimostrato che questa proteina è necessario per mantenere bassi livelli di acetilazione degli istoni, un segno distintivo della trascrizione attiva, nella cromatina di questo maestro gene della fioritura durante le fasi iniziali dello sviluppo Arabidopsis. Queste osservazioni, insieme con i dati di espressione genetica e genica, dimostrare che questo Arabidopsis PHD-contenente proteina ha un ruolo centrale nella messa a punto di tempo di fioritura modulando l&#39;espressione del gene integratore floreale FT 12. Il lavoro qui presentato fornisce un metodo ottimizzato utile non solo per l&#39;analisi degli istoni ma anche per altricromatina proteine ​​associate, e con una maggiore efficienza e riduzione dei tempi di sperimentale. Inoltre, la presente relazione illustra come l&#39;uso di protocolli di chip ha fornito nuove informazioni sul rapporto tra cambiamenti nelle modificazioni della cromatina e stati trascrizionali di geni vegetali, e di come questi meccanismi cromatina mediata di impatto controllo dell&#39;espressione genica sull&#39;insorgenza della fioritura in Arabidopsis.

<table><tbody><tr><td>MES</td><td>Sigma</td><td>M8250</td><td></td></tr><tr><td>MS (Miscela di sali basali Murashige e Skoog)</td><td>Sigma</td><td>M5524</td><td></td></tr><tr><td>Formaldeide 37%&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>F8775-25</td><td>Utilizzare sotto la cappa aspirante</td></tr><tr><td>Miscela di inibitori della proteasi cOmplete ULTRA Compresse, Mini, senza EDTA, EASYpack</td><td>Roche</td><td>5892791001</td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor Dispositivo di sonicazione standard</td><td>Diagenode</td><td>B01010002 (UCD200TO)</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>50046</td><td></td></tr><tr><td>Kit di purificazione QIAquick PCR</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Perle magnetiche Dynabeads accoppiate con proteina A o proteina G</td><td>Life Technologies</td><td>10003D/10001D</td><td>Controlla il produttore' s manuale per l'affinità anticorpale</td></tr><tr><td>Miracloth</td><td>Merck Millipore</td><td>475855</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 Surfact-Amps Soluzione detergente</td><td>Life Technologies</td><td>85112</td><td></td></tr> <tr><td>(topo, ratto, coniglio&hellip;)-IgG</td><td>Diagenode</td><td>C15400001, C15420001 C15410206</td><td></td></tr><tr><td>Rack magnetico - DynaMag-2</td><td>Life Technologies</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>H3K9/14ac anticorpo policlonale - Premium&nbsp;</td><td>Diagenode</td><td>C15410200-10</td><td></td></tr><tr><td>Chelex 100 Resina</td><td>Bio-Rad</td><td>142-2832</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasi K</td><td>Life Technologies</td><td>17916</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Anti-Myc Tag, clone 4A6</td><td>Millipore</td><td>05-724</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 SYBR Green I Master</td><td>Roche</td><td>4707516001</td><td></td></tr></tbody></table>

immunoprecipitazione della cromatina saggio per la identificazione di arabidopsis interazioni proteina-dna<em&gt; in vivo</em

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Intricate reti di regolazione genica orchestrano i processi biologici e le transizioni di sviluppo nelle piante. L'attivazione trascrizionale selettiva e il silenziamento dei geni mediano la risposta delle piante ai segnali ambientali e ai segnali di sviluppo. Pertanto, le conoscenze sui meccanismi che controllano l'espressione genica delle piante sono essenziali per ottenere una profonda comprensione di come i processi biologici sono regolati nelle piante. La tecnica di immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) qui descritta è una procedura per identificare i siti di legame al DNA delle proteine nei geni o nelle regioni genomiche della specie modello Arabidopsis thaliana. Le interazioni con il DNA di proteine di interesse come fattori di trascrizione, proteine della cromatina o versioni modificate post-traduzionali degli istoni possono essere analizzate in modo efficiente con il protocollo ChIP. Questa metodica si basa sulla fissazione delle interazioni proteina-DNA in vivo, sulla frammentazione casuale della cromatina, sull'immunoprecipitazione di complessi proteina-DNA con anticorpi specifici e sulla quantificazione del DNA associato alla proteina di interesse mediante tecniche di PCR. L'uso di questa metodologia in Arabidopsis ha contribuito in modo significativo a svelare meccanismi di regolazione trascrizionale che controllano una varietà di processi biologici vegetali. Questo approccio ha permesso l'identificazione dei siti di legame della proteina EBS della cromatina di Arabidopsis alle regioni regolatorie del gene master della FT in fiore. L'impatto di questa proteina nell'accumulo di particolari marcature istoniche nella regione genomica di FT è stato rivelato anche attraverso l'analisi ChIP.

Otto passi principali possono essere individuati in questo protocollo ChIP per identificare in vivo interazioni proteina-DNA, tra cui coltura del materiale vegetale, reticolazione di cromatina, isolamento cromatina, cromatina frammentazione, isolamento selettivo dei complessi tra DNA e la proteina di interesse mediante immunoprecipitazione, la digestione delle proteine, la purificazione del DNA, e qPCR analisi (Figura 1). Un passo cruciale nel protocollo chip è la fissazione delle interazioni D...

Cromatina immunoprecipitazione è una tecnica potente per l&#39;identificazione di DNA siti di Arabidopsis proteine ​​in vivo vincolante. Questa procedura include cromatina reticolazione e frammentazione, immunoprecipitazione con anticorpi selettivi contro la proteina di interesse, e l&#39;analisi qPCR di DNA legato. Descriviamo un semplice saggio di ChIP ottimizzato per piante di Arabidopsis.

Immunoprecipitazione della cromatina Saggio per la identificazione di Arabidopsis interazioni proteina-DNA<em&gt; In Vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

L'obiettivo generale di questa procedura è rivelare le interazioni tra proteine e DNA nella cromatina delle cellule di arabidopsis. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia vegetale, come quali geni siano regolati da un determinato fattore di trascrizione, o quali modifiche del sistema siano associate allo stato trascrizionale dei geni. Il vantaggio principale di questa tecnica consiste nel fatto che, grazie al passaggio di cross-linking, è possibile fissare e catturare i cambiamenti nell'organizzazione della cromatina che si verificano durante lo sviluppo della pianta.Sebbene questo metodo possa fornire un'informazione sulle interazioni proteiche in arabidopsis thaliana, può anche essere applicato a diversi ordini vegetali e adattato ad altre specie vegetali. A dimostrare questa procedura saranno Dorota Komar e Alfonso Mouriz, due studenti di dottorato del nostro laboratorio. Dopo aver coltivato arabidopsis seguendo il protocollo descritto, raccogliere 1,5 grammi di materiale vegetale in provette da 50 millilitri e mantenerli sul ghiaccio durante la cross-linking.Quindi, utilizzare un ago riscaldato con un becco Bunsen per praticare dei piccoli fori nei tappi delle provette. Aggiungere 40 millilitri di PBS 1x e 1,08 millilitri di formaldeide nelle provette. Chiudere le provette con i tappi e posizionarle in un essiccatore.Infiltrare sottovuoto per 10 minuti, quindi rilasciare con attenzione il vuoto per evitare di agitare la soluzione. Dopo aver mescolato il campione, ripetere i passaggi di vuoto e mescolamento. Al termine dell'infiltrazione, osservare il materiale vegetale e verificare che diventi leggermente traslucido e affondi sul fondo del tubo.Aggiungere 2,5 millilitri di glicina due molarizzata per ottenere una concentrazione finale di 0,125 molarizzata ed applicare il vuoto per cinque minuti. Dopo aver rilasciato il vuoto, scartare la soluzione capovolgendo i tubi e lasciando che fuoriesca attraverso i fori nei coperchi. Utilizzare il PBS per risciacquare i piantini due volte e risciacquare con acqua una volta.Quindi asciugare le piantine su un tovagliolo di carta prima di congelarle con azoto liquido. Per ogni immunoprecipitazione, preparare 15 microlitri di microsferette magnetiche in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri. Aggiungere un millilitro di tampone di diluizione per l'immunoprecipitazione della cromatina, o tampone di diluizione per ChIP, alle microsferette, mescolare mediante rotazione e posizionare il tubo microcentrifuga da 1,5 millilitro su un supporto magnetico.Dopo aver lasciato attaccare le perle al magnete per circa un minuto, utilizzare una pipetta per rimuovere il soprannatante prima di ripetere il lavaggio. Ri-sospendere le perle in 200 microlitri di buffer di diluizione chip. Per l'immunoprecipitazione, aggiungere la quantità richiesta di anticorpo specifico a una delle due provette preparate per ogni campione cieco di pianta.Un fattore chiave per il successo di un esperimento chip è l'anticorpo scelto per l'immunoprecipitazione della proteina di interesse. Gli anticorpi prodotti contro fattori di trascrizione vegetali possono essere utili per esperimenti chip, ma il siero deve essere accuratamente testato. Ad esempio, anticorpi verificati soltanto mediante analisi di Western blot non sono necessariamente validi per esperimenti chip.Come controllo negativo, aggiungere la stessa quantità di IGG non specifica al secondo tubo. Incubare i tubi a quattro gradi Celsius per tutta la notte su una ruota rotante per consentire all'anticorpo di legarsi alle perle. Utilizzando un mortaio e un pestello, macinare accuratamente il materiale vegetale congelato in azoto liquido fino a quando la polvere diventa omogenea e di colore verde chiaro.Trasferire la polvere in un nuovo tubo da 50 millilitri. Sotto cappa, aggiungere 30 millilitri di buffer di estrazione uno e mescolare bene per inzuppare completamente la polvere di tessuto. A partire da questo passaggio, mantenere i campioni a quattro gradi Celsius in ogni fase e assicurarsi che il tessuto sia completamente scongelato prima di procedere.Eliminare le impurità dalla sospensione facendola passare attraverso un tessuto filtrante con una dimensione dei pori compresa tra 22 e 25 micrometri, raccogliendola in un nuovo tubo da 50 millilitri. Quindi, centrifugare a 1.000 ×g e a 4 gradi Celsius per 20 minuti. Versare con attenzione il soprannatante dal pellet, che dovrebbe avere un volume di circa due millilitri.Con cinque millilitri di tampone di estrazione due, risospendere il pellet. Quindi centrifugare a 1.000 ×g e a 4 °C per 10 minuti. Dopo aver decantato il soprannatante, risospendere il pellet in 300 microlitri di tampone di estrazione tre.In un tubo separato, aggiungere 600 microlitri di tampone di estrazione tre e quindi stratificare con attenzione il pellet ri-sospeso sulla parte superiore del tampone pulito. Centrifugare il tubo per un'ora a 16.000 ×g a quattro gradi Celsius, seguito dall'aspirazione del sopranatante mediante pipetta. Successivamente, utilizzare 300 microlitri di tampone di sonificazione per ri-sospendere lentamente il pellet nucleare, evitando la formazione di bolle, che potrebbe compromettere l'efficienza della sonificazione.Trasferire con attenzione la sospensione in un tubo pulito da 1,5 millilitri. Sottoporre la sospensione a sonicazione per lisare i nuclei e frammentare casualmente la cromatina in frammenti di 200-600 paia di basi. Verificare le dimensioni dei frammenti di DNA su un gel di agarosio, quindi centrifugare la soluzione a 12.000 ×g e 4 °C per 10 minuti.Trasferire il soprannatante in un nuovo tubo da 1,5 millilitri e scartare il pellet. Aliquotare un decimo del soprannatante in un tubo nuovo e etichettarlo come "input" prima di congelarlo a meno 20 gradi Celsius. Infine, eseguire una diluizione 10 volte del cromatina nel buffer di diluizione per chip per ottenere una concentrazione finale di SDS dello 0,1 percento.I campioni possono quindi essere congelati e conservati a meno 20 gradi Celsius per diverse settimane. Dopo aver incubato le perle con gli anticorpi durante la notte, utilizzare un millilitro di buffer di diluizione per chip per lavare le perle per tre volte, quindi risospendere le perle in un millilitro di cromatina diluita e incubare il tubo durante la notte su una ruota rotante a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, posizionare le perle sul supporto magnetico a quattro gradi Celsius e, dopo aver rimosso la soluzione, utilizzare un millilitro di buffer di lavaggio a basso sale per lavare le perle due volte, quindi utilizzare il buffer di lavaggio ad alto sale per lavare le perle una volta.Dopo aver lavato le perle una volta con un millilitro di buffer di lavaggio al cloruro di litio, lavare le perle due volte con un millilitro di buffer TE. Aspirare per rimuovere completamente il buffer di lavaggio TE. Una volta scongelati i campioni di input, trasferire cinque microlitri di ciascuno in nuove provette da 1,5 millilitri e, da questo punto in avanti, trattarli in modo analogo ai campioni chip.Invertire il cross-linking aggiungendo 200 microlitri di resina a scambio ionico chelante al cinque percento e incubare a 95 gradi Celsius per 10 minuti, agitando ogni due o tre minuti. Centrifugare a 16.000 ×g per 30 secondi ed accuratamente trasferire il soprannatante in nuove provette microcentrifuga. Aggiungere due microlitri di proteasi K a 10 milligrammi per millilitro e incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti per digerire le proteine e rilasciare il DNA.Per arrestare la reazione, incubare a 95 gradi Celsius per 10 minuti, centrifugare rapidamente a 16.000 ×g per 30 secondi e trasferire il soprannatante in un nuovo tubo. Dopo aver purificato il DNA secondo il protocollo indicato nel testo, diluire da uno a dieci con acqua e utilizzare 5 microlitri per reazione per misurare l'abbondanza dei siti di legame mediante qPCR. Analizzare i dati secondo il protocollo indicato nel testo.Le foglie di Aribidopsis sono ricoperte da strati di cera e tricomi che favoriscono la formazione di bolle d'aria, entrambi i quali rendono difficile la penetrazione dei reagenti di cross-linking nei tessuti vegetali. Qui sono mostrati campioni di piantine cross-linkati sottoposti a cross-linking sotto vuoto per aumentare l'efficienza della fissazione. Questa figura dimostra che un numero crescente di cicli di sonificazione riduce progressivamente la dimensione media del DNA nei campioni di chip, raggiungendo l'arricchimento ottimale nell'intervallo di 200-600 paia di basi dopo 20-30 cicli, come mostrato qui.Come mostrato in questa figura, sono state selezionate quattro regioni importanti per la regolazione trascrizionale del locus FT, un gene principale della fioritura, ai fini dell'analisi. I risultati del ChIP dimostrano che la proteina EBS si lega a una delle quattro regioni testate, una sequenza regolatoria vicina al sito di inizio della trascrizione di FT. Infine, saggi ChIP eseguiti utilizzando un anticorpo diretto contro l'istone H3 acetilato sulle lisine 9 e 14, che è associato a cromatina trascrizionalmente attiva, hanno rivelato una maggiore abbondanza di H3K9/14ac nelle piante mutanti DBS rispetto ai controlli di tipo selvatico in tutti e quattro i frammenti genomici di FT analizzati, coerentemente con l'up-regolazione osservata di questo gene principale della fioritura nel mutante. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due giorni se effettuata correttamente.Seguendo questa procedura, insieme ad altre misure come l'analisi dell'espressione genica, si può contribuire a rispondere ad altre domande, come: Qual è il ruolo biologico del legame della proteina al DNA? È coinvolto nell'attivazione o nella repressione trascrizionale? E quali modifiche istoniche sono associate?Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'epigenetica vegetale per esplorare gli stati della cromatina nelle nostre cellule riduttive. E questo approccio può essere esteso ad altre specie vegetali. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come analizzare in vivo il legame della tua proteina di Arabidopsis di interesse al DNA.Non dimenticare che lavorare con reagenti come 2-metossietanolo, formaldeide o sonicatori, agenti patogeni e mutazioni staminali può essere estremamente pericoloso, e precauzioni come indumenti protettivi, guanti o protezioni per l'udito devono essere sempre adottate durante l'utilizzo di questa procedura.

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L'imprinting è un fenomeno in impianti e riproduzione dei mammiferi. Metilazione del DNA gioca un ruolo importante nei meccanismi di imprinting. Isolando endosperma e determinare lo stato di metilazione dei geni...

Determinazione della metilazione del DNA di geni impressa Arabidopsis Dell&#39;endosperma

Un approccio affidabile e utile per rilevare modificazioni degli istoni sui geni impianto specifico è descritto. L'approccio combina immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) e real-time PCR quantitativa. Esso consente il rilevamento di modifiche degli istoni su specifici geni con un ruolo in diversi processi fisiologici.

Rilevamento di modifiche Histone in foglie delle piante

Abbiamo sviluppato una tecnica per testare interazioni proteina-proteina in pianta. Una proteina fluorescente gialla (YFP) è divisa in due frammenti non si sovrappongono. Ogni frammento viene clonato in-frame ad un gene di interesse attraverso il sistema Gateway, consentendo l'espressione di proteine ​​di fusione. Ricostituzione del segnale YFP si verifica solo quando le proteine ​​interagiscono inchiesta.

Rilevamento delle interazioni proteiche in pianta utilizzando un gateway compatibile complementazione fluorescenza biomolecolare (BiFC) Sistema

Questo video descrive il protocollo per il test di immunoprecipitazione della cromatina (ChIP), che è una tecnica classica per dimostrare le interazioni proteina-DNA. Questa tecnica viene utilizzata per identificare i geni bersaglio nelle cellule di leucemia linfocitica cronica umana.

Saggio di immunoprecipitazione della cromatina: una tecnica per studiare le interazioni proteina-DNA nelle cellule

In questo video, dimostriamo la tecnica di immunoprecipitazione della cromatina per identificare i siti di legame delle proteine su regioni specifiche del DNA genomico delle cellule precursori degli oligodendrociti attraverso l'immunoprecipitazione selettiva di frammenti di cromatina legati alle proteine. Questo metodo aiuta a studiare l'interazione di diverse proteine regolatrici, compresi i fattori di trascrizione coinvolti nella regolazione genica.

Immunoprecipitazione della cromatina per identificare i siti di legame delle proteine bersaglio sul DNA genomico

Riportiamo un metodo semplice ed efficace per isolare gli embrioni nelle prime fasi di sviluppo...

Isolamento efficiente e rapida di embrioni nelle prime fasi di<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Semi

Forniamo qui un protocollo efficiente e affidabile per immunoistochimica, ibridazione in situ fluorescente, colorazione del DNA seguita da quantitativa, immagini ad alta risoluzione di tutto il montaggio di Arabidopsis thaliana ovuli. Questo metodo è stato utilizzato con successo per analizzare modificazioni della cromatina e architettura nucleare.

Un metodo efficiente per quantitativa, analisi singola cella della cromatina Cambiamento e architettura nucleare in tutto il montaggio Ovuli in<em&gt; Arabidopsis</em

Qui presentiamo un protocollo di cattura di interazione applicato ai protoplasti a foglia di Arabidopsis thaliana . Questo metodo si basa fondamentalmente sulla creazione di reticolazione UV in vivo e consente l'isolamento e l'identificazione delle proteine ​​legate alla mRNA da un ambiente fisiologico.

Cattura di Interactome mRNA da protoplasti vegetali

Questo manoscritto descrive una facile e rapida procedura sperimentale per la determinazione di interazioni proteina-proteina basate sulla misurazione dell'attività luciferasica.

Analisi di Imaging di complementazione di luciferase in foglie di Nicotiana benthamiana per transitoriamente determinare dinamiche di interazione proteina-proteina

Questo protocollo si concentra sulla preparazione della cromatina da tessuti congelati a scatto ed è adatto per l'immunoprecipitazione della cromatina reticolante (X-ChIP) seguita da analisi quantitative PCR (X-ChIP-qPCR) o approcci di sequenziamento di nuova generazione (X-ChIP-seq).

Estrazione della cromatina dal tessuto epatico chimerico congelato per l'analisi dell'immunoprecipitazione della cromatina

Qui, presentiamo un protocollo passo-passo per eseguire l'esperimento di marcatura di prossimità (PL) nel cetriolo (Cucumis sativus L.) utilizzando AT4G18020 proteina (APRR2)-AirID come modello. Il metodo descrive la costruzione di un vettore, la trasformazione di un costrutto attraverso l'agroinfiltrazione, l'infiltrazione di biotina, l'estrazione di proteine e la purificazione di proteine marcate con biotina attraverso la tecnica di purificazione per affinità.

Etichettatura di prossimità basata su AirID per l'interazione proteina-proteina nelle piante

Scopri l'assay ChIP per identificare interazioni proteina-DNA in Arabidopsis in vivo. Questo metodo consente di studiare la regolazione genica e l'organizzazione della cromatina nelle piante.

Immunoprecipitazione della cromatina Saggio per la identificazione di Arabidopsis interazioni proteina-DNA

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