Migliorata la generazione di cardiomiociti indotte usando un costrutto policistronico Esprimendo rapporto ottimale di Gata4, MEF2C e Tbx5
November 13th, 2015
Descriviamo qui un protocollo per la generazione di iCM utilizzando la somministrazione mediata da retrovirus di Gata4, Tbx5 e Mef2c in un costrutto policistico. Questo protocollo produce una popolazione relativamente omogenea di cellule riprogrammate con una migliore efficienza e qualità ed è prezioso per studi futuri sulla riprogrammazione di iCM.
L'obiettivo generale di questo protocollo è dimostrare come generare in modo efficiente cardiomiociti indotti da fibroblasti cardiaci con un costrutto MGT policiano, esprimendo un rapporto ottimale di gata quattro, F due C e TBX cinque. Questo metodo fornisce una piattaforma preziosa per la ricerca sui cardiomiociti indotti e faciliterà l'high attraverso lo screening post-screening e gli studi meccanicistici della programmazione dei cardiomiociti indotti, spostando anche il campo verso le applicazioni cliniche. Il vantaggio principale di questa tecnica è che utilizzando un solo costrutto retrovirale, i cardiofibroblasti possono essere convertiti in modo efficiente in cardiomiociti.
Pulire il topo transgenico neonatale alfa miosina a catena pesante GFP con il 75% di volume in volume. L'etanolo esegue l'eutanasia. Quindi aprire la cavità corporea praticando un'incisione orizzontale da sotto un'ascella all'altra utilizzando una pinza sterile, smussata e piegata.
Sezionare il cuore e metterlo in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti contenente ghiaccio. La PBS fredda osserva l'espressione della GFP in tutto il cuore utilizzando la microscopia a fluorescenza. Posizionare tre cuori positivi FP 4G in un piatto di coltura a pozzetto centrale da 60 millimetri utilizzando pinze e forbici sterili, tritare i cuori in piccoli pezzi inferiori a un millimetro cubo.
Trasferite i cuori tritati in un piatto da 10 centimetri e coprite con due millilitri di fibrablasto o FB medium. Lasciare le piastre indisturbate per almeno tre ore in un'incubatrice a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, aggiungere lentamente otto millilitri di terreno FB preriscaldato al piatto contenente il tessuto cardiaco tritato.
Quindi incubare il tessuto senza disturbi, tranne che per cambiare il terreno ogni tre giorni. Il settimo giorno, aspirare il terreno di coltura e lavare le cellule con DPBS. Aggiungere tre millilitri di viaggi allo 0,05% in EDTA a ciascuna piastra e incubare a 37 gradi Celsius per cinque minuti.
Aggiungere cinque millilitri di terreno FB per disattivare la tripsina, quindi staccare delicatamente le cellule con un raschietto cellulare. Successivamente, raccogliere le cellule e filtrarle attraverso filtri cellulari da 40 micron per evitare la contaminazione con frammenti di tessuto cardiaco. Pellettare le cellule mediante centrifugazione a 200 volte G per cinque minuti, iniziando con cuori di topo neonatale isolati.
Taglia ogni cuore in quattro pezzi che sono ancora collegati in modo lasco. Trasferire i cuori in una provetta conica da 15 millilitri contenente otto millilitri di tripsin EDTA caldo allo 0,05% e incubare a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Dopo l'incubazione, scartare il tripsin EDTA e aggiungere cinque millilitri di vortice caldo di collagenasi di tipo due per un minuto a velocità media, quindi incubare la provetta in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per tre-cinque minuti.
Quindi agitare nuovamente il tubo per un minuto. Lasciare che i pezzi di tessuto si depositino e raccogliere il surnatante in un nuovo tubo contenente cinque millilitri di terreno FB freddo. Aggiungere cinque millilitri di collagenasi fresca di tipo due ai pezzi di tessuto e ripetere le fasi di vortice e incubazione.
Combinare tutte le cellule contenenti surnatanti filtrandole attraverso un colino cellulare da 40 micron. Centrifugare queste celle a 200 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Seguendo entrambi i metodi di isolamento dei fibroblasti cardiaci.
Lavare il pellet della cella finale una volta in 10 millilitri di selezione cellulare attivata magneticamente o tampone massimo. Rimuovere 10 microlitri per il conteggio delle cellule vive e centrifugare le cellule rimanenti a 200 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius per meno di una volta 10 alla settima cella. Risospendere il pellet cellulare con 10 microlitri di microsfere magnetiche coniugate per coscia 1,2 in 90 microlitri di tampone max refrigerato e mescolare.
Incubare bene le perle a quattro gradi Celsius per 30 minuti. Per pellettare le cellule, aggiungere 10 millilitri di tampone max e centrifugare i campioni a 200 volte G per cinque minuti. Lavare una volta con 10 millilitri di tampone max e risospendere il pellet cellulare in un volume totale di due millilitri in una cappa di coltura cellulare.
Impostare un separatore max e aggiungere una colonna LS. Equilibrare la colonna con tre millilitri di tampone massimo. Passare la sospensione cellulare attraverso la colonna LS e lavare tre volte con due millilitri di tampone massimo.
Quindi rimuovere la colonna LS dal separatore ed eluire tre volte con due millilitri di tampone massimo. Raccolta dell'EIT in un tubo conico da 50 millilitri. Centrifugare l'EIT a 200 volte G per cinque minuti.
Risospendere i fibroblasti isolati in 10 millilitri di terreno FB e contare le cellule, seminare le cellule in piastre di coltura tissutale a densità appropriate in una piastra di gelatina precodificata a 24 pozzetti per riprogrammare i fibroblasti cardiaci. Aggiungere 500 microlitri di cardiomiocita indotto o terreno ICM contenente poliencefalo a ciascun pozzetto delle piastre a 24 pozzetti posizionate con le cellule. Aggiungere 10 microlitri di retrovirus a ciascun pozzetto di fibroblasti isolati.
Incubare la piastra con particelle retrovirali per 24-48 ore in un incubatore per colture cellulari. Quindi sostituire il terreno contenente virus con 500 microlitri di terreno ICM fresco, cambiando il terreno ogni due o tre giorni. Iniziare la selezione positiva delle cellule trasdotte virali integrando il terreno ICM con due microgrammi per millilitro di pur micina.
Dopo tre giorni di selezione, modificare il terreno con una dose di mantenimento di un microgrammo per millilitro di micina pur per visualizzare la conversione dei fibroblasti cardiaci in cardiomiociti. Osservare le piastre selezionate di pura micina per l'espressione della GFP utilizzando un microscopio invertito. Infine, 14 giorni dopo il trattamento virale, sostituire il terreno ICM con B 27.
I loci a cellule battinti spontanee medie possono comparire a tre o quattro settimane dopo l'espressione della trasduzione virale di marcatori cardiaci, tra cui la troponina t e alfa cardiaca. L'actinina può essere rilevata mediante immunochimica dai giorni 10 ai giorni 14. Qui, l'espressione della troponina T cardiaca è osservata nell'I CMS convertito dai fibroblasti, che esprime l'espressione dell'alfa actinina GFP negli ICM.
L'analisi mediante citometria a flusso mostra aumenti simili nell'espressione della troponina T cardiaca, specialmente in seguito alla selezione della micina dei cardiomiociti indotti. La mitologia qui descritta consente una generazione efficiente di cardiomiociti indotti basati sulla somministrazione retrovirale di fattori di trascrizione NGT in un singolo costrutto.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Panoramica
Questo protocollo delinea la generazione di cardiomiociti indotti (iCM) dai fibroblasti cardiaci utilizzando un costrutto policisttronico. Il metodo migliora l'efficienza e la qualità delle cellule riprogrammate, facilitando la ricerca futura nella riprogrammazione degli iCM.
Componenti principali dello studio
Area di scienza
- Biologia cardiovascolare
- Riprogrammazione cellulare
- Ricerca sulle cellule staminali
Sfondo
- I cardiomiociti indotti sono cruciali per gli studi di rigenerazione cardiaca.
- I metodi attuali per generare iCM spesso mancano di efficienza.
- I sistemi di consegna retrovirale possono migliorare la riprogrammazione.
- L'uso di un costrutto policisttronico permette l'espressione simultanea di fattori di trascrizione chiave.
Obiettivo dello studio
- Dimostrare un protocollo efficiente per generare iCM.
- Migliorare la qualità e l'omogeneità delle cellule riprogrammate.
- Facilitare studi meccanici e applicazioni cliniche degli iCM.
Metodi utilizzati
- Consegna mediata da retrovirus di Gata4, Tbx5 e Mef2c.
- Uso di un costrutto policisttronico per l'espressione genica.
- Isolamento di fibroblasti cardiaci da topi neonatali.
- Valutazione dell'efficienza di riprogrammazione e della qualità cellulare.
Risultati principali
- Il protocollo produce una popolazione omogenea di iCM.
- Migliora l'efficienza nella conversione di fibroblasti in cardiomiociti.
- Facilita lo screening ad alto rendimento degli iCM.
- Supporta futuri studi meccanici in biologia cardiaca.
Conclusioni
- Questo metodo rappresenta un significativo avanzamento nella ricerca sugli iCM.
- Fornisce una piattaforma preziosa per ulteriori studi nella rigenerazione cardiaca.
- L'approccio potrebbe portare a migliori applicazioni cliniche nelle malattie cardiache.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Efficient generation of induced cardiomyocytes (iCMs) from cardiac fibroblasts addresses a key bottleneck in cardiac disease modeling and regenerative medicine. By optimizing transcription factor stoichiometry via a single polycistronic construct, this method improves reprogramming efficiency and cellular homogeneity, enabling more reliable mechanistic studies and preclinical screening. The approach supports target validation and lead identification efforts by providing a scalable, reproducible human-relevant disease model.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of cardiac reprogramming mechanisms and functional validation of transcription factor networks.
- Operational Value: Reduces variability in iCM generation, supporting consistent target engagement assays.
- Predictive Value: Improves confidence in phenotypic readouts by increasing the proportion of fully reprogrammed cardiomyocytes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a homogeneous iCM population for quantitative assessment of contractility, marker expression, and drug response.
- Operational Value: Enables high-throughput screening workflows due to improved efficiency and selection compatibility with puromycin.
- Assay Readiness: Supports standardized, reproducible generation of iCMs for downstream functional and imaging-based assays.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates disease modeling by enabling conversion of patient-derived fibroblasts into iCMs for genotype-phenotype correlation.
- Operational Value: Supports longitudinal studies through stable expression of cardiac markers like troponin T and alpha-actinin.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical workflows by providing a scalable source of iCMs for efficacy and toxicity profiling.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis testing in cardiovascular biology and enabling scalable production of iCMs for assay deployment.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking of transcription factor combinations in cardiac reprogramming.
- Screening: Delivers assay-ready iCMs with quantifiable outputs such as troponin T expression and spontaneous beating.
- Analytics: Enables flow cytometry and immunochemistry-based quantification of reprogramming efficiency and maturation.
- Translational Research: Connects to preclinical applications by providing a renewable source of iCMs for drug testing and mechanism of action studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for iCM generation across multiple projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in cardiac phenotypes by reducing incomplete reprogramming.
- Operational Value: Standardizes iCM production through a single-vector system, simplifying workflow and reducing variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality by enhancing the reliability of iCM-based assays.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of cardiac targets through more accurate disease modeling.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cardiac fibroblast isolation, retroviral transduction, and flow cytometry.
- Depends on retroviral production infrastructure and biosafety level 2 compliance.
- Necessitates standardized culture conditions including gelatin-coated plates and FB/ICM media formulations.
- Requires adaptation for human fibroblast sources and validation of transgene silencing in long-term culture.
- Limited by the need for antibiotic selection and potential silencing of retroviral constructs over time.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:57
Generation of Neonatal Mouse Cardiac Fibroblasts via Explant Culture
3:20
Generation of Neonatal Mouse Cardiac Fibroblasts via Enzymatic Digestion
5:02
Isolation of Thy1.2+ Fibroblasts by Magnetic-activated Cell Sorting (MACS)
7:17
Retroviral Mediated Reprogramming of Isolated Cardiac Fibroblasts
8:52
Results: Retroviral Reprogramming of Cardiac Fibroblasts to Induced Cardiac Myocytes
9:38
Conclusion
