Name: Migliorata la generazione di cardiomiociti indotte usando un costrutto policistronico Esprimendo rapporto ottimale di Gata4, MEF2C e Tbx5 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Scopri come generare cardiomiociti indotti da fibroblasti cardiaci utilizzando un costrutto policistronico con Gata4, MEF2C e Tbx5. Questo metodo migliora l'efficienza della riprogrammazione cellulare per la ricerca cardiovascolare.

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Siamo grati per l'assistenza tecnica esperta del nucleo di citometria a flusso UNC e del nucleo di microscopia UNC. Ringraziamo i membri del laboratorio Qian e del laboratorio Liu per le utili discussioni e le revisioni critiche del manoscritto. Questo studio è stato supportato da NIH/NHLBI R00 HL109079 sovvenzione al Dr. Liu e all'American Heart Association (AHA) Scientist Development Grant 13SDG17060010 e alla Ellison Medical Foundation (EMF) New Scholar Grant AG-NS-1064-13 al Dr. Qian.

Il protocollo descritto qui utilizza topi neonati. La cura degli animali e gli esperimenti sono eseguiti in conformità con le linee guida stabilite dalla Divisione di Medicina di Laboratorio animali (àlam) presso l&#39;Università del North Carolina, Chapel Hill. 1. Preparazione di buffer e Media <ol><li> Preparare fibroblasti (FB) mezzo: Supplemento 500 ml supporti IMDM con 100 ml di siero fetale bovino (FBS) e 6 ml di penicillina / streptomicina. </li><li> Preparare ICM medio: Supplemento 400 ml supporti DMEM con 100 ml mezzi M199 e 50 ml di FBS. </li><li> Preparare media B27: Supplemento 490 ml RPMI1640 multimediali con 10 ml B27 media. </li><li> Preparare Plat-E terreno di coltura: Supplemento 500 ml supporti DMEM con 50 ml di FBS, 5 ml di penicillina / streptomicina e 5 ml aminoacidi non essenziali. </li><li> Preparare Plat-E medio trasfezione: Supplemento 500 ml supporti DMEM con 50 ml di FBS e 5 ml aminoacidi non essenziali. </li><li> Prepare gelatina rivestito 24 pozzetti: Aggiungere soluzione di gelatina 0,5 ml di 0,1% ad un pozzo di 24 pozzetti, incubare a 37 ° C per almeno 10 minuti e aspirare a destra prima dell&#39;uso. </li><li> Preparare tampone etichettatura FACS: Supplemento 500 ml DPBS con 10 ml di FBS e 2 ml di EDTA (0,5 M) per raggiungere una concentrazione finale di 2 mm. Passare attraverso un filtro di 0,22 micron e conservare a 4 ° C. </li><li> Preparare MACS ordinamento buffer: Supplemento 500 ml DPBS con 2,5 g BSA e 2 ml di EDTA (0,5 M) per ottenere una concentrazione finale di 2 mM. Passare attraverso un filtro di 0,22 micron e conservare a 4 ° C. </li><li> Preparare tampone HBS 2x per trasfezione: integrare 500 ml di tampone HEPES (50 mM) con 280 mM NaCl (8,1816 g), KCl 10 mM (0,37,275 mila g), 1,5 mM Na 2 HPO 4 (0,10,647 mila g), glucosio 12 mM (1,08,096 mila g ). Aggiungere circa 650 ml NaOH 10 N per aggiustare il pH a 7,05-7,12. Filtrare attraverso un filtro di 0,22 micron pori e conservare a 4 ° C. </li><li> Preparare 2,5 M CaCl 2 soluzione per la trasfezione: Aggiungere 18,376 g CaCl 2 a 50 ml DDH 2 O. Filtrare attraverso un filtro di 0,22 micron pori e conservare a 4 ° C. </li><li> Preparare ICC (immunoistochimica) tampone fissazione: Aggiungere 5 ml di paraformaldeide (PFA, 32%) a 35 ml DPBS per raggiungere una concentrazione finale del 4%. </li><li> Preparare tampone permeabilizzazione ICC: Aggiungere 0,1 ml di Triton a 100 ml DPBS per raggiungere una concentrazione finale di 0,1%. </li><li> Preparare ICC tampone bloccante: Aggiungere 5 g di albumina di siero bovino (BSA) per 100 ml DPBS per raggiungere una concentrazione finale del 5%. </li><li> Preparare tampone colorazione ICC: Aggiungere 1 g BSA a 100 ml DPBS per raggiungere una concentrazione finale di 1%. </li></ol> 2. Generazione di neonatali mouse fibroblasti cardiaci <ol style="margin-left: 40px;"><li> Generare fibroblasti cardiaci dal metodo di coltura espianto <ol><li> Clean neonatale αMHC-GFP topo transgenico (P1 a P2) con il 75% di etanolo. Tagliare la testa con le forbici sterili. Poi fare una incisione orizzontale da sotto un&#39;ascella all&#39;altra. Utilizzare uno sterileforcipe smussato e piegate a sezionare il cuore e collocarlo in un pozzetto della piastra 24 pozzetti contenenti tampone PBS ghiacciata. <ol><li> In alternativa, spremere il cuore dopo l&#39;incisione orizzontale. </li></ol></li><li> Controllare espressione GFP nel cuore al microscopio a fluorescenza. Poiché l&#39;espressione GFP è guidato da αMHC promotore che è un promotore specifico cardiaco, cuore di topo transgenico dovrebbe essere in verde 15, mentre il cuore negativo è scarsa in alcuna fluorescenza. </li><li> Prendere 3-4 GFP cuori positivi in un centro ben piatto di coltura 60 mm e tritateli pezzetti meno di 1 mm 3 dimensioni di forbici sterili e pinze. </li><li> Mettere 3-4 cuori tritato in un piatto 10 centimetri con 2 ml di mezzi FB. Lasciate che i tessuti stabilirsi per 3 ore. </li><li> Lentamente aggiungere 8 ml supporti FB pre-riscaldato per i piatti contenenti tessuti cardiaci. Non disturbare i tessuti per tre giorni. </li><li> Sostituire i media ogni tre giorni. </li><li> Il giorno 7, aspirmangiato il terreno di coltura e lavare le cellule con DPBS. Aggiungere 3 ml 0,05% tripsina per ciascuna piastra e digerire a 37 ° C per 5 min. </li><li> Aggiungere 5 ml supporto FB per placare la tripsina. Staccare delicatamente le cellule con un raschietto cellulare. Pipettare media su e giù per dissociare ulteriormente meccanicamente il tessuto. </li><li> Raccogliere le cellule e filtrare attraverso 40 micron filtri cellulari per evitare la contaminazione dei frammenti di tessuto cardiaco, e poi pellet cellule facendo girare a 200 xg per 5 min. </li><li> Lavare le cellule una volta con MACS tampone e le cellule sono pronte per l&#39;ordinamento. </li></ol></li><li> Generare fibroblasti cardiaci dal metodo di digestione enzimatica <ol><li> Harvest GFP cuori positivi come 2.1.1. Trasferire tutti i cuori in un piatto 10 centimetri con 10 ml di DPBS ghiacciate. </li><li> Spremere ventricoli con pinza sterile per rimuovere il sangue e lavare una volta con DPBS gelide. </li><li> Tagliare i cuori di essere libero di altri tessuti e grasso. </li><li> Tagliare ogni cuore in circa 4 pezzi che sono ancora collegate liberamente. </li><li> Se meno di 20 cuori, trasferire i cuori in un tubo da 15 ml con 8 ml caldo 0,05% tripsina-EDTA, e incubare a 37 ° C per 15 min. <ol><li> Se ci sono 20-30 cuori, trasferire i cuori in una provetta conica da 50 ml con 10 ml caldo 0,05% tripsina-EDTA, e incubare a 37 ° C per 15 min. </li></ol></li><li> Eliminare la tripsina e aggiungere 5 ml (per meno di 20 cuori) o 10 ml (per 20-30 cuori) caldo collagenasi di tipo II (0,5 mg / ml) in HBSS. </li><li> Vortex tubo sul vortex per 1 min a livello velocità intorno 4 a 6 (se il liquido non ottiene fino al coperchio, allora la velocità è bene). </li><li> Incubare la provetta in 37 ° C bagnomaria per 3-5 minuti. </li><li> Vortex la provetta per 1 min. </li><li> Sedimenti per 1 min per gravità fino a che i pezzi di tessuto stabilirsi, raccogliere il liquido in un nuovo tubo contenente 5 ml di medie FB freddo. </li><li> Ripetere i punti 2.2.6-2.2.10 3-5 volte. </li><li> Unire tutte le collezioni filtrando attraverso 40 micron colino cellaper rendere sospensione singola cella. </li><li> Centrifugare a 200 xg per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Risospendere le cellule in 10 ml MACS buffer e centrifugare a 200 xg per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Opzionale: se ci sono un sacco di cellule del sangue, risospendere le cellule con 1 ml di RBC tampone di lisi (150 mm NH 4 Cl, 10 KHCO mm 3, e 0.1 mM EDTA), tenere in ghiaccio per 1 minuto, quindi diluire con 10 ml MACS buffer e centrifugare a 200 xg per 5 min. Lavare una volta con il tampone MACS. </li></ol></li><li> Isolamento di Thy1.2 + fibroblasti da MACS (magnetico attivato separazione delle cellule) <ol><li> Determinare il numero di cellule vitali attraverso tripano colorazione blu. <ol><li> Prendere 10 celle microlitri dalla sospensione cellulare 10 ml al punto 2.2.14. Mescolare con 10 microlitri 0,4% trypan soluzione blu. </li><li> Aggiungere il composto di un emocitometro. Lasciare riposare per 3-5 minuti e poi esaminare immediatamente al microscopio. Le cellule morte vengono colorate in cellule blu e vitali sono senza macchia. </li><li&gt; contare tutte le cellule vitali in quattro piazze 1 millimetro d&#39;angolo del emocitometro. Determinare il numero di cellule vitali: il numero medio per quadrato x 2 (fattore di diluizione) x 10 4 x 10 (volume totale della sospensione cellulare). </li></ol></li><li> Per meno di 1 x 10 7 cellule, risospendere le cellule con 10 microlitri microsfere Thy1.2 in 90 microlitri di buffer MACS refrigerati. Aggiungere più perline proporzionalmente se ci sono più di 1 x 10 7 cellule. Mescolare bene e incubare in frigorifero (2-8 ° C) per 30 min. </li><li> Aggiungere 10 ml MACS tampone e campioni di spin a 200 xg per 5 minuti; lavare una volta con tampone 10 ml MACS e centrifugare di nuovo. </li><li> Portare il volume a 2 ml in tampone MACS. </li><li> Impostare un separatore MACS in cappuccio. Inserire una colonna LS al separatore. Applicare 3 ml MACS Buffer alla colonna di equilibrare esso. </li><li> Passare la sospensione cellulare attraverso la colonna LS equilibrata. </li><li> Lavare 3 volte con 2 ml di buffer MACS ogni volta. </li><li> Prendere colonna LS fuori tlui separatore ed eluire 3 volte con 2 ml MACS tampone in un nuovo tubo da 50 ml. </li><li> Spin a 200 xg per 5 min. </li><li> Risospendere le cellule in 10 ml di FB media, contano le cellule e le sementi in piastre a giusta densità. Per fibroblasti generati dal metodo di coltura espianto, la semina di cellule densità potrebbe essere circa 2-3 x 10 4 cellule / pozzetto di 24 pozzetti. Per fibroblasti generati dal metodo di digestione enzimatica, la densità di cellule potrebbe essere di circa 4-5 x 10 4 cellule / pozzetto di 24 pozzetti. </li></ol></li></ol> 3. Generazione di Retrovirus per ICM Riprogrammazione Nota: Effettuare le seguenti operazioni in un BSL2 Cappa di sicurezza biologica in condizioni sterili. Il corretto smaltimento delle cellule transfettate, puntali e tubi si consiglia di evitare il rischio di rischi ambientali e per la salute. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Mantenere le cellule Plat-E a Plat-E multimediale integrato con 1 mg / ml puromicina e 10 ug / ml blasticidin a 37 ° C con 5% di CO 2. </li><li> Il giorno 2, sostituire il mezzo con Plat-E terreno di coltura privo di puromicina e blasticidin. </li><li> Il giorno 0, dividere le celle Plat-E in 10 cm piatti del giorno prima trasfezione a circa 4-5 x 10 6 cellule per piastra. Le cellule devono essere ~ 80-90% confluenti il ​​giorno della trasfezione. </li><li> Il giorno 1, il cambiamento culturale dei media ai media di trasfezione su cellule entro 1 ora prima della trasfezione. Trasfezione procedimento è il seguente: <ol><li> Trasfezione utilizzando kit commerciali <ol><li> Mescolare 20 ml di reagente di trasfezione (ad esempio Lipofectamine) e 500 microlitri mezzi siero ridotto (ad esempio, Opti-MEM). Aggiungere 10 ug del plasmide retrovirale per altri 500 microlitri ridotte supporti siero. Incubare ogni miscela a temperatura ambiente (RT) per 5 min. </li><li> Aggiungere lentamente il composto plasmide di miscela di trasfezione. Questo passaggio potrebbe richiedere 15-30 secondi. Incubare la miscela per 20 minuti a temperatura ambiente (soluzione può apparire torbida). </li&gt; <li> Aggiungete il composto goccia a goccia per le cellule. </li><li> Incubare per una notte in un incubatore a 37 °. </li></ol></li><li> Trasfezione con fosfato di calcio. <ol><li> Mescolare 40 ml 2.5 M CaCl 2 e 440 ml DDH 2 O, quindi aggiungere 20 mg del plasmide retrovirale (regolare la quantità di DDH 2 O in modo che il volume totale è di 500 microlitri). </li><li> Aggiungere 500 microlitri 2x HBS in una provetta da 15 ml. </li><li> Vortex la HBS e nel frattempo aggiungere la miscela Calcio-DNA alla HBS cadere saggio. Questa fase dura circa 30 secondi per ogni campione. Quindi al massimo fare 3-4 campioni contemporaneamente. </li><li> Incubare a temperatura ambiente per 3 minuti di incubazione per più tempo porta a grandi precipitato e meno cellule assumerà il precipitato. </li><li> Aggiungere il composto cadere saggio alle cellule e osservare sotto 20X microscopio. Precipitati fini (un sacco di piccoli sono buone, ma pochi grandi non sono buone) dovrebbe essere visto. </li><li> Incubare una notte a 37 ° C incubatore. </li&gt; </ol></li></ol></li><li> Il giorno 2, cambiare media su cellule con 8 ml preriscaldata coltura. Incubare per 24 ore. </li><li> Il giorno 3 e il giorno 4, raccogliere coltura supernatante dai piatti utilizzando una siringa monouso 10 ml sterile, filtrandola attraverso un filtro di acetato di cellulosa dimensioni 0,45 micron pori, e il trasferimento in un tubo da 50 ml. Aggiungere 2 ml di soluzione retrovirus precipitazioni per ogni 8 ml contenente il virus surnatante. Mescolare delicatamente e incubare una notte a 4 ° C. </li><li> Il giorno 5, girare la miscela virale a 1.500 xg a 4 ° C per 30 min. Le particelle virali dovrebbero apparire in pellet bianco sul fondo della provetta. </li><li> Scartare il surnatante. Spin down soluzione residua mediante centrifugazione a 1500 xg per 5 min. Eliminare tutte le tracce di liquido per aspirazione, facendo molta attenzione a non disturbare le particelle retrovirali precipitati in pellet. </li><li> Risospendere pellet retrovirali con 100 microlitri di buffer DPBS per ogni 8 ml surnatante virale. Aliquotail virus su ghiaccio. Utilizzare immediatamente o conservare a -80 ° C. </li></ol> 4. La riprogrammazione dei fibroblasti cardiaci <ol><li> Aggiungere 4 ml di 10 mg / ml soluzione polibrene nel Icm medio di 10 ml, e mescolare delicatamente pipettando su e giù. La concentrazione finale di polibrene è 4 mg / ml. </li><li> Aggiungere 500 microlitri mezzi ICM contenente polibrene a ciascun pozzetto di 24 pozzetti seminato con fibroblasti. </li><li> Aggiungere 10 microlitri retrovirus a ciascun pozzetto contenente sia 2-3 x 10 4 cellule della cultura espianto o 4-5 x 10 4 cellule da metodo digestione enzimatica. La quantità di virus deve essere aumentato proporzionalmente con l&#39;aumento del numero di cellule in diverse piastre di coltura o piatti. Mettere la piastra a 37 ° C per 24-48 hr incubatore per consentire l&#39;infezione virale. La linea di tempo per la riprogrammazione cardiaca è mostrato in Figura 1. </li><li> Dopo trasduzione virale, sostituire il virus contenente media con 500 microlitri mezzi regolare ICM. </li><li> Modificare i media ogni 2-3 giorni. Per la selezione positiva delle cellule trasdotte virali, aggiungere media ICM integrato con puromicina a 2 mg / ml alle cellule bersaglio. Keep it per tre giorni. Dopo di che, mantenere puromicina nel mezzo ICM alla concentrazione di 1 mg / ml. </li><li> Tre giorni dopo l&#39;infezione virale, prendere la targa fuori dalla incubatrice e posizionarlo sotto un microscopio a fluorescenza invertito (20X) per osservare l&#39;espressione della GFP. Nota: Dieci giorni dopo l&#39;infezione virale, le cellule possono essere raccolte per l&#39;analisi FACS e analisi ICC per determinare l&#39;efficienza riprogrammazione (nel passaggio 5 e 6). </li><li> Quattordici giorni dopo l&#39;infezione virale, sostituire ICM media con i media B27. Modificare i media ogni tre giorni. Spontaneo pestaggio loci cella può apparire da tre (cellule da metodo di digestione enzimatica) o quattro (cellule da espianto metodo cultura) settimane dopo la trasduzione virale. </li></ol> 5. Analisi immunocitochimica di efficienza Riprogrammazione <ol><li> Cellule risciacquocon ghiaccio PBS freddo per tre volte; rimuovere la soluzione in eccesso. </li><li> Aggiungere 0,5 ml di tampone di fissaggio ICC a ciascun pozzetto di piastre da 24 pozzetti. Fissare le cellule a temperatura ambiente per 15-20 minuti. </li><li> Risciacquare le cellule con PBS per tre volte. </li><li> Aggiungere 0,5 ml di buffer permeabilizzazione ICC a ciascun pozzetto di piastre da 24 pozzetti. Permeabilize le cellule a temperatura ambiente per 15 min. </li><li> Risciacquare le cellule con PBS per tre volte. </li><li> Aggiungere 0,5 ml ICC tampone di bloccaggio in ciascun pozzetto di 24 pozzetti, incubare a temperatura ambiente per 1 ora. </li><li> Anticorpi primari diluiti con tampone colorazione ICC. Aggiungere 200 ml di soluzioni di anticorpi a ogni pozzetto e incubare una notte a 4 ° C. I fattori di diluizione anticorpo sono elencati in Materiali. </li><li> Il giorno dopo, lavare le cellule con PBS per tre volte. </li><li> Aggiungere 200 microlitri di soluzioni di anticorpi secondari alle cellule e incubare per 1 ora a RT nel buio. </li><li> Lavare le cellule con PBS per tre volte. </li><li> Aggiungere 150 ml soluzione contenente DAPI in ogni pozzetto di montaggio. Lasciare macchia nuclei per 1 min. Poicoprire ogni pozzetto con copertura in vetro rotondo slittamento e premere delicatamente la polizza contro la superficie inferiore con una pinza per rimuovere le bolle d&#39;aria. </li><li> Aspirare la soluzione in eccesso ed i campioni sono pronti per l&#39;imaging. Le immagini rappresentative che mostrano le cellule riprogrammate che esprimono marcatore cardiaco cTnT e αActinin a d14 sono mostrati in figura 2B. </li></ol> 6. Analisi FACS di Riprogrammazione Efficienza <ol><li> Lavare accuratamente le cellule una volta con DPBS. Aggiungere 0,3 ml di tripsina (0,05%) a ciascun pozzetto e incubare a 37 ° C per 5 min. </li><li> Battere delicatamente la piastra per facilitare il sollevamento delle cellule. Controllare il distacco delle cellule sotto il microscopio. Aggiungere 1 ml di FACS tampone di quando la maggior parte delle cellule sono dissociate. Pipetta su e giù per dissociare ulteriormente meccanicamente le cellule. </li><li> Trasferire le cellule nella piastra 24 pozzetti ad una piastra ben pozzo profondo 96 pozzo a pozzo. Spin a 200 xg per 5 minuti a 4 ° C per raccogliere le cellule. </li><li> Lavare le cellule una volta conBuffer di FACS. </li><li> Aggiungere 100 ml di soluzioni di fissaggio / permeabilizzazione per risospendere le cellule per 20 minuti a 4 ° C. </li><li> Lavare le cellule due volte con soluzione di lavaggio 1x, pellet, e rimuovere il surnatante. </li><li> Preparare la soluzione anticorpo primario contro GFP e cTnT in tampone di lavaggio 1x. Risospendere accuratamente ciascun campione con soluzione di anticorpi 50 microlitri e incubare a 4 ° C per 30 min. </li><li> Lavare le cellule una volta nella soluzione di lavaggio 1x, pellet, e rimuovere il surnatante. </li><li> Aggiungere 50 ml soluzione di anticorpo secondario contenente Alexa Fluor IgG anti-coniglio 488 asino coniugato e Alexa Fluor 647 asino coniugato anti-topo IgG per ogni campione. Incubare a 4 ° C per 30 minuti in scuro. </li><li> Lavare le cellule una volta nella soluzione di lavaggio 1x, pellet, e rimuovere il surnatante. </li><li> Risospendere le cellule in 400 microlitri di buffer di fissazione (DPBS con 1% PFA). Trasferimento delle cellule in provetta FACS con tappo colino cella. I campioni sono pronti per il rilevamento di FACS. Il rappresentante analisi FACS di riprogrammazione efficiency utilizzando pMxs-puromicina-MGT costrutto con o senza selezione puromicina è mostrato in Figura 2A. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Per il successo generazione ICM quando si utilizza questo protocollo, ci sono diversi fattori importanti che hanno un impatto sull&#39;efficienza complessiva. In particolare le condizioni di fibroblasti di partenza e la qualità di codifica retrovirus MGT possono influenzare notevolmente l&#39;efficienza riprogrammazione. È importante generare fibroblasti fresco e sano possibile. Per espianto metodo di coltura, i fibroblasti possono essere utilizzati prima di sette giorni dopo gli espianti so...

Le malattie cardiovascolari rimangono la principale causa di morte in tutto il mondo, con 17,3 milioni di decessi all'anno1. La perdita di cardiomiociti dovuta a infarto del miocardio o insufficienza cardiaca progressiva è una delle principali cause di morbilità e mortalità2. A causa della limitata capacità rigenerativa, i cuori dei mammiferi adulti di solito soffrono di compromissione della funzione di pompa e insufficienza cardiaca a seguito di lesioni3-6. Pertanto, l'efficiente (ri)generazione di cardiomiociti in vivo e in vitro per il trattamento delle malattie cardiache e per la modellizzazione delle malattie è una questione critica che deve essere affrontata.
Il recente sviluppo della riprogrammazione diretta, che riprogramma direttamente le cellule da un fenotipo differenziato all'altro senza passare attraverso lo stato pluripotente, offre un promettente approccio alternativo per la medicina rigenerativa. Il cuore dei mammiferi contiene abbondanti fibroblasti cardiaci (FC), che rappresentano circa la metà delle cellule del cuore e proliferano massicciamente dopo la lesione7-9. Pertanto, il vasto pool di FC potrebbe fungere da fonte endogena di nuovi CM per la terapia rigenerativa se potessero essere riprogrammati direttamente in CM funzionali. È stato dimostrato che una combinazione di fattori di trascrizione, come Gata4 (G), Mef2c (M) e Tbx5 (T), con o senza microRNA o piccole molecole può riprogrammare i fibroblasti in iCM10-26. È importante sottolineare che questa conversione può essere indotta anche in vivo e si traduce in un miglioramento della funzione cardiaca e in una riduzione delle dimensioni della cicatrice in un cuore infartuato16,27-29. Questi studi indicano che la riprogrammazione cardiaca diretta può essere una potenziale strada per guarire un cuore ferito. Tuttavia, la bassa efficienza della riprogrammazione iCM è diventata un ostacolo importante per ulteriori studi meccanicistici. Inoltre, la riproducibilità della riprogrammazione cardiaca è un'altra questione controversa di questa tecnologia11,30,31. 
Molto recentemente, abbiamo generato un set completo di costrutti policistronici che codificano G,M,T in tutti i possibili ordini di splicing con sequenze 2A identiche in un singolo mRNA. Questi costrutti policistronici hanno prodotto vari livelli di espressione delle proteine G, M e T, che hanno portato a un'efficienza di riprogrammazione significativamente diversa25. Il costrutto più efficiente, denominato MGT, che mostrava un'espressione relativamente alta di Mef2c e una bassa espressione di Gata4 e Tbx5, ha migliorato significativamente l'efficienza di riprogrammazione e ha prodotto grandi quantità di iCM con espressione di marcatori CM, robusta oscillazione del calcio e battito spontaneo25. Inoltre, utilizzando il costrutto policistronico MGT, il nostro studio ha evitato l'uso di vettori multipli e ha generato cellule con rapporto di espressione omogeneo di G,M,T, fornendo così una piattaforma migliorata per la ricerca sulla riprogrammazione cardiaca. Per aumentare la riproducibilità sperimentale, qui descriviamo in dettaglio come isolare i fibroblasti, produrre cassette MGT trasportatrici di retrovirus, generare iCM e valutare l'efficienza della riprogrammazione.

<table><tbody><tr><td>anti-troponina cardiaca T</td><td>Thermo Scientific</td><td>MS-295-PO</td><td>1:200 per FACS e 1:400 per ICC</td></tr><tr><td>anti-GFP</td><td>Life Technologies</td><td>A11122</td><td>1:500 sia per FACS che per ICC</td></tr><tr><td>anti-aActinin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7811</td><td>1:500 sia per FACS che per ICC</td></tr><tr><td>anti-Connexin43</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6219</td><td>1:500 per&nbsp; ICC</td></tr><tr><td>anit-Mef2c</td><td>Abcam</td><td>ab64644</td><td>1:1.000 per ICC&nbsp;</td></tr><tr><td>anti-Gata4</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-1237 1</td><td>:200 per ICC</td></tr><tr><td>anti-Tbx5</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-17866</td><td>1:200 per ICC</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488&ndash; asino coniugato anti-coniglio IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch Inc</td><td>711-545-152</td><td>1:500 sia per FACS che per ICC</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647... asino coniugato anti-topo IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch Inc</td><td>715-605-150</td><td>1:500 sia per FACS che per ICC</td></tr><tr><td>Kit Cytofix/Cytoperm per colorazione intracellulare</td><td>BD Biosciences</td><td>554722</td><td></td></tr><tr><td>Rhod-3 Calcium Imaging Kit</td><td>Life Technologies</td><td>R10145</td><td></td></tr><tr><td>Thy1.2 microsfere</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-049-101</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione Vectashield con DAPI</td><td>Vector labs</td><td>H-1500</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-2442</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,05%)</td><td>Corning</td><td>25-052</td><td></td></tr><tr><td>PRMI1640 medium</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplemento</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Life Technologies</td><td>12440-053</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM Siero ridotto</td><td>Medium Life Technologies</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>M199 Medium</td><td>Life Technologies</td><td>10-060</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, alto glucosio</td><td>Life Technologies</td><td>10-013</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-streptomicina</td><td>Corning</td><td>30-002</td><td></td></tr><tr><td>Aminoacidi non essenziali</td><td>Life Technologies</td><td>11130-050</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Life Technologies</td><td>11668500</td><td></td></tr><tr><td>blasticidina</td><td>Life Technologies</td><td>A11139-03</td><td></td></tr><tr><td>puromicina</td><td>Life Technologies</td><td>A11138-03</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi II</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>polibrene</td><td>Millipore</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PX1405</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6152</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Fisher</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldeide</td><td>EMS</td><td>15714</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di precipitazione del retrovirus</td><td>ALSTEM</td><td>VC-200</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di blu di tripano allo 0,4%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>gelatina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1393</td><td></td></tr><tr><td>PBS di Dulbecco senza CaCl2 e MgCl2 (D-PBS, 1x)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (soluzione salina bilanciata Hanks)</td><td>Corning</td><td>21022</td><td></td></tr><tr><td>LS colonna</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>0,45 &mu; m filtro in acetato di cellulosa&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>190-2545</td><td></td></tr><tr><td>piastre a 24 pozzetti</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>piastre per coltura tissutale da 10 cm&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>172958</td> Piatto di coltura a pozzetto centrale da <td></td></tr><tr><td>60 mm&nbsp; &nbsp;</td><td>Corning</td><td>3260</td><td></td></tr><tr><td>96 Well Clear V-Bottom 2 ml Piastra a pozzetti profondi in polipropilene</td><td>Denville Scientific</td><td>P9639</td><td></td></tr><tr><td>Provette a fondo tondo in polistirene con tappo per filtro cellulare.</td><td>BD Biosciences</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Vortexer MINI</td><td>VWR</td><td>58816-121</td><td></td></tr><tr><td>EVOS FL Sistema di imaging cellulare automatico</td><td>Tecnologie di vita</td><td>AMAFD1000</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Separatore MidiMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>Vetrino coprioggetto rotondo</td> in <td>microscopia elettronica Scienze</td><td>72195-15</td><td></td></tr></tbody></table>

migliorata la generazione di cardiomiociti indotte usando un costrutto policistronico esprimendo rapporto ottimale di gata4, mef2c e tbx5

Improved Generation of Induced Cardiomyocytes Using a Polycistronic Construct Expressing Optimal Ratio of Gata4, Mef2c and Tbx5

La conversione diretta dei fibroblasti cardiaci (CFS) in cardiomiociti indotte (ICMS) ha un grande potenziale per la medicina rigenerativa, offrendo strategie alternative per il trattamento di malattie cardiache. Questa conversione è stato ottenuto mediante espressione forzata di fattori definiti come Gata4 (G), MEF2C (M) e Tbx5 (T). Tradizionalmente, ICMS sono generati da un cocktail di virus che esprimono questi singoli fattori. Tuttavia, riprogrammazione efficienza è relativamente basso e la maggior parte in vitro G, M, T-trasdotte fibroblasti non diventano completamente riprogrammati, rendendo difficile lo studio dei meccanismi di riprogrammazione. Abbiamo recentemente dimostrato che la stechiometria di G, M, T è fondamentale per un&#39;efficiente riprogrammazione ICM. Un stechiometria ottimale di G, M, T ad alto livello relativo di M e bassi livelli di G e T ottenuti utilizzando il nostro vettore MGT policistronico (di seguito denominato MGT) significativamente maggiore efficienza riprogrammazione e una migliore qualità Icm in vitro. Qui forniamo una descrizione dettagliata della metodologia utilizzata per generare ICMS con MGT costrutto da fibroblasti cardiaci. Isolamento di fibroblasti cardiaci, la generazione di virus per la riprogrammazione e la valutazione del processo di riprogrammazione sono inclusi anche di fornire una piattaforma per la generazione efficiente e riproducibile di ICMS.

Le fasi di riprogrammazione sono riassunti da schema in figura 1. Dopo MGT trasduzione, l&#39;espressione della GFP in riprogrammazione delle cellule potrebbe essere rilevato fin dal giorno 3. puromicina selezione di cellule trasdotte parte da giorno 3 e viene mantenuta durante le prime due settimane se PMX-puro è usato costrutto -MGT. Di giorno 10 al giorno 14, espressione di marcatori cardiaci come cTnT e αActinin potrebbe essere rilevato da entrambi ICC (Figura 2B, punto 5) e FACS <s...

Descriviamo qui un protocollo per la generazione di iCM utilizzando la somministrazione mediata da retrovirus di Gata4, Tbx5 e Mef2c in un costrutto policistico. Questo protocollo produce una popolazione relativamente omogenea di cellule riprogrammate con una migliore efficienza e qualità ed è prezioso per studi futuri sulla riprogrammazione di iCM.

Migliorata la generazione di cardiomiociti indotte usando un costrutto policistronico Esprimendo rapporto ottimale di Gata4, MEF2C e Tbx5

Direct conversion of cardiac fibroblasts (CFs) into induced cardiomyocytes (iCMs) holds great potential for regenerative medicine by offering alternative ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è dimostrare come generare in modo efficiente cardiomiociti indotti a partire da fibroblasti cardiaci mediante un costrutto retrovirale polycytonic MGT, che esprime un rapporto ottimale di GATA4, F2C e TBX5. Questo metodo fornisce una piattaforma preziosa per la ricerca sui cardiomiociti indotti e faciliterà analisi ad alto rendimento e studi meccanicistici sulla programmazione dei cardiomiociti indotti, contribuendo al contempo a portare il campo verso applicazioni cliniche. Il principale vantaggio di questa tecnica è che, utilizzando un singolo costrutto retrovirale, i fibroblasti cardiaci possono essere convertiti in modo efficiente in cardiomiociti.Pulire il topo transgenico neonatale con GFP nell'alpha myosin heavy chain con etanolo al 75% vol/vol. Eseguire l'eutanasia. Quindi aprire la cavità corporea praticando un'incisione orizzontale da sotto un'ascella all'altra utilizzando pinze sterili, smussate e ricurve.Dissezionare il cuore e posizionarlo in una pozzetta di una piastra a 24 pozzette contenente ghiaccio. Aggiungere PBS freddo ed osservare l'espressione di GFP in tutto il cuore mediante microscopia a fluorescenza. Prendere da tre a quattro cuori positivi per GFP e trasferirli in una piastra per colture con pozzetta centrale da 60 millimetri utilizzando pinze e forbici sterili; quindi tritare i cuori in piccoli pezzi di dimensioni inferiori a un millimetro cubo.Trasferire i cuori tritati in una piastra da 10 centimetri e coprirli con due millilitri di mezzo fiberblast o FB. Lasciare le piastre indisturbate per almeno tre ore in un incubatore a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, aggiungere lentamente otto millilitri di mezzo FB preriscaldato alla piastra contenente il tessuto cardiaco tritato.Quindi incubare il tessuto senza disturbarlo, tranne per il cambio del mezzo ogni tre giorni. Al settimo giorno, aspirare il mezzo di coltura e lavare le cellule con DPBS. Aggiungere tre millilitri di tripsina 0,05% in EDTA in ogni piastra e incubare a 37 gradi Celsius per cinque minuti.Aggiungere cinque millilitri di mezzo FB per inattivare la tripsina, quindi staccare delicatamente le cellule con uno scraper cellulare. Successivamente, raccogliere le cellule e filtrarle attraverso filtri cellulari da 40 micron per evitare contaminazioni con frammenti di tessuto cardiaco. Pellettare le cellule mediante centrifugazione a 200 × g per cinque minuti, a partire da cuori di topo neonato isolati.Tagliare ogni cuore in quattro pezzi ancora debolmente connessi. Trasferire i cuori in un tubo conico da 15 millilitri contenente otto millilitri di tripsina EDTA 0,05% calda e incubare a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Al termine dell'incubazione, scartare la tripsina EDTA e aggiungere cinque millilitri di collaghenasi di tipo due calda; vortexare per un minuto a velocità media, quindi incubare il tubo in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per tre-cinque minuti.Quindi vortexare nuovamente il tubo per un minuto. Lasciare sedimentare i pezzi di tessuto e raccogliere il soprannatante in un nuovo tubo contenente cinque millilitri di mezzo FB freddo. Aggiungere cinque millilitri di collaghenasi di tipo due fresca ai pezzi di tessuto e ripetere i passaggi di vortex e incubazione.Combinare tutti i supernatanti contenenti le cellule filtrandoli attraverso un filtro cellulare da 40 micron. Centrifugare queste cellule a 200 × g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Successivamente a uno dei due metodi di isolamento dei fibroblasti cardiaci.Lavare il pellet cellulare finale una volta con 10 millilitri di tampone per il sorting cellulare attivato magneticamente o tampone max. Rimuovere 10 microlitri per il conteggio delle cellule vitali e centrifugare le cellule rimanenti a 200 ×g per cinque minuti a quattro gradi Celsius, per meno di una volta 10 alla settima cellule. Risospendere il pellet cellulare con 10 microlitri di microsferette magnetiche coniugate con thigh 1.2 in 90 microlitri di tampone max freddo e mescolare.Incubare bene le perle a quattro gradi Celsius per 30 minuti. Per ottenere il pellet cellulare, aggiungere 10 millilitri di buffer max e centrifugare i campioni a 200 ×g per cinque minuti. Lavare una volta con 10 millilitri di buffer max e risospendere il pellet cellulare in un volume totale di due millilitri in una cappa da coltura cellulare.Impostare un separatore max e aggiungere una colonna LS. Equilibrare la colonna con tre millilitri di buffer max. Far passare la sospensione cellulare attraverso la colonna LS e lavare tre volte con due millilitri di buffer max.Quindi rimuovere la colonna LS dal separatore ed eluire tre volte con due millilitri di buffer max. Raccogliere l'EIT in un tubo conico da 50 millilitri. Centrifugare l'EIT a 200 × g per cinque minuti.Risospendere i fibroblasti isolati in 10 millilitri di mezzo FB e contare le cellule; seminare le cellule in piastre per coltura tissutale a densità appropriate in una piastra da 24 pozzetti pre-ricoperta di gelatina per riprogrammare i fibroblasti cardiaci. Aggiungere 500 microlitri di mezzo di cardiomiociti indotti o mezzo ICM contenente poli-cervello in ciascun pozzetto della piastra da 24 pozzetti seminata con cellule. Aggiungere 10 microlitri del retrovirus in ciascun pozzetto contenente fibroblasti isolati.Incubare la piastra con le particelle retrovirali per 24-48 ore in un incubatore per colture cellulari. Sostituire quindi il mezzo contenente il virus con 500 microlitri di mezzo ICM fresco, cambiando il mezzo ogni due o tre giorni. Iniziare la selezione positiva delle cellule transdotte con il virus aggiungendo al mezzo ICM due microgrammi per millilitro di puromicina.Dopo tre giorni di selezione, sostituire il mezzo con una dose di mantenimento di un microgrammo per millilitro di puromicina per visualizzare la conversione dei fibroblasti cardiaci in cardiomiociti. Osservare le piastre selezionate con puromicina per l'espressione di GFP utilizzando un microscopio invertito. Infine, 14 giorni dopo il trattamento virale, sostituire il mezzo ICM con B 27.Piccoli focolai di cellule con battito spontaneo possono apparire da tre a quattro settimane dopo la trasduzione virale, con espressione di marcatori cardiaci, tra cui la troponina cardiaca T e l'alfa-actinina. L'alfa-actinina può essere rilevata mediante immunoistochimica tra il giorno 10 e il 14. Qui viene mostrata l'espressione della troponina cardiaca T nei miocardiociti indotti ottenuti da fibroblasti, che esprimono GFP; l'espressione dell'alfa-actinina nei miocardiociti indotti è visibile in questa immagine.L'analisi mediante citometria a flusso mostra aumenti simili nell'espressione della troponina T cardiaca, in particolare dopo la selezione con puromicina dei cardiomiociti indotti. La metodologia descritta consente una generazione efficiente di cardiomiociti indotti basata sulla somministrazione retrovirale di fattori trascrizionali NGT in un singolo costrutto.

improved-generation-induced-cardiomyocytes-using-polycistronic

Research

Ricerca

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Abbiamo stabilito un protocollo per l'induzione della cardioblasts pluripotenti direttamente da cellule staminali embrionali umane conservati in condizioni definite con piccole molecole, che permette la derivazione di una grande quantità di risorse umane progenitori cardiaci e funzionale cardiomiociti per la riparazione cardiovascolare.

Derivazione efficiente dei diritti dell&#39;uomo e precursori cardiaci e cardiomiociti pluripotenti da cellule staminali embrionali umane con induzione piccole molecole

La generazione di allineato tessuto miocardico è un requisito fondamentale per adattare i recenti progressi nel campo della biologia delle cellule staminali a fini clinicamente utili. Qui si descrive un metodo di stampa per microcontatto il controllo preciso di forma e funzione cellulare. Utilizzo di popolazioni altamente purificate di cellule staminali embrionali derivate progenitori cardiaci, abbiamo quindi generare anisotropo tessuto funzionale del miocardio.

Generazione di Allineati tessuto funzionale del miocardio attraverso la stampa microcontatto

Le cellule staminali pluripotenti, sia staminali (iPS), le cellule embrionali pluripotenti o indotto, costituiscono una preziosa fonte di cellule differenziate umani, tra cardiomiociti. Qui, ci si concentrerà sulla induzione cardiaco di cellule iPS, che mostra come usarli per ottenere cardiomiociti umani funzionali attraverso un protocollo embryoid corpi-based.

Generazione di cardiomiociti umani: Un protocollo di differenziazione da alimentatore-Free umani cellule staminali pluripotenti indotte

Questo protocollo descrive come produrre funzionale del seno tessuto nodale da cellule murine staminali pluripotenti (PSC). T-box3 (TBX3) sovraespressione più cardiaca miosina pesante catena (MYH6) selezione antibiotica promoter porta a aggregati altamente puri di cellule pacemaker. Questi "indotte-seno-atriale-corpi" ("iSABs") contengono più di 80% di cellule pacemaker, mostrano fortemente aumentato i tassi di battere e sono in grado di camminare miocardio ex vivo.

Generazione di Murine Cardiac pacemaker aggregati di cellule Sulla base ES-Cell-programmazione in combinazione con MYH6-Promoter-Selection

Questo manoscritto descrive un protocollo passo-passo per la generazione e la quantificazione di diversi sottotipi cardiaci riprogrammati utilizzando una somministrazione mediata da retrovirus di Gata4, Hand2, Mef2c e Tbx5.

Valutare cardiomiociti sottotipi A seguito di riprogrammazione Fattore di trascrizione-mediata di fibroblasti embrionali di topo

Qui presentiamo un metodo affidabile per riprogrammare i fibroblasti embrionali primari in cardiomiociti funzionali tramite sovraespressione di GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 e miR-133 (GHMT2m) al fianco di inibizione di segnalazione di TGF-β. Il nostro protocollo genera pestaggio cardiomyocytes fin dal post-traduzionali di 7 giorni con fino a 60% efficienza.

Soppressione della segnalazione Pro-fibrotici rafforza fattore-mediata riprogrammazione di fibroblasti embrionali di topo in cardiomiociti indotti

Qui descriviamo un metodo scalabile, usando una semplice combinazione di activina A e Id1-sovraespressione di lentivirus-mediata, per generare il primo cuore campo-come progenitori cardiaci e ventricolare-come cardiomiociti da cellule staminali pluripotenti umane.

Generazione del primo cuore campo-come progenitori cardiaci e ventricolare-come cardiomiociti da cellule staminali pluripotenti umane

Qui presentiamo un protocollo per la formazione di una popolazione delle cellule usando stimoli elettrici e meccanici, emulando la fisiologia cardiaca. Questa stimolazione elettromeccanica migliora il potenziale di cardiomiogenici delle cellule trattate ed è una strategia promettente per ulteriore terapia cellulare, la modellazione di malattia e lo screening di stupefacenti.

Simultanea stimolazione elettrica e meccanica per migliorare il potenziale di cardiomiogenici delle cellule

Lo scopo di questo metodo è quello di generare cellule progenitrici cardiache specifiche del campo cardiaco del campo cardiaco in vitro al fine di studiare le specifiche delle cellule progenitrici e le proprietà funzionali, e di generare cellule cardiache specifiche della camera per la modellazione delle malattie cardiache.

Generazione in vitro di cellule progenitrici cardiache specifiche del campo del cuore del mouse

Descriviamo qui, l'istituzione e l'applicazione di una linea di reporter del mouse Tg (Myh6-cre) 1Jmk / J / Gt (ROSA) 26Sortm38 (CAG-GCaMP3) Hze / J (indicata come αMHC-Cre / Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 di seguito) per la valutazione della riprogrammazione cardiaca. I fibroblasti cardiaci neonatali (NCF) isolati dal ceppo murino vengono convertiti in cardiomiociti indotti (iCM), consentendo una valutazione comoda ed efficiente dell'efficienza di riprogrammazione e della maturazione funzionale...

Valutazione in vitro della riprogrammazione cardiaca mediante misurazione del flusso di calcio specifico cardiaco con un GCaMP3 Reporter

Questo protocollo presenta un quadro metodologico dettagliato per la transgenesi basata sull'elettroporazione di cellule cardiache in cuori di topo in via di sviluppo. Le risorse video fornite qui faciliteranno l'apprendimento di questa tecnica versatile.

Un approccio efficiente alla transgenesi per la consegna genica nel cuore embrionale di topo

Scopri come generare cardiomiociti indotti da fibroblasti cardiaci utilizzando un costrutto policistronico con Gata4, MEF2C e Tbx5. Questo metodo migliora l'efficienza della riprogrammazione cellulare per la ricerca cardiovascolare.

Migliorata la generazione di cardiomiociti indotte usando un costrutto policistronico Esprimendo rapporto ottimale di Gata4, MEF2C e Tbx5 (Video) | JoVE Journal

Migliorata la generazione di cardiomiociti indotte usando un costrutto policistronico Esprimendo rapporto ottimale di Gata4, MEF2C e Tbx5

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